组织型纤溶酶原激活剂(TPA)

一、产品概述 TPA是由人的血管内皮细胞产生的527个氨基酸序列组成的糖蛋白,其分子量为3万多至7万。它具有称之为索眼的结构,对构成血栓的纤维蛋白有亲和性。 血栓是血管内产生的血块,血栓一旦产生,身体末端的微细血管堵塞,导致手脚麻痹、脑梗塞、心肌梗塞等病症。     

抗组织型纤溶酶原激活剂(tPA)单克隆抗体的制备和鉴定

用从人黑色素瘤细胞培液中提纯的tPA为抗原,通过杂交瘤技术获得TA₁,TA₂、TA₃和TA₄ 4株阳性杂交瘤细胞。经葡萄球菌A蛋白(SPA)亲和层析纯化抗tPA单克隆抗体(tPA．McAb)。固相酶联免疫吸附测定(ELISA)诱生含McAb的小鼠腹水,其效价达I：1O⁵。这些tPA McAb均属IgG₁亚型,特异地作用于tPA(包括基因工程生产的rtPA),与尿激酶(uK)无反应。用底物显色法测定表明所有tPA McAb均可抑制tPA的活性。     

人组织型纤溶酶原激活剂突变体微小基因的构建

tPA基因全长约36kb,至少由13个内含子分隔为14个外显子。根据tPA的第一、二外显子的编码情况,考虑建立从第二至第六外显子序列在内的tPA微小基因。即将tPA的部分基因组序列与LAtPA cDNA的序列在第六外显子的NarI位点处相连。     

重组人组织型纤溶酶原激活剂(rht-PA)及其突变体的纯化

稳定高效表达重组人组织型纤溶酶原激活剂 (rht PA)的CHO细胞株和表达组合突变体的细胞株进行了 3L转瓶培养 .将培养上清分别进行了Lys Sepharose 4B亲和层析和Zn2 + Sepharose 4B层析两步纯化 ,rht PA纯度提高了 5 34倍 ,比活达 2 5× 10 5IU mg ,产率为 73% ;突变体纯度提高了1119倍 ,比活达 5 9× 10 5IU mg ,产率为 6 9% .纯化产物SDS PAGE分析显示 ,rht PA和突变体基本都呈单一条带 ,扫描分析均达到 98%以上纯度 .rht PA和突变体在纯化系统中的行为作对照分析发现 ,突变体的构建思想在Lys Sepharose 4B亲和层析过程中有充分体现 .这两步层析组合是很好的纯化t PA及其突变体的方法 ,尤其是Lys Sepharose 4B纯化突变体效果更好     

组织型纤溶酶原激活剂的纯化制备

简述了用于大规模生产组织型纤溶酶原激活剂(tPA)的重组动物细胞及其培养工艺。从重组tPA的大规模、快速纯化的角度考虑,对tPA的纯化制备方法进行了简要评述。     

组织型纤溶酶原激活剂cDNA的克隆

组织型纤溶酶原激活剂(tissue type plas-minogen activator,tPA)是一个由527个氨基酸残基组成的蛋白质,分子质量约69ku。 tPA是一种丝氨酸蛋白水解酶,在纤维蛋白存在的条件下,可使血浆纤溶酶原转变为纤溶酶;如果没有纤维蛋白的存在,它使纤溶酶原转变为纤溶酶的能力有限。当静脉给予药理剂量的tPA时,它与血栓处的纤维蛋白结合,同时把捕捉的纤溶酶原转变为纤溶酶,使纤维蛋白的溶解在血栓处发生,而并非全身性。这样可以减少全身性出血副作用,这也更是tPA优于尿激酶和链激酶之处。tPA临床上主要用于治疗血栓性疾病,如急性心肌梗塞,肺栓塞,视网     

第二代组织纤溶酶原激活剂

组织纤溶酶原激活剂(t-PA)被誉为本世纪最令人嘱目、最有前途的血栓溶解剂。自1983年Pennica首先在大肠杆菌中成功地克隆并表达t-PA基因以来,这种血栓溶解剂的研究一日千里,迅速成为美国及世界其他各国生物工程公司的重点研究项目。     

肌注组织型纤溶酶原激活剂基因在小鼠体内表达

组织型纤溶酶原激活剂(t-PA)是人体内重要的丝氨酸蛋白酶,它能特异地激活血栓中的纤溶酶原,使之成为具有溶解纤维蛋白能力的纤溶酶,临床上将提纯的t-PA作为心血管栓塞性疾病急救和康复治疗的首选药物。由于t-PA在天然材料中含量甚微,难以大量制备,基因工程产品产量有限,临床应用货源紧缺且价格昂贵。为探索心血管疾病的基因治疗和预     

乳腺注射法表达人组织型纤溶酶原激活剂的研究

目的 :构建tPA乳腺定位表达载体 ,使其在牛乳汁中高效表达 ,观察目的基因表达的规律及其影响因素 ,为建立新型牛乳腺生物反应器提供理论基础。方法 :RT-PCR法克隆目的基因 ,通过酶切、连接、分离、纯化等方法构建含tPA-cDNA的乳腺定位表达载体 ;采用乳腺注射法将融合基因转入小鼠及牛的乳腺组织中。结果 :乳腺注射外源基因后 ,tPA可在小鼠和牛的乳汁中表达。结论 :乳腺注射法可使目的基因在乳腺组织中稳定地表达较长的时间 ,其表达量与显微注射法没有明显的差异 ,表明外源基因的表达不受转基因方法的影响。但tPA在牛乳汁中的表达量明显高于小鼠的表达量 ,提示不同动物的乳蛋白调控系统有一定的差异 ,可能受着不同的因素或调控系统的影响。     

人黑色素瘤细胞分泌的组织纤溶酶原激活剂(t-PA)的纯化

 本文报道了培养的人黑色素瘤细胞分泌的组织纤溶酶原激活剂(t-PA)的纯化方法。Bowes株人黑色素瘤细胞的分泌产物,经CM-Sephadex C--50层析,赖氨酸-Sepharose 4B,苯甲眯-sepharose 4B亲和层析后,即可得到纯化470倍的蛋白纯品。样品经聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定为均一单带,测得其分子量约为72kD。纯化的t-PA与尿激酶相比较,发现前者有更高亲和纤维蛋白的能力。     

肝素对组织型纤溶酶原激活剂的作用

重组组织型纤溶酶原激活剂 ( rt PA)经肝素处理后与未经处理的 rt PA比较 ,结果显示 ,rt PA在体外的溶纤活性提高 5 0 %～ 90 % ,在兔体内的半衰期延长 1 min,同时也提高了 rt PA对热的稳定性     

猪心组织型纤溶酶原激活剂的纯化鉴定

本文介绍了一种简便易行的纯化组织型纤溶酶原激活剂(t-PA)的方法。新鲜猪心组织经丙酮脱脂脱水,制成干粉,再经醋酸钾缓冲液提取。提取液经阳离子交换柱、肝素柱亲和层析及凝胶柱层析分离纯化。经SDS凝胶电泳分析证明纯化的t-PA只在分子量为67000道尔顿位置出现一条染色带。同时把该蛋白带转移到纤维蛋白板上,也在同一位置出现溶解带。     

小鼠输精管内转染法建立人组织型纤溶酶原激活剂(tPA)乳腺定位表达生物反应器的研究

外源基因受精卵内显微注射目前仍然是种常用的建立转基因动物的方法,但此方法操作复杂,成本高。因此利用精子作为载体将外源基因带入卵细胞内建立转基因动物成了极具吸引力的方法,并且已有一些成功的报道。虽然该方法简单,但总体来说可重复性较差。我们在建立乳腺定位表达人组织型纤溶酶原激活剂(tPA)小鼠模型中,对此方法做了改进,即将脂质体包裹的外源基因在小鼠输精管及附睾管内转染精子,而非以往的在体外转染,结果:(1)五只转染小鼠,术后10天内共使10只正常母鼠受精;(2)共繁殖出79只首建者小鼠,存活42只;(3)用PCR检测首建者小鼠外源基因的整合,阳性率为7/42(16.67%);(4)用凝胶平板溶圈试验检测5只PCR阳性的雌性首建者小鼠泌乳期乳汁中的活性tPA,3/5表达,表达量在12—20IU/ml之间(约相当于48—80ng/ml);(5)PCR检测4只子一代小鼠外源基因的遗传情况,阳性率为2/4。     

人组织型纤溶酶原激活剂(t-PA)突变体在CHO细胞中的高效表达

构建了二氢叶酸还原酶(dhfr)选择基因启动子上游无增强子(cnhancer)的组织型纤溶酶原激活剂(t-PA)组合突变体FrGGI真核表达质粒pZLFrGGI。将pZLFrGGI酶切线性化,采用大剂量DNA电击介导法,转染dhfr基因缺陷型中国仓鼠卵巢细胞系(CHO-dhfr~-)。用氨甲喋呤(MTX)筛选转染细胞。混合加压后,挑选克隆,在1×10~(-7)mol/L MTX压力下,得到了表达水平达1500～2500IU/10~6细胞·24小时的细胞株。此细胞株表达水平稳定,形态良好,倍增时间为36小时,且有进一步提高表达水平的潜能,有望发展为工程细胞株。     

组织纤溶酶原激活剂突变体（La—tPA）转基因鼠的建立

用羊β－乳球蛋白基因（ＢＬＧ）５’区５＊１０＾３ｂ（１０＾３ｂ,旧称ｋｂ）为调序列,构建了乳腺表达组织纤溶酶原激活剂突变体载体。对５４０枚小鼠受精卵进行显微注射,经ＰＣＲ和Ｓｏｕｔｈｅｒｎｂｌｏｔ检测,获得６只整合有人Ｌａ－ｔＰＡ的转基因小鼠,整合率为３２％。