内皮抑素重组腺病毒载体的构建及制备

目的 构建鼠源性内皮抑素(mEndostatin)重组腺病毒真核表达载体,为下一步研究其在体外表达及动物实验研究提供基础。方法 以mEndostatin质粒为模板通过PCR方法扩增回收mEndostatin,并在其5'端引入M-成瘤蛋白信号肽。将mEndostatin连接到腺病毒载体pCA13中,构建pCA13-mEndo表达质粒。将此表达质粒与腺病毒重组质粒pBGHE3通过Lipofectamine 2000共同转染293细胞,经同源重组产生重组腺病毒Ad-mEndo。纯化后重组腺病毒Ad-mEndo在293细胞大量扩增并通过氯化铯密度梯度离心法纯化、测定其滴度。结果 扩增得到的mEndostatin经酶切鉴定、PCR扩增、DNA测序证实为鼠源性内皮抑素,重组腺病毒Ad-mEndo的滴度为6.3×1010 pfu／ml。结论 该实验为今后研究重组腺病毒mEndostatin用于恶性肿瘤的基因治疗打下了基础。     

携带内皮抑素基因的重组腺病毒的构建

目的 利用AdEasy-1系统,构建并鉴定人内皮抑素重组腺病毒,为后续的实验奠定基础.方法 以PshuttleEndostatin质粒为模版PCR扩增内皮抑素基因片断,克隆至穿梭质粒pAdTrack-CMV中,再与骨架质粒pAdEasy-1在大肠杆菌BJ5183中同源重组,在AAV293细胞中包装并扩增.结果 重组腺病毒经测序、酶切鉴定正确,病毒滴度为2.06×1010 pfu/ml.结论 人内皮抑素重组腺病毒pAd-Endo构建成功.     

内皮抑素基因腺病毒载体的构建及表达

目的：构建人内皮抑素（Human Endostatin，hE）基因的腺病毒载体，并研究其对胃癌细胞株SGC-7901、MKN-45及人脐静脉内皮细胞系ECV304生物学特性的影响。方法：采用Lipofectamine2000法将含有人内皮抑素基因的质粒pCA13-hE与pBGHE3共同转染293细胞；免疫荧光法及Western Blot检测hE的表达；用不同感染复数（Muhiplicity of infection，MOI）的重组人内皮抑素基因的腺病毒感染ECV304细胞，观察细胞生长。结果：成功构建了含hE基因的腺病毒载体；经含hE基因腺病毒载体感染的人SGC-7901胃癌细胞株、MKN-45胃癌细胞株均表达hE蛋白；表达的hE蛋白具有一定的生物学活性，可以抑制人静脉内皮细胞系ECV304的生长。结论：获得了有表达功能活性的Endostatin腺病毒载体，表达产物可抑制ECV304细胞的增殖，为肿瘤的抗血管基因治疗提供了必要条件。     

人内皮抑素基因的克隆、表达、纯化及活性测定

目的 获得有生物学活性的人内皮抑索蛋白。方法 用反转录多聚酶链反应(RT-PCR)得到人内皮抑素编码区基因，连接PGEM-T载体，测序确认，定向克隆入pBV220表达载体，转化大肠杆菌DH5α进行表达、纯化及活性测定。结果 经测序分析证实，所获得的552bp基因片段序列属于人内皮抑素基因，构建表达载体在大肠杆菌中表达，经SDS-PAGE分析，出现特异性蛋白质条带，并具有生物学活性。结论 人内皮抑素基因在大肠杆菌中获得非融合表达．表达蛋白能够抑制人脐静脉血管内皮细胞(ECV304)的增殖，为应用内皮抑素进行抗血管生成治疗奠定了基础。     

内皮抑素基因重组腺病毒载体的构建及其对新生血管的影响

目的构建腺病毒介导的小鼠内皮抑素并观察其在体内、外的表达及对血管的抑制作用。方法以mEndostatin质粒为模板通过PCR方法扩增回收mEndostatin基因,将mEndostatin基因连接到腺病毒载体DC315中,构建PDC315-mEndo表达质粒。将此表达质粒与腺病毒重组质粒pBGHE3通过lipofectamine 2000共同转染293细胞,经同源重组产生重组腺病毒Ad-mEndo,用氯化铯密度梯度超速离心法纯化。用50%组织培养感染剂量法测定病毒滴度。体外转染骨肉瘤细胞株MG-63,用western印迹检测感染的骨肉瘤细胞上清夜mEndostatin的表达并通过鸡胚绒毛尿囊膜实验（chorioallantoic membrane,CAM）观察其抑制血管生成的活性。结果酶切、PCR及DNA测序鉴定表明成功构建了携带内皮抑素（Endostatin,ES）融合基因的重组腺病毒载体,而在鸡胚绒毛尿囊膜血管生成实验中加入培养物上清的实验组与对照组相比鸡胚尿囊膜血管密度稀疏,平均血管数差异明显（P〈0.01）。结论腺病毒介导的小鼠内皮抑素基因在体外获得高效表达,并可显著抑制血管生成。     

重组人内皮抑素腺病毒对人脐静脉内皮细胞系的影响

目的 探讨重组人内皮抑素腺病毒(Ad-hEndo)感染人脐静脉内皮细胞(ECV-304)后,对细胞生长状态及生理功能的影响.方法 重组人内皮抑素腺病毒Ad-hEndo感染ECV-304细胞,western blot测定hEndostatin蛋白表达情况,流式细胞术检测Ad-hEndo引起ECV-304细胞凋亡情况,并绘制各组细胞生长曲线.结果 与对照组相比,病毒感染48 h后检测到明显的hEndostatin蛋白表达,Ad-hEndo在感染3 d后出现ECV-304细胞凋亡,且ECV-304细胞在Ad-hEndo感染后生长受到明显限制.结论 Ad-hEndo感染的ECV-304细胞能有效表达hEndostatin,hEndostatin能诱导ECV-304细胞发生细胞凋亡且明显抑制其生长增殖.     

重组人血管内皮抑素时间窗研究进展

【摘要】抗血管生成治疗是目前肿瘤治疗领域的研究热点, 通过抑制肿瘤内部新生血管形成达到“饿死肿瘤”的目的。随着对肿瘤抗血管生成研究的深入, 有学者指出在抗血管生成药物作用下, 肿瘤内部微血管的结构和功能可能有一段趋于正常化的时间, 即正常化时间窗。研究表明在该时间窗内联合化、放疗将提高抗瘤疗效。重组人血管内皮抑素恩度是我国具有完全自主知识产权的新型抗血管生成药物, 确定恩度的时间窗对指导恩度的抗肿瘤治疗具有重要意义。本文就恩度时间窗的研究进展作一综述。     

重组人内皮抑素腺病毒联合顺铂对小鼠结肠癌肺转移治疗作用研究

目的 观察重组人内皮抑素腺病毒(Ad-hE)联合顺铂(Cis)对小鼠结肠癌肺转移的治疗作用、不良反应,并初步探讨其作用机制,探索抗血管基因治疗联合化疗的可行性.方法 6～8周龄BALB/c小鼠每只尾静脉注射接种1×105 CT26细胞,建立小鼠CT26结肠癌肺转移模型,随机分成5组,分别予Ad-hE和Cis单独及联合注...     

腺病毒携带人内皮抑素基因在舌癌细胞和血管内皮细胞中的表达

【目的】以腺病毒携带的人内皮抑素基因 Endostatin基因 (Ad/hEnd)感染舌癌细胞株Tca8113和人脐静脉内皮细胞株ECV30 4,观察其在舌癌细胞和静脉内皮细胞株中的表达。【方法】用 2 93细胞扩增Ad/hEnd ,并抽提、纯化。以 10MOI的Ad/GFP感染ECV细胞 ,观察细胞中表达绿色荧光蛋白的细胞所占的比例。采用免疫组化法检测Endostatin蛋白在感染了Ad/hEnd的Tca细胞和ECV细胞中的表达。Ad/hEnd感染Tca细胞后收集细胞培养液上清 ,ELISA检测上清中Endostatin蛋白含量。Western blot检测Endostatin蛋白在Tca和ECV细胞中的表达。【结果】扩增的Ad/hEnd通过空斑形成试验准确测定其滴度可达 1× 1 0 1 0 ～ 8× 1 0 1 0 PFU/mL。表达绿色荧光蛋白的细胞所占的比例为 31 %。实验显示感染Ad/hEnd后 ,在Tca细胞和ECV细胞胞浆内有Endostatin蛋白合成。细胞培养液上清中Endostatin蛋白表达浓度呈时间剂量依赖关系 ,最高达到 5 97μg/L。Western blot检测显示Endostatin蛋白可在两种细胞中高效表达 ,相对分子质量与自然Endo statin蛋白一致 ,无杂合蛋白 ,呈剂量依赖关系 ,且持续到第 7天仍呈明显的Endostatin蛋白质条带。【结论】本实验制备的重组腺病毒Ad/hEnd能在舌癌细胞和血管内皮细胞中有效表达Endostatin蛋白 ,可用于抗     

人内皮抑素基因的克隆、表达、纯化及活性测定

目的 获得有生物学活性的人内皮抑素蛋白。方法 用反转录多聚酶链反应(RT-PCR)得到人内皮抑素编码区基因,连接PGEM-T载体,测序确认,定向克隆入pBV220表达载体,转化大肠杆菌DH5α进行表达、纯化及活性测定。结果 经测序分析证实,所获得的552bp基因片段序列属于人内皮抑素基因,构建表达载体在大肠杆菌中表达,经SDS-PAGE分析,出现特异性蛋白质条带,并具有生物学活性。结论 人内皮抑素基因在大肠杆菌中获得非融合表达,表达蛋白能够抑制人脐静脉血管内皮细胞(ECV304)的增殖,为应用内皮抑素进行抗血管生成治疗奠定了基础。     

小鼠内皮抑素基因真核表达载体的构建和表达

目的 构建小鼠内皮抑素（ｅｎｄｏｓｔａｔｉｎ）ｃＤＮＡ的真核表达载体并将其在体外培养的脑胶质瘤细胞内表达。方法 将带有分泌信号的小鼠ｅｎｄｏｓｔａｔｉｎｃＤＮＡ克隆入真核表达载体ｐｃＤＮＡ３,构建ＣＭＶ启动子控制的载体ｐｃＤＮＡ－ｓＥｎｄｏ,并将上述载体转染体外培养的脑胶质瘤细胞（ＳＨＧ４４）,采用ＷｅｓｔｅｒｎＢｌｏｔ鉴定其表达,应艇牛微血管内皮细胞抑制实验检测其活性,结果 成功地构建了真核表达     

Endostatin基因真核表达载体的构建及活性鉴定

目的：构建endostatin基因的真核表达载体,并将其转染C6脑胶质瘤 细胞,探讨其体外抑制血管内皮细胞生长的活性。方法：利用PCR将大鼠血清蛋白分泌信号连接在endostatin基因的碳末端,构建成真核表达载体pcDNA3-Sendostatin,利用Lipofectamine法将其转染C6脑胶质瘤细胞,采用细胞增殖实验进行endostatin表达蛋白体外活性鉴定。结果：成功构建了endostatin基因真核表达载体,转染该载体的C6脑胶质瘤细胞可分泌表达抑制血管内皮细胞增生的endostatin蛋白。结论：endostatin是一种有效的血管生成抑制剂,可进一步用于在体肿瘤的抗血管生成治疗。     

endostatin基因重组腺病毒的构建及在人肺腺癌细胞的表达

目的 利用AdEasy系统构建鼠内皮抑素(ES)基因重组腺病毒Ad.ES,并观察其在人肺腺癌细胞SPCA-1的表达.方法 采用酶切、连接和转化等方法,将质粒pcDNA3.ES中的ES片段插入腺病毒穿梭质粒载体pAdTrack.CMV,构建重组腺病毒穿梭质粒载体pAdTrack.CMV.ES,经Pme Ⅰ酶切线性化后与含腺病毒基因骨架的质粒载体pAdEasy-1在细菌BJ5183内进行同源重组得到腺病毒质粒pAd.ES,重组腺病毒质粒经PacⅠ酶切后,转染人胚肾293细胞包装成腺病毒颗粒Ad.ES,将病毒上清反复感染293细胞获得高滴度病毒,应用氯化铯(CsCl)梯度离心的方法纯化病毒,利用AdEasy系统上的绿色荧光蛋白(GFP)标签测定重组腺病毒的功能滴度.用2 MOI重组腺病毒Ad.ES体外转导SPCA-1细胞48h,流式细胞仪检测GFP表达阳性率,ELISA法测定细胞培养上清液中ES的含量.结果 双酶切证实重组腺病毒穿梭载体pAdTrack.CMV.ES质粒构建正确,卡那霉素抗性筛选和Pac Ⅰ酶切鉴定证实腺病毒重组质粒构建成功.Pac Ⅰ酶切线性化的重组质粒导入293细胞3d,约20%的细胞表达GEP,回收病毒重复感染293细胞,CsCl梯度离心纯化最终获得约5.6×1010TU/mL滴度的重组病毒.Ad.ES体外转导SPCA-1细胞48h后,细胞GFP阳性率为93%,细胞培养上清液中ES的含量较Ad.GFP感染组和阴性对照组明显增加(P＜0.05).结论 应用新型腺病毒载体AdEasy系统可在短期内制备同时表达GFP和ES的重组腺病毒,Ad.ES体外感染人肺腺癌细胞SPCA-1可显著提高ES表达,为进一步研究抗血管生成治疗肺癌奠定了基础.     

重组人内皮细胞抑制素腺病毒载体体外活性作用的研究

目的:研究表达人内皮细胞抑制素(endostatin)的腺病毒载体的体外活性作用.方法:用重组人内皮细胞抑制素腺病毒载体体外转染人结肠癌SW620细胞,观察肿瘤细胞生长情况,并观察其上清对大鼠肺毛细血管内皮细胞、新生牛主动脉内皮细胞及人脐静脉内皮细胞生长的影响.结果:MTT法检查证实重组腺病毒对结肠癌细胞生长无抑制,锥虫蓝染色证实转染的人结肠癌SW620细胞上清对各种血管内皮细胞的生长均有较强的抑制作用.结论:重组人内皮细胞抑制素腺病毒载体体外对各种血管内皮细胞生长均有较强的抑制作用,为进一步的动物实验奠定了基础.     

腺病毒介导血管内皮抑素基因转染肺癌细胞后的表达

目的:观察重组腺病毒介导的血管内皮抑素基因在体外转染A549细胞后的表达。方法:以复制缺陷型重组腺病毒为载体,将血管内皮抑素基因导入肺癌A549细胞,以免疫组织化学法、Western印迹法和ELISA法检测内皮抑素在A549细胞中的表达。结果:免疫组化染色、ELISA法和Western印迹法检测:A549细胞中内皮抑素蛋白表达阳性,Ad.Null组及PBS组内皮抑素蛋白未见有表达。结论:Ad.Endostatin转染A549细胞可表达具有生物学活性的内皮抑素。     

内皮抑素重组腺病毒表达载体的构建及其对血管内皮细胞增殖特性的影响

目的构建含有人内皮抑素(endostatin,ES)基因的重组腺病毒Ad/hEnd,并探讨与感染该病毒的角朊细胞共培养时内皮细胞增殖特性的改变.方法以人胎肝组织mRNA为模板,通过RT-PCR及PCR获得ES基因序列,插入到腺病毒穿梭质粒pAdTrack-CMV中,获得重组质粒pAdTrack-ES.经鉴定后将阳性重组子转化至pAdeasy1受体菌,筛选阳性克隆.脂质体介导转染293细胞,获取Ad/hEnd,经PCR鉴定及上清中ES含量检测后,感染角朊细胞,并采用套皿法与内皮细胞共培养,测定培养液中ES含量、内皮细胞凋亡及细胞抑制率.结果成功获取Ad/hEnd,病毒滴度可达1.65×1012 pfu/L.感染Ad/hEnd的角朊细胞可有效表达并分泌ES,连续培养3 d后,培养液中ES含量可达226 ng/ml;与转基因角朊细胞共培养的内皮细胞凋亡百分数与抑制率分别为(32.7±7.1)%、(60.5±8.3)%,均显著高于对照组[(7.3±2.0)%、(13.8±1.6)%],(P＜0.01).结论与内皮细胞共培养时,转Ad/hEnd角朊细胞可通过分泌ES促进内皮细胞凋亡,并抑制其增殖.