电离辐射诱导乳腺癌细胞自噬相关基因DRAM表达的研究

目的 研究电离辐射对乳腺癌细胞株MCF-7自噬相关基因DRAM表达变化的影响.方法 采用GFP-LC3转染法检测自噬泡,实时荧光定量PCR方法检测DRAM基因表达,Western blot方法检测LC3和DRAM蛋白的表达,采用磷酸钙共转染法构建DRAM沉默细胞模型.结果 与假照组相比,8 GyX射线照射后细胞中GFP-LC3表达升高;时间-效应关系表明,在8 Gy照射后,自噬溶酶体蛋白LC3表达在2、4、8、16、24和32 h上升变化显著,各组均高于假照组(F=5.38、8.72、10.63、15.23、20.78和55.23,P＜0.05);DRAM蛋白表达在8 Gy照射后以时间依赖性增加,从2h开始上升,32 h达至最高值(F=116.34,P＜0.05).DRAM沉默细胞模型组中LC3和DRAM蛋白的表达明显低于假照组(F=20.36和40.35,P＜0.05);对DRAM沉默细胞模型组进行8 Gy照射后,DRAM蛋白表达与假照组相比虽有所增加,但仍低于8 Gy照射组;DRAM沉默细胞模型组LC3蛋白的表达也低于照射组,沉默前后差异均有统计学意义(F=50.34,P＜0.05).结论 X射线可能通过激活DRAM基因来促进乳腺癌细胞株MCF-7发生自噬.     

西妥昔单抗对125Ⅰ粒子照射结直肠癌细胞DNA修复能力和信号传导通路的影响

目的 探讨西妥昔单抗(C225)对125Ⅰ粒子照射下结直肠癌CL187细胞DNA损伤修复和信号传导通路的影响.方法 实验分为空白对照组,100 nmol/L C225处理组,单独125Ⅰ粒子持续低剂量率照射组和C225联合125Ⅰ粒子持续低剂量率照射组.在吸收剂量达4 Gy后48 h,经细胞免疫荧光检测各组细胞中γH2AX聚集点数量以及γH2AX聚集点阳性细胞比例.提取细胞内总蛋白,Western blot检测DNA修复蛋白的变化.在吸收剂量达4 Gy后即刻提取总蛋白,Western blot分析在照射过程中C225对EGFR下游信号通路中蛋白分子的影响.结果 与单独125Ⅰ粒子持续低剂量率照射组细胞相比,C225联合125Ⅰ持续低剂量率照射组细胞内残余的γH2AX聚集点数量和γH2AX聚集点阳性的细胞比例均高(t=8.0和6.8,P＜0.05),并且细胞中DNA修复蛋白Ku70和DNA-PKcs的含量偏低(t=6.6和5.7,P＜0.05).Western blot结果显示,在125Ⅰ粒子持续低剂量率照射过程中,C225能够降低细胞内EGFR的水平(t=4.9,P＜0.05),抑制Akt的活化(t=5.5,P＜0.05).结论 在125Ⅰ放射性粒子持续低剂量率照射下,C225可以降低细胞内Ku70和DNA-PKcs的含量,并抑制Akt活化,减弱CL187细胞的DNA损伤修复能力.     

脱氧胞苷激酶Ser-74位点在辐射诱导的乳腺癌细胞死亡中的作用

目的 研究脱氧胞苷激酶(dCK) S74位点在辐射诱导乳腺癌细胞MCF-7死亡中的作用.方法 采用脂质体转染方法在MCF-7中分别构建dCK-Vector(空载体)、dCK-WT(野生型)、dCK-S74A(非磷酸化型)及dCK-S74E(过磷酸化型)4种细胞模型,均分别予以0,2,4,6和8 GyX射线照射.实时定量PCR(QPCR)及Western blot验证细胞模型,CCK-8法和集落形成实验检测细胞存活率,单丹磺酰尸胺(MDC)检测自噬发生率,流式细胞术检测细胞凋亡率.结果 成功构建4种细胞模型;CCK-8结果显示,与0 Gy组相比,MCF-7和dCK-Vector经8 Gy照射后存活率下降(t=14.469和9.357,P＜0.05),dCK-WT、dCK-S74E和dCK-S74A没有改变(P＞0.05);与dCK-Vector比较,dCK-WT和dCK-S74E照射后的总死亡率降低(x2=3.857 ～3.971和3.857～3.859,P＜0.05),dCK-S74A则没有变化(P＞0.05);与各自0 Gy组比较,MCF7、dCK-Vector和dCK-S74A照射后凋亡发生率升高(t=-4.531、-3.688和-7.076,P＜0.05),而dCK-WT和dCK-S74E使照射诱导的凋亡率逆转了66％和68％;dCK-WT和dCK-S74E照射后自噬率分别增加22％和26％(t=-9.051和-8.411,P＜0.01),dCK-S74A、MCF-7和dCK-Vector照射后的自噬率没有明显变化(P＞0.05).结论 dCK-WT和dCK-S74E使电离辐射诱导的凋亡率增加发生逆转,同时使自噬率增加,总死亡率降低,提示dCK在Ser-74的磷酸化与乳腺癌细胞MCF-7的辐射敏感性有关.     

不同照射方式对结直肠癌CL187细胞的抑制作用和分子机制初探

目的 研究单次、分次和125Ⅰ粒子持续低剂量率照射对结直肠癌CL187细胞生物学效应的影响.方法 实验分高剂量率单次照射组(400 cGy/min,单次组)、分次照射组(2 Gy/次/d,400 cGy/min,分次组)和125Ⅰ粒子持续低剂量率照射组(2.77 cGy/h,125Ⅰ组).3组细胞照射0、2、4和8 Gy后,24和48 h进行细胞计数和锥虫蓝染色,比较细胞总数和细胞存活率的差异.利用克隆形成实验比较3组细胞增殖能力的差异.通过流式细胞仪检测细胞凋亡.蛋白免疫印迹法分析PHLPP2、PTEN和Bax蛋白表达的变化.结果 与单次组和分次组相比,125Ⅰ组细胞总数减少(t=34.28和29.48,P＜0.05)、存活细胞比例减少(t=-12.38和-14.61,P＜0.05),细胞克隆形成能力下降,相对生物学效应是1.41.照射后48 h细胞凋亡检测发现125Ⅰ组细胞凋亡比例增加(t=-15.08和-11.99,P＜0.05).蛋白免疫印迹法检测发现125Ⅰ组Bax表达量升高,PHLPP2和PTEN的表达量3组间差异无统计学意义.结论 单次、分次和持续低剂量率照射后细胞PHLPP2蛋白表达水平均升高,但剂量率的高低并不影响其表达水平.不同方式照射后,凋亡相关蛋白Bax的表达水平上升,125Ⅰ组升高更加明显,125Ⅰ持续低剂量粒子照射可能通过影响凋亡相关蛋白Bax的表达水平实现对结直肠癌CL187细胞的杀伤作用.     

3-甲基腺嘌呤增强食管鳞癌Eca-109细胞放射敏感性的研究

目的 研究自噬在照射致人食管鳞癌Eca-109细胞死亡过程中的作用。方法 选用食管鳞癌Eca-109细胞,分为对照组、5 mmol/L给药组、10 mmol/L给药组、单纯照射组、照射+5 mmol/L组、照射+10 mmol/L组,共6组。采用Western blot检测不同处理组自噬标志物LC3B表达水平;GFP-LC3转染食管鳞癌Eca-109细胞后监测自噬体数量变化;MTT法检测不同处理组细胞活力;荧光染料Hoechst 33342观察不同处理组细胞凋亡的形态学变化;流式细胞术检测不同处理组细胞周期和细胞凋亡;克隆形成实验检测食管鳞癌Eca-109细胞不同处理组放射敏感性。结果 Western blot显示,照射后自噬水平升高,自噬抑制后LC3BⅡ和LC3BⅡ/LC3BⅠ比值明显下降(F=25.64,P<0.05);GFP-LC3转染食管鳞癌Eca-109细胞后,可见照射后自噬体荧光斑点明显增多,自噬抑制后自噬体明显减少(F=127.36,P<0.05);抑制自噬协同照射后细胞活力明显低于单纯照射组(F=129.54,P<0.05);抑制自噬后也增加了照射诱导的凋亡率和G₂/M期阻滞细胞比;线性二次模型拟合剂量存活曲线显示,抑制自噬能增加食管鳞癌Eca-109细胞的放射敏感性。结论 抑制自噬能提高食管鳞癌Eca-109细胞的放射敏感性,协同杀伤肿瘤细胞,提示抑制自噬或可用于辅助食管鳞癌的放射治疗。     

α粒子诱发BEP2D细胞恶性转化中脂质和DNA氧化损伤的研究

目的 探讨α粒子诱发永生化人支气管上皮细胞BEP2D恶性转化的机制.方法 运用DCFH-DA荧光探针标记活性氧(ROS),观察分析BEP2D细胞、α粒子作用BEP2D后第22代细胞RH22,以及α粒子作用BEP2D后恶性转化细胞株BERP35T-１内基础活性氧水平.丙二醛(MDA)测定试剂盒检测BEP2D、RH22和BERP35T-1细胞内脂质过氧化产物丙二醛的含量.采用免疫细胞化学法和免疫荧光染色法,检测BEP2D、α粒子作用BEP2D后第23代细胞RH23及BERP35T-1细胞内DNA氧化损伤产物8-OH-dG和DNA双链断裂产物γ-H2AX的表达水平.结果 与BEP2D细胞相比,RH22和BERP35T-1细胞中基础活性氧水平显著升高(t=4.30和3.94,P＜0.05),丙二醛的含量显著升高(t=4.89和15.10,P＜0.05);RH23和BERP35T-1细胞中8-OH-dG表达上调(t=3.80和2.92,P＜0.05),γ-H2AX表达上调(t=7.61和12.67,P＜0.05).结论 氧化还原环境紊乱形成氧化压力,导致细胞内脂质和DNA氧化损伤增强,由此促进基因组不稳定性,可能是α粒子诱发BEP2D细胞恶性转化的机制之一.     

自噬抑制剂磷酸氯喹增加鼻咽癌CNE-2细胞株的放射敏感性

目的 探讨自噬现象在照射致人鼻咽低分化鳞癌(CNE-2)细胞死亡过程中的作用。方法 采用Western blot技术检测CNE-2细胞经射线照射后自噬标志物LC3、P62的变化,透射电镜检测自噬小体;流式细胞术检测CNE-2细胞凋亡率;MTT法检测CNE-2细胞照射后不同时间的存活率;细胞克隆形成实验检测CNE-2细胞的存活能力及放射敏感性。结果 透射电镜检测示自噬抑制剂磷酸氯喹(CDP)抑制照射所致自噬体的形成,自噬诱导剂雷帕霉素(RAPA)增加照射致自噬体数量(F=105.15,P<0.05);CDP抑制射线引起的LC3-Ⅰ向LC3-Ⅱ的转化,而RAPA促进LC3-Ⅰ向LC3-Ⅱ的转化(F=231.68,P<0.05);CDP使P62表达上调,RAPA使P62表达下调(F=117.52,P<0.05);CDP+照射组和RAPA+照射组的CNE-2细胞凋亡率明显高于单纯照射组(F=143.72,P<0.05);CDP、RAPA降低了照射后CNE-2细胞的存活率(F=25.88,P<0.05);二次线性模型拟合剂量存活曲线示自噬抑制剂CDP、RAPA可增加CNE-2细胞株的放射敏感性(F=167.32,P<0.05)。结论 照射联合自噬抑制剂CDP显著增加了CNE-2细胞株对射线的敏感性,提示自噬抑制剂或可用于鼻咽癌的辅助治疗。     

miR-34a调控HEK293细胞自噬作用的初步研究

目的探讨miR-34a对HEK293细胞自噬作用的影响。方法采用miR-34a模拟物(模拟物组)和miR-34a抑制剂(抑制剂组)分别转染HEK293细胞,并设空白对照(对照组)。采用定量PCR检测miR-34a、p53基因表达的变化,Western blotting检测自噬相关蛋白LC3Ⅱ及p53表达的变化,并采用生物信息学方法分析miR-34a对自噬相关基因(Atg6/beclin1、sestrin2、FoxO3等)的可能作用。结果定量PCR结果显示,模拟物组miR-34a表达显著上调(P<0.05),抑制剂组miR-34a表达显著下调(P<0.05)。与对照组相比,miR-34a模拟物可显著抑制HEK293细胞LC3Ⅱ蛋白的表达(P<0.05),而miR-34a抑制剂则显著上调HEK293细胞LC3Ⅱ蛋白的表达(P<0.05)。定量PCR和Western blotting结果显示,各组p53mRNA及蛋白表达无统计学差异。生物信息学分析显示,Atg6/beclin1、sestrin2、FoxO3等自噬相关基因是miR-34a潜在的靶基因。结论miR-34a能抑制HEK293的自噬作用,可能是通过直接抑制...     

外源表达miR-34a对H1299细胞辐射敏感性的影响

目的 研究miR-34a对H1299细胞辐射敏感性的影响.方法 采用pre-miR-34a瞬时转染H1299细胞,接受不同剂量(0、2、4、6和8 Gy)γ射线照射后,利用CCK-8试剂盒检测细胞活性.流式细胞术检测细胞凋亡及细胞周期,real-time PCR检测miR-34a靶基因bcl-2、bax、CDK4、CDK6及cyclinD1的表达水平.结果 不同剂量(0、2、4、6和8 Gy)γ射线照射后,与阴性对照转染组相比,pre-miR-34a转染组各剂量点细胞活力明显降低(t=-2.39、-3.12、-4.98、-4.03、-3.06,P＜0.05),并与阴性对照转染组的差值呈剂量依赖性的增加.6 Gyγ射线照射后,与阴性对照转染组相比,pre-miR-34a转染组细胞凋亡率明显增加(t=7.06,P＜0.05),细胞G0/G1期阻滞(t =3.94,P＜0.05),S期细胞减少(t=6.23,P＜0.05),bcl-2、CDK4及CDK6明显下调(t=3.39、12.88、6.21,P＜0.05),cyclinD1有下降趋势,但差异无统计学意义,而bax明显上调(t=-4.35,P＜0.05),是阴性对照转染组的1.94倍,bcl-2/bax比值下降.结论 miR-34促进H1299细胞凋亡,诱导细胞G0/G1期阻滞,抑制细胞活性,进而提高H1299细胞的辐射敏感性.     

回转器模拟微重力对神经细胞自噬的影响(英文)

目的探讨回转模拟微重力对人神经母细胞瘤细胞(SH-SY5Y)自噬的影响。方法利用回转模拟微重力的细胞学效应,回转条件下培养细胞12 h、24 h,相同条件下静置培养细胞作为对照。WesternBlot方法检测LC3蛋白表达变化水平。荧光显微镜观察GFP-LC3点状聚集物,计数含有大于5个GFP-LC3点状聚集物的细胞数量。结果回转组SH-SY5Y细胞LC3-II蛋白表达高于对照组,荧光显微镜检测到GFP-LC3点状聚集物也随之增多。结论回转可以引起SH-SY5Y细胞自噬增多。     

小剂量X射线照射对人树突状细胞抗原递呈及白介素-12分泌的影响

目的 探讨小剂量x射线照射对体外不同培养时间的人外周血树突状细胞( dendritic cell,DC)抗原递呈及白介素-12(IL-12)分泌的影响.方法 分离人外周血单个核细胞(PBMC),以人粒-巨细胞集落刺激因子(GM-CSF)及IL-4等诱导分化成DC.实验分为3组,A组:DC培养至第2天接受X射线照射;B组:DC培养至第6天接受X射线照射,A、B组受照剂量均为0.05、0.1、0.2和0.5 Gy;C组:即对照组,为同期培养的未受X射线照射的DC细胞.各组DC培养至第8天时,以DC致敏T 细胞,CCK-8( cell counting kit-8)法检测混合淋巴细胞反应(mixed lymphocyte reaction,MLR),以评估抗原递呈能力;MTT法检测致敏T细胞杀伤人肺腺癌A549细胞;酶联免疫吸附试验( ELISA)检测DC细胞培养液中IL-12水平.结果 0.2、0.5 Gy照射后的DC抗原递呈能力,A组显著低于对照组(t =2.79和3.71,P＜0.05),B组显著高于对照组(t=3.60和3.11,P＜0.05);检测致敏T细胞对人肺腺癌A549细胞的增殖抑制能力,与对照组相比,A组抑制A549增殖能力减弱(t =2.89和2.91,P＜0.05),B组抑制A549增殖能力明显增强(t=2.91和2.82,P＜0.05);A组IL-12分泌量下降(t=4.44和6.93,P＜0.05),而B组明显上升(t=3.51和4.12,P＜0.05).结论 DC在培养早期阶段接受0.5 Gy以下的X射线照射,会降低抗原递呈能力及致敏T细胞杀伤A549能力,在培养阶段的后期给予此剂量照射则会增强.     

Toll样受体4对肿瘤细胞放射敏感性的影响

目的 观察Toll样受体4(TLR4)对肿瘤细胞放射敏感性的影响.方法 将体外培养的RAW264.7、Lewis、MFC、Hepal-6、B16和NIH3T3细胞各分为假照组和5 Gy照射组,采用流式细胞术检测照射24 h后TLR4表达变化,从中筛选出照射后高表达和低表达TLR4的细胞,将其各自分为TAK242阻滞组、LPS刺激组和空白对照组,采用CCK-8试剂盒检测其增殖活性,用克隆形成实验计算其细胞存活分数,用Annexin V凋亡试剂盒检测其凋亡率,用流式细胞术观察细胞周期进程的变化.结果 5 Gy照射24 h后Lewis细胞TLR4表达水平明显高于照射前(t=-8.68,P＜0.01),MFC细胞则相反,照射后TLR4表达水平明显低于照射前(t=25.80,P＜0.01),而RAW264.7、Hepa1-6、B16细胞的TLR4表达水平比照射前有升高趋势,但无明显差异.5 Gy照射后Lewis和MFC细胞的增殖活性均明显降低(t=57.62、-6.23,P＜0.01),而用TAK242阻滞TLR4后Leiws细胞增殖活性更加降低(t=5.96,P＜0.01),但MFC细胞增殖活性反而明显升高(t=4.16,P＜0.01).5 Gy照射后Lewis和MFC细胞的存活分数均明显降低(t=13.37、19.24,P＜0.01),用TAK242阻滞TLR4后Leiws和MFC细胞存活分数更加降低(t=4.90、4.42,P＜0.05).5 Gy照射后Lewis细胞的凋亡率明显高于假照组(t=-167.85,P＜0.01),阻断TLR4后明显高于单纯照射组(t=-4.73,P＜0.01).照射后MFC细胞的凋亡率升高(t=-26.45,P＜0.01),阻断和激动TLR4其凋亡率均显著低于单纯照射组(t=8.87、-3.05,P＜0.05).Lewis和MFC细胞受照后G0/G1期、S期细胞明显降低(t=8.68、14.80、20.31、4.48,P＜0.01),G2/M期细胞上升(t=-37.48、-13.06,P＜0.01).两种细胞的TAK242阻断组和LPS刺激组各周期进程均无明显变化.结论 Lewis细胞的TLR4高表达与其受照后的增殖活性和凋亡率变化有关,而与其周期进程无关,TLR4影响肿瘤细胞的放射敏感性.     

表没食子儿茶素没食子酸酯对人鼻咽癌CNE-1细胞辐射敏感性的影响

目的 探讨表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)对人鼻咽癌CNE-1细胞辐射敏感性的影响及相关机制.方法 将细胞分为对照组、EGCG单独处理组、UVC或X射线单独照射组,EGCG联合UVC或X射线照射组.四甲基偶氮唑盐(MTT)比色法检测不同浓度EGCG处理24、48和72 h对CNE-1细胞生长的影响,以及EGCG联合紫外线(UVC)及X射线对CNE-1细胞生长的影响.克隆形成实验检测EGCG对CNE-1细胞的放射增敏作用.流式细胞术检测细胞周期变化.Annexin V-FITC法检测细胞凋亡.Western blot法检测相关蛋白表达水平.结果 EGCG可抑制CNE-1细胞的生长,并有剂量·效应关系(r=0.817)和处理时间-效应关系(r=0.364).EGCG在低剂量50μmol/L,预处理2h,可增加CNE-1细胞对UVC和X射线的辐射敏感性.相比于单独照射组,EGCG联合UVC照射组细胞的S期阻滞消失(t=18.68,P＜0.05),sub-G1峰的比例则明显增高(t =6.67,P ＜0.05).而且,Annexin V-FITC检测结果揭示,EGCG联合UVC照射组的细胞中早期凋亡细胞比例显著增加(t=10.28,P ＜0.05).但与单独照射组细胞相比,EGCG联合X射线照射组细胞的S期及G2/M期阻滞更明显(t=7.11和6.99,P＜O.05),无明显的sub-G1峰出现.EGCG联合UVC照射可使凋亡相关蛋白Bax表达增加(t=5.42,P ＜0.05),Caspase-3表达增加(t=4.14,P＜0.05),Bcl-2的表达变化并不明显(t=1.85,P＞0.05),而其联合X射线对于细胞周期相关蛋白Cdc2 p34表达的影响不大(t=1.04,P＞0.05).结论 EGCG可抑制鼻咽癌CNE-1细胞的生长.EGCG与UVC联合损伤作用与促进细胞发生早期凋亡相关,涉及到凋亡相关蛋白Bax和Caspase-3;而EGCG和X射线的联合损伤作用可能与周期阻滞相关.     

神经节苷脂对大鼠脊髓损伤诱导的自噬性神经元死亡的影响

目的 探讨神经节苷脂(monosialotetrahexosy-1 ganglioside,GM1)对脊髓损伤诱导的神经元自噬性死亡的影响. 方法 90只SD大鼠按随机数字表法分为假手术组、等渗盐水组和GM1组,每组30只.等渗盐水组和GM1组采用Allen法建立T10脊髓损伤动物模型,荧光显微镜下观察内源性细胞自噬相关蛋白(LC3)的表达;Western印迹法检测LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值、细胞蛋白(Beclin-1)表达. 结果 与假手术组比较,等渗盐水组LC3表达水平明显上调(P＜0.05):与等渗盐水组比较,GM1组LC3表达水平明显下调,自噬体形成明显减少(P＜0.05).与假手术组比较,等渗盐水组LC3-Ⅱ、Beclin-1表达水平以及LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值均明显上调(P＜0.05);与等渗盐水组比较,GM1组LC3-Ⅱ、Beclin-1表达水平以及LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值均明显下调(P＜0.05). 结论 GM1通过抑制脊髓损伤后自噬性细胞死亡,起到保护神经元作用.     

大剂量γ射线照射对小鼠免疫系统损伤远期影响的研究

目的 探讨亚致死剂量6Gyγ射线一次性全身照射小鼠免疫细胞对脂多糖刺激反应性的远期影响.方法 将实验小鼠分为假照射组和照射组,假照射组不接受照射,照射组给予6 Gyγ射线照射.照射后10周,分别将假照射组和照射组小鼠按组别腹腔注射脂多糖(20 mg/kg),对照组注射等量的生理盐水.分别于24 h和1 h后取材,进行外周血白细胞计数及CD4、CD8、B220细胞比例检测.取脾脏和胸腺称重,计算脏器指数.冲洗单侧股骨进行有核细胞计数.结果 与假照射刘照组小鼠相比,照射对照组小鼠的CD4细胞比例显著升高(t=2.940,P＜0.05),CD8和B220细胞比例显著下降(t=6.485和4.351,P均＜0.01).照射+脂多糖1h组小鼠的CD4 (t=2.510,P＜0.05)、CD8(t=2.862,P＜0.05)和B220(t=7.074,P＜0.01)细胞比例较假照射+脂多糖1h组小鼠显著降低,差异有统计学意义.与假照射+脂多糖24 h组小鼠相比,照射+脂多糖24 h组小鼠单侧股骨有核细胞计数显著升高,差异有统计学意义(t=2.078,P＜0.05).结论 6 Gyγ射线一次性全身照射后10周,小鼠免疫系统尚未完全恢复;与假照射组相比,在接受脂多糖刺激后照射组小鼠胸腺指数和外周血中CD8和B220细胞比例未见显著变化.辐射对小鼠免疫系统损伤的远期影响有待进一步研究.     

DNA依赖性蛋白激酶催化亚基在电离辐射诱发HeLa细胞自噬中的作用

目的：了解DNA依赖性蛋白激酶催化亚基（ DNA-PKcs）在电离辐射诱发细胞自噬中的作用。方法通过慢病毒载体（ pSicoR ）构建DNA-PKcs短发夹RNA （ shRNA ）表达载体,并转染HeLa细胞敲低DNA-PKcs表达。CCK-8实验检测细胞增殖活性及细胞放射敏感性,免疫印迹检测自噬相关蛋白表达,免疫荧光实验检测自噬标志物GFP-LC3的表达。结果成功构建shRNA敲低DNA-PKcs表达的HeLa细胞模型,通过该细胞模型观察到抑制DNA-PKcs蛋白表达导致细胞增殖能力降低、放射敏感性增高。 P62和LC3蛋白表达变化,以及细胞内绿色荧光蛋白（ GFP）-LC3免疫荧光斑检测结果显示,DNA-PKcs基因敲低后,明显增加X射线诱发细胞自噬。抑制DNA-PKcs导致哺乳动物西罗莫司（雷帕霉素）靶蛋白（ mTOR）第2481位丝氨酸磷酸化水平降低。结论抑制DNA-PKcs增强受照射宫颈癌HeLa细胞的自噬及放射敏感性,mTOR信号通路可能参与DNA-PKcs对自噬的调节作用。     

beclin1在辐射诱导的乳腺癌细胞自噬发生中表达的变化

目的 研究不同剂量X射线诱导乳腺癌细胞株MCF-7自噬发生过程中beclin 1表达的变化和作用。 方法 采用实时荧光定量PCR方法检测自噬相关基因MAP1LC3B表达,RT-PCR方法检测beclin 1基因变化,X射线Western blot方法检测beclin 1蛋白表达。结果 MAP1LC3B mRNA量效研究表明,8、16和32 h量效研究均发现表达上调,8、16 h在12 Gy,32 h在8 Gy达到表达峰值,总体表现为表达升高(F =13.831、10.996、17.019, P＜0.05);时程研究表明,2 Gy时程研究发现MAP1LC3B于16 h升高达至峰值(F =16.284, P＜0.01),8 Gy时程研究中32 h升高达至峰值(F =9.030, P＜0.05),12 Gy时程研究中16 h升高达至峰值(F =20.315, P＜0.05)。beclin 1 mRNA量效关系表明,照射后4 h beclin 1在2、4和8 Gy阶段呈剂量依赖增加趋势;8 Gy时间效应关系中发现照射后beclin 1 mRNA的变化呈时间依赖性增加。16 h蛋白量效关系表明,照射后beclin 1表达增加;2 Gy时效关系表明照射后蛋白表达增加。 结论 X射线照射能够诱导乳腺癌细胞株MCF-7发生自噬,beclin 1基因上调表达的变化提示其发挥重要作用。     

60Coγ射线累积照射对大鼠尿液中小分子代谢物的影响

目的 探讨60Co γ射线累积照射对大鼠尿液中小分子代谢物的影响.方法 健康成年雄性SD大鼠10只,用60Co γ射线照射大鼠,累积剂量分别为0、0.2、0.4、0.6、0.8和1.0 Gy,连续照射5d.采用核磁共振(1H NMR)技术,结合主成分分析法(PCA)和偏最小二乘法判别(PLS-DA),分析各累积剂量下大鼠尿液中小分子代谢物的变化.结果 大鼠尿液中的小分子代谢物发生了明显的改变,与对照组相比,0.2～1.0Gy各组乙酸乙酯的相对含量显著降低(t=29.7 ～30.7,P＜0.05),且其相对含量随剂量增加基本稳定(P＞0.05);马尿酸的相对含量增加(t=4.4 ～21.6,P＜0.05),且当累积剂量达到1 Gy时其相对含量显著增加(t=21.6,P＜0.05).三甲胺氮氧化物、牛磺酸、脯氨酸相对含量均比对照组增加(t=3.5～13.4、4.7～11.5和2.9～ 12.7,P＜O.05),且这3种代谢物的相对含量随剂量增加有相同的变化趋势.结论 60Co γ射线累积照射后,尿液中乙酸乙酯、马尿酸、三甲胺氮氧化物、牛磺酸、脯氨酸有可能成为累积照射的辐射损伤标志物.     

丹皮酚对人肺腺癌A549细胞放射增敏作用机制的研究

目的 探讨丹皮酚在体外对人肺腺癌A549细胞放射增敏作用的机制.方法 采取四甲基偶氮唑盐比色法(MTT),测定丹皮酚对人肺腺癌A549细胞的抑制率.分为细胞对照组、单纯加药组、单纯照射组和药物联合照射组.通过克隆形成实验,观察丹皮酚对人肺腺癌A549细胞放射敏感性的影响.采用TUNEL染色与流式细胞仪,检测肿瘤细胞凋亡率,Western blot法观察细胞内Survivin蛋白的表达变化.结果 随着丹皮酚浓度的增加,丹皮酚对人肺腺癌A549细胞的抑制作用相应地增加,IC50为(25.2±2.1)mg/L.经克隆形成实验证实,丹皮酚对人肺腺癌A549细胞有明显的增敏效果,放射增敏比(SER)可达1.29.药物联合照射组的细胞凋亡较单纯照射组明显增加,呈现剂量-时间依赖效应(t =4.95、3.03、3.78、4.59、2.88、3.70和5.54,P＜0.05).同时,Western blot法检测出丹皮酚能够明显下调细胞内Survivin蛋白的表达,单纯给予不同浓度丹皮酚24 h后Survivin蛋白表达下调22.6％ ～ 56.7％(t=4.15、7.30和13.47,P＜0.05);用丹皮酚预处理细胞再经6 GyX射线照射后24 h,细胞内Survivin蛋白下调可达22.2％ ～ 69.4％(t=4.30、8.36和16.34,P ＜0.05).结论 丹皮酚在体外对人肺腺癌A549细胞有放射增敏作用,其机制可能是下调肿瘤细胞内Survivin蛋白的表达.     

低剂量Χ射线诱导NK细胞增殖治疗白血病裸鼠的实验研究

目的 通过NK细胞分离液直接分离得到小鼠NK细胞,探讨低剂量辐射诱导的NK细胞增殖对K562细胞白血病模型是否有杀伤作用.方法 采用流式细胞术和3H-TdR掺人法分别检测低剂量(照射剂量在20 cGy以内的低LET或5 cGy以内的高LET射线)对NK细胞增殖及活性的影响;流式细胞术检测外周血CD13+细胞表达,ELISA法检测外周血TNF-α含量;体内实验观测实验组和对照组NK细胞输入后裸鼠外周血白细胞计数、肝脏、脾脏及肾脏指数等改变.结果 分离得到的NK细胞纯度达(82.54±0.18)%.80 mGy照射后24 h,NK细胞增殖指数达到最高,为(36.31±1.32)%(t=24.69,P＜0.05);低剂量照射后NK细胞杀伤K562活性为(12.59±0.63)%(t=6.63,P＜0.05),其抑制率为29.52%.结论 低剂量辐射诱导的NK细胞增殖输入对裸鼠白血病的发生发展具有明显的抑制作用.

Abstract：

Objective To separate NK cells of mice from NK cell separation medium and study inhibitory effect of proliferated NK cell induced by low dose radiation on the leukemia model of K562 cells.Methods Flow cytometry and 3H-TdR methods were respectively used to measure proliferation index and activity of NK cells treated with low-dose radiation( which means exposure dose in 20 cGy low LET beam or 5 cGy high LET beam).CD13 + cells were measured by flow cytometry and TNF-α content in blood-serum was detected by ELISA.In vivo,peripheral blood leucocyte count,index of liver,indexes of spleen and kidney were observed in control group and experimental group.Results The purity of NK cell separation was (82.54 ± 0.18)%.The proliferation index of NK cells at 24 hours after 80 mGy irradiated was 36.31 ± 1.32% ,(t =24.69,P ＜0.05).Killing activity of NK cell induced by low dose radiation to K562 cell was (12.59±0.63)%(t=6.63,P＜0.05)and the inhibition ratio was 29.52%.Conclusion The injection of proliferated NK cell induced by low dose radiation demonstrated significant inhibitory effect on the growth of leukemia nude mouse.