针对bcr/abl融合蛋白的治疗研究进展

bcr/abl融合蛋白在慢性粒细胞白血病的发生与发展中扮演着重要的角色,针对bcr/abl为靶点的治疗已成为当前研究的热点。结合近年来的大量相关文献,对目前的研究现状进行综述并给予相应的评价。     

BCR/ABL癌蛋白片段的表达、纯化及其抗血清的制备

目的　克隆并表达 bcr/ abl融合基因片段 ,并制备其抗血清 .方法　 PCR扩增包含蛋白融合点的 bcr/ abl癌基因片段 ,序列测定后克隆入带有 His标签的原核表达载体 p ET-16 b,转化宿主菌 BL2 1,IPTG诱导表达 ,SDS- PAGE分析表达结果 ,Ni- NTA树脂亲和纯化 ,皮下多点注射免疫小鼠 ,EL ISA确认抗血清的滴度 .结果　 PCR扩增得到大小约 5 2 3bp的目的片段 ,序列测定表明与发表序列完全一致 ;得到了一种新的癌基因 bcr/ abl片段的原核表达载体 p ET- 16 b- bcr/abl,在 BL 2 1中表达可见于 Mr 2 1× 10 3处有一蛋白新生带 ,表达的 BCR/ ABL蛋白免疫小鼠后 ,EL ESA确认抗血清的滴度 >1∶ 2 0 0 0 .结论　成功的克隆、表达了 bcr/ abl融合基因片段 ,并制备了相应的抗血清 .     

bcr/abl基因在慢性粒细胞性白血病中的发病作用及bcr/abl反义基因治疗

慢性粒细胞性白血病(CML)最有效治疗手段为骨髓移植(BMT)。但异体BMT供髓者缺乏，且有发生移植物抗宿主病的危险。自体BMT常因骨髓净化不彻底导致复发。所以探讨CML细胞生物学行为改变的原因，是探索CML病因进而力争治愈CML的关键。 　　1　bcr/abl表达产物及功能 　　90%以上CML患者骨髓全部造血细胞内出现Ph1染色体，由位于9号染色体q34.11的c-abl基因与位于22号染色体q11.21的c-sis基因相互易位，形成t(9;22)(q34.11;q11.21)所致。22号染色体上断裂点集中在约5 800 bp的区域内，称M-bcr。CML中bcr/abl融合方式有2种：bcr第3及第2外显子分别与abl第2外显子融合成b3a2及b2a2型，二者差75 bp，均表达210 000的蛋白，即p210bcr/abl (p210)。此外还有bla2型(p185)，主要见于ALL。     

bcr/abl融合基因在慢性粒细胞白血病中的表达及临床意义

目的 探讨bcr/abl融合基因的表达在慢性粒细胞白血病(CML)中的诊断、疗效及预后观察中的意义.方法 采用荧光定量逆转录多聚酶链反应(FQ -PCR)技术,对8例复治CML患者和作为对照组的2例急性非淋巴细胞性白血病患者的骨髓或外周血进行bcr/abl融合基因检测;同时比较患者的血象、骨髓象等相关实验室指标.结果 CML中7例慢性期(CP)和1例急变期(BC)患者,均不同程度地表达了bcr/abl融合基因,而对照组该融合基因的表达为阴性.结论 bcr/abl基因是CML发病的分子基础,定量检测bcr/abl融合基因对于CML的诊断、临床分型、疗效观察及预后判断有重要意义.     

慢性粒细胞性白血病bcr/abl融合基因的表达

目的：研究慢性粒细胞性白血病患者bcr／abl融合基因阳性率及其临床意义。方法：取慢性粒细胞性白血病(CML)患者骨髓或外周血，提取单核细胞的总RNA，用逆转录多聚酶链反应(RT-PCR)，观察其ber／abl基因的表达。结果：9例CML患者中，8例ber／abl基因阳性，占88.9％。结论：bcr／abl基因检测可以用来辅助CML的临床诊断。     

RT-PCR检测慢性粒细胞白血病患者骨髓细胞集落bcr/abl mRNA的表达

采用ＲＴＰＣＲ 技术对ＣＭＬ 患者骨髓细胞１４ ｄ 的细胞集落群和部分１４ ｄ 或２８ ｄ 的单个细胞集落ｂｃｒ／ａｂｌ ｍ ＲＮＡ 表达进行分析。结果显示：所检测的骨髓细胞集落ｂｃｒ／ａｂｌ 基因的表达均呈阳性,即为ＣＭＬ 集落,与细胞遗传学分析结果一致。该方法为研究ＣＭＬ 造血前体细胞基因表达及其诊断、治疗监测提供了灵敏、有效的分析手段;并可作为研究ＣＭＬ 发病、治疗及筛选抗ＣＭＬ 药物较为理想的方法。     

双色ES探针检测慢性粒细胞白血病bcr/abl融合基因的应用研究

目的:探讨使用bcr/abl双色ES探针的荧光原位杂交(fluorescence in-situ hybridization,FISH)应用于慢性粒细胞白血病bcr/abl融合基因检测的意义.方法:使用荧光原位杂交方法对2005年1月至2006年2月本院收治的12例慢性粒细胞白血病患者之骨髓细胞进行检测分析.结果:12例CML均检出bcr/abl基因的存在,其中2例伴ASS基因缺失.结论:使用bcr/abl双色ES探针进行荧光原位杂交能为bcr/abl融合基因的检测提供准确直观的依据.     

慢性粒细胞白血病bcr/abl的糖基化磷脂酰肌醇锚定修饰及在COS-7细胞膜上的表达

目的 构建与糖基化磷脂酰肌醇(glycosyl phosphatidyl inositol,GPI)锚定序列相连的bcr/abl真核表达质粒,并检测其在COS-7细胞中基因和膜蛋白的表达.方法 以编码慢性粒细胞白血病bcr/abl融合蛋白全长序列的migP210质粒为模板,通过PCR扩增获得654 bp的bcr/abl融合基因片段,双酶切后定向插入真核表达载体pBudCF4.1中,经鉴定获得重组质粒pBB.同时用RT-PCR扩增人外周血淋巴细胞CD24分子中的GPI获得约243 bp的锚定序列,双酶切后克隆人pBB质粒中与ber/abl基因下游羧基端相连,获得重组质粒pBBG.在多聚阳离子介导下将pBBG质粒转染COS-7细胞,采用RT-PCR和Western blot检测bcr/abl融合基因和蛋白的表达.结果 经酶切和测序鉴定证实,由GPI锚定连接的ber/abl融合基因插入片段正确;RT-PCR检测到转染细胞中有bcr/abl融合基因,Western blot检测到转染细胞膜上有hcr/abl融合蛋白的表达.结论 成功构建由GPI锚定修饰的bcr/abl重组质粒pBBG,并能在COS-7细胞膜上表达出bcr/abl融合蛋白.     

Ph染色体阳性bcr／abl融合基因阴性的结果分析

目的探讨慢性粒细胞白血病患者骨髓细胞Ph染色体阳性her／abl融合基因阴性的原因。方法对6例CML患者同时进行骨髓常规、外周血检查,染色体核型分析及bcr／abl融合基因RT—PCR检测。结果6例标本骨髓象血象均符合CML慢性期,PIl染色体阳性,bcr／abl融合基因阴性。结论Ph染色体阳性bcr／abl融合基因阴性的结果原因复杂,除实验因素如RNA总量不足或降解,RNA酶的存在或逆转录合成eDNA量的不足外,还可能存在未知因素或少见类型的ber/abl融合基因。     

初发慢性髓系白血病bcr/abl融合基因转录子与临床关系的观察

目的　研究初发慢性髓系白血病bcr/abl融合基因转录子类型与临床关系。方法　使用RT PCR对 5 1例初发CML患者进行bcr/abl融合基因转录子检测。结果　b3a2型患者血小板数高于b2a2型患者 ,但b3a2型患者WBC数低于b2a2型患者 (P <0 .0 5 ) ;血红蛋白浓度与b2a2型患者比较无差异 (P >0 .0 5 ) ;b3a2型和b2a2型患者比较AKP和Ph1染色体比例无差异 (P >0 .0 5 ) ;M bcr/abl阳性患者伴m bcr/abl阳性率为 47 0 % ,其中b3a2型患者有m bcr/abl融合基因转录子 14例 ,b2a2型患者有 10例。结论　b3a2型CML患者初发时更易有血小板升高表现 ,但b2a2型患者更易有WBC数升高的表现 ,较多的初发CML患者同时伴有m bcr/abl阳性。     

两次PCR方法对慢性粒细胞白血病bcr/abl检测的临床意义

<正> 慢性粒细胞白血病(CML)bcr/abl基因重组的检测对CML的诊断、预后判断有重要意义。现报道7例CML检测结果如下: 材料与方法 一、一般资料:本组男5例,女2例;年龄31～53岁,平均33岁;全国统一诊断标准。6例均取骨髓或外周血行细胞遗传学检查,短期培养,胰酶消化,G显带技术。     

RT-PCR检测慢性粒细胞白血病患者bcr/abl融合基因结果分析

目的探讨逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）体系检测慢性粒细胞白血病（CML）bcr/abl融合基因的临床价值。方法 Trizol试剂提取细胞RNA,用特异引物RT-PCR检测bcr/abl融合基因,并作灵敏度实验。结果本研究灵敏度可达104的稀释水平,46例CML患者bcr/abl融合基因的阳性率为91.3%,其中b3a2有27例,b2a2有15例。结论 RT-PCR检测bcr/abl融合基因检测弥补了细胞形态学诊断的不足,并为CML临床治疗和预后判断提供了指导。     

抗慢性粒细胞性白血病bcr/abl mRNA真核表达载体的构建

目的：构建一个含M1RNA、具有特异性抗慢性粒细胞性白血病（CML）细胞融合基因bcr/ablmRNA的真核表达载体，以用于CML的分子靶向治疗。方法：以pTK117为模板，通过PCR方法合成一个带有导引序列（GS）的M1RNA，再将PCR产物克隆到真核表达载体pNAV-1上，得到重组质粒pAVGS4，转化大肠埃希菌JM109，以碱裂解法小量抽提，酶切电泳鉴定，并测序鉴定。结果：以EcoRI和SalI酶切、1％的琼脂糖凝胶电泳显示在500和6500bp附近各有一条明亮的条带。应用PCR方法测序的结果与模板序列一致。结论：构建的pNAV-1经酶切和测序鉴定，与目标序列一致，含有核酶、具有抗bcr/abl mRNA的真核表达载体构建成功，预期可用于CML细胞株和原代细胞的实验研究。     

In Situ-RT PCR定量检测16例慢性粒细胞白血病bcr/abl融合基因

目的：研究原位逆转录多聚酶链反应技术（In Situ-RT PCR)在检测慢性粒细胞白血病（CML）bcr/abl融合基因中的应用价值及其意义。方法：用In Situ-RT PCR方法测定CML病人bcr/abl融合基因表达量,结果：在不破坏完整性条件下细胞系K552和CML病人检测到bcr/abl mRNA的扩增产物,表现为细胞浆内出现蓝紫色颗粒,计算这种阳 细胞的百分率来相对定量地,CML病人bcl/abl mRNA的表达水平,这种检测技术的敏感性达10^-4水平以上,结论：In Situ-RT PCR可以相对定量地检测CML病人bcl/abl mRNA的表达,直观地评价α－干扰素（α－IFN）,骨髓移植（BMT）等治疗CML的疗效,本检测方法敏感性高,又可用做微小残留病（MRD）的检测。αα     

双色双融合荧光原位杂交检测慢性粒细胞白血病的bcr/abl融合基因研究

目的：探讨双标双融合荧光原住杂交技术(dual-color and dual-fusion fluorescence in—situ hybridization，D—FISH)在慢性粒细胞白血病(chronic myeloid leukemia，CML)中检测bcr／abl融合基因的灵敏度及特异性。方法：应用细胞遗传学G显带(CCG)核型分析、双色荧光原住杂交(D—FISH)和染色体涂染技术，检测了29例CML患者骨髓中期分裂相和间期细胞。结果：CCG检出Ph( )24例，D—FISH检测均为bcr／abl( )；Ph(-)5例，其中4例核型为46，XY，经D—FISH检测2例bcr／abl( )，2例ber／abl(-)，另1例核型为46，XYt(20；22)，D—F1SH检测ber／abl( )，以9号，20号和22号全染色体探针涂染，确定该例核型为46，XYt(9；20；22)，D—FISH检测总阳性率为93．10％(27／29)，高于CCG检查时阳性率82．76％(24／29)(P=0．025)。结论：与CCG方法相比，D—FISH检测CML的ber／abl融合基因具有简便、快速、灵敏、特异性强等优点，可以作为CML临床诊断和微小残留病监测的一种重要检测方法。．     

bcr/abl融合蛋白对细胞DNA损伤修复功能的影响

目的:建立稳定表达bcr/ablP210融合蛋白的小鼠转化细胞株BaF3-P210的DNA损伤模型,探讨bcr/abl融合蛋白对细胞DNA损伤修复功能的影响.方法:彗星实验检测不同浓度H2O2诱导的BaF3-P210细胞的DNA损伤建立DNA损伤模型,以空载体转染BaF3-MIGR1细胞为对照;用彗星实验对两组细胞在DNA损伤后的修复进行不同时间段的动态观测.结果:彗星实验确定了细胞DNA损伤模型的建立条件是:采用50 μmol/L终浓度的H2O2对BaF3-MIGR1细胞和BaF3-P210细胞进行染毒,H2O2作用温度和时间均为4℃,10 min.BaF3-P210细胞与BaF3-MIGR1细胞相比DNA损伤后修复时间缩短,在损伤后60 min即可达到完全修复,而后者在损伤后120 min才能完全修复(P＜0.05).结论:建立了表达bcr/ablP210融合蛋白的小鼠转化细胞株BaF3-P210细胞的DNA损伤模型,并发现bcr/abl融合蛋白可增强BaF3-P210细胞的DNA损伤后修复能力.     

染色体核型和bcr/abl融合基因表达与慢性髓细胞白血病急变的关系

目的 探讨慢性髓细胞白血病(chronic myelogenous leukemia,CML)的细胞遗传学特性及其与病程发展的关系.方法 短期培养法直接法G显带检测CML的骨髓染色体核型,双色荧光原位杂交检测CML的bcr/abl融合基因,统计学方法采用t 检验.结果 264例CML患者的骨髓染色体检测,检测出Ph染色体阴性14例,阴性率5.3 %,其余为Ph染色体阳性,阳性率为94.7%.在观察到CML急变的43例患者中,标准Ph染色体22例,Ph染色体阴性9例,双Ph染色体2例,变异Ph染色体3例,标准Ph染色体伴其它染色体易位3例,Ph染色体阴性伴其它染色体易位1例,Ph染色体阴性伴倒位2例,Ph染色体阳性伴倒位1例.43例患者中24例患者急变时发生了染色体核型及融合基因改变,19例患者染色体核型及融合基因没有发生变化;[t(9;22)(q11;34)]的CML患者与[Ph-,变异Ph,复杂染色体]的CML患者急变时间(月)差异有统计学意义(P＜0.05).结论(1)慢性髓细胞性白血病加速/急变期发生克隆演化;(2)[Ph-,变异Ph,复杂染色体]的CML患者急变时间(月)明显短于[t(9;22)(q11;34)]的CML患者;(3) 染色体核型和bcr/abl融合基因表达可为诊断提供可靠、可循的依据,对预后判断有重要意义.     

慢性粒细胞白血病bcr/abl融合基因T315I点突变的检测及靶向治疗

慢性粒细胞白血病(chronic myelogenous leukemia,CML)占所有白血病的15%~20%,90%以上患者存在特征性的Ph染色体(费城染色体)及bcr/abl融合基因。Ph染色体由位于9q34的abl原癌基因断裂并易位到22q11的断裂点集簇区(bcr)形成,并融合形成bcr/abl融合基因[1]。CML治疗重点在于慢性期获得分子水平的缓解。伊马替尼(imatinib mesy-     

ES探针荧光原位杂交法检测bcr/abl融合基因

目的探讨应用ES型bcr/abl探针(双色单融合)荧光原位杂交技术(FISH)在检测bcr/abl融合基因中的价值。方法慢性髓细胞性白血病(CML)初诊或复诊患者30例(骨髓标本43份),行普通染色体核型分析和ES型bcr/abl探针荧光原位杂交分析。结果 43份骨髓标本,6份未做骨髓培养,6份培养失败,在其余31份培养成功的标本中,找到Ph1染色体9份,另有1份标本多次检查都发现存在21p+染色体异常;43份骨髓都经FISH检测,13份标本发现bcr/abl融合基因。结论 ES型bcr/abl探针对CML初诊病例的bcr/abl融合基因有较高的检出率;对复发病例,不仅能辅助诊断CML,而且在监测白血病微小残留病灶、判断疾病的进展上均有较高的灵敏度。