hVEGFA基因重组腺病毒载体的构建及其转染效率的研究

目的:应用AdEasy复制缺陷型腺病毒载体系统构建携带hVEGFA基因的重组腺病毒载体.方法:采用分子克隆技术,从PCR2.1-hVEGFA质粒中克隆出hVEGFA基因的编码序列,酶切、连接后,插入腺病毒系统中的穿梭载体pAdTrack-CMV,获得重组质粒pAdTrack-CMV-hVEGFA,将其转化含有腺病毒骨架载体pAdeasy-1的大肠埃希菌BJ5183,进行同源重组,获得重组子pAdeasy-1-hVEGFA.鉴定后,将pAdeasy-1-hVEGFA转染人胚肾细胞(HEK293A细胞),获得含hVEGFA基因的重组腺病毒(rAd-hVEGFA).反复感染HEK293A细胞扩增腺病毒,50%组织培养感染量法(TCID50)检测病毒滴度,荧光显微镜观测绿色荧光蛋白(GFP)的表达.结果:成功构建出含有hVEGFA基因的腺病毒载体rAd-hVEGFA,转染HEK293A细胞后出现绿色荧光蛋白表达,证明腺病毒载体rAd-hVEGFA 转染成功,通过反复感染HEK293A细胞获得大量病毒.结论:成功构建含有hVEGFA基因的腺病毒载体rAd-hVEGFA,可为缺血性脑血管疾病的基因治疗提供基因载体.     

hBcl-2和hVEGF165双基因共表达重组腺病毒载体的构建及鉴定

目的构建hBcl-2和hVEGF165双基因共表达的重组腺病毒载体,为后续基因转染和动物实验提供实验基础。方法通过RT-PCR从A549细胞中分别获得hBcl-2和hVEGF165基因片段,并克隆到pMD-19T载体。将目的基因hBcl-2、IRES元件和hVEGF165依次定向克隆到腺病毒穿梭载体质粒pAd-Track-CMV上。线性化重组穿梭质粒后通过电穿孔转化含有腺病毒骨架质粒pAd-easy-1的感受态大肠杆菌BJ5183构建重组腺病毒载体质粒。脂质体转染线性化的重组腺病毒载体质粒于HEK293细胞以包装制备重组腺病毒。重组腺病毒经PCR鉴定之后进一步扩增、纯化。通过荧光计数确定病毒感染滴度。结果克隆的hBcl-2和hVEGF165基因测序正确,酶切重组穿梭载体质粒和腺病毒载体质粒得到特异酶切产物,重组腺病毒载体质粒转染HEK293细胞3 d后观察到GFP的表达,重组腺病毒的PCR得到hBcl-2和hVEGF165基因的PCR产物,滴度测定为5×109pfu/mL。结论成功构建制备了高滴度的hBcl-2和hVEGF165双基因共表达的重组腺病毒载体,为联合基因治疗心肌梗死的研究提供实验基础。     

促血管生成素-1腺病毒表达载体构建及鉴定

目的构建表达促血管生成素-1（Ang-1）的腺病毒载体,为研究Ang-1防治慢性缺血性疾病提供前期基础。方法通过PCR从pMD18-Ang-1质粒中扩增Ang-1基因,酶切连接入载体pDC315-GFP并转化大肠杆菌感受态细胞,PCR鉴定测序分析;借助AdMax腺病毒包装系统实现重组,提取质粒DNA并转染HEK293细胞,观察GFP荧光并以Western Blot检测目的蛋白的表达,以终点稀释法测定病毒滴度。结果重组质粒pDC315-GFP-Ang-1经PCR鉴定阳性克隆,测序分析比对正确,重组腺病毒转染HEK293细胞后可观察到GFP-Ang-1融合蛋白,病毒滴度1×1011PFU/ml。结论成功构建了表达Ang-1基因的腺病毒载体。     

PTG重组腺病毒过表达载体的构建

目的 构建及鉴定携带小鼠PTG基因(NM＿016854)的过表达重组腺病毒载体,为深入研究PTG的功能奠定基础。方法 化学合成小鼠PTG基因的编码序列,经聚合酶链式反应(PCR)扩增、酶切,后插入GV314载体(CMV-MCS-3FLAG-SV40-EGFP),得到重组穿梭质粒pGV314-PTG;进一步BamHⅠ/AgeⅠ双酶切,产物交换入线性化表达载体pDC315,构建重组腺病毒Ad-PTG,将其转染HEK293T细胞包装成重组病毒颗粒,经在HEK293T细胞反复扩增数代后,进行纯化及滴度检测,最后利用PCR、Western blot及测序验证重组腺病毒。结果 经PCR、Western blot及测序后,结果显示成功构建pGV314-CMV-MCS-3FLAG-SV40-EGFP-PTG过表达腺病毒载体(Ad-PTG),终点稀释法测得病毒滴度为4×10¹⁰ PFU/ml, Western blot和荧光定量PCR显示PTG的蛋白和mRNA表达水平显著升高。结论 成功构建携带小鼠PTG基因的重组过表达腺病毒载体,且能有效上调肝细胞中PTG基因的表达。     

人canstatin基因重组腺病毒载体的构建及其病毒制备

目的:利用HEK293细胞内同源重组法构建带有绿色荧光蛋白报告基因的人血管能抑素(canstatin)重组腺病毒载体,扩增并纯化重组腺病毒颗粒.方法:PCR法扩增cansta-tin全长基因,克隆至pGEM-T载体,经酶切和测序证实后,亚克隆到穿梭质粒pAdS-CMV中,获得穿梭质粒pAdS-CMV/canstatin.用PasI酶单独酶切穿梭质粒pad5-CMV/canstatin和腺病毒E3区带有绿色荧光蛋白表达元件的腺病毒骨架载体,采用标准的磷酸钙方法共转染HEK293细胞.7～10 d后收获细胞裂解物,在HEK293细胞中扩增,病毒颗粒经氯化铯密度梯度离心纯化后,分光光度计检测重组病毒滴度.结果:测序证实pEGM-T/canstatin基因片段与GenBank公布的can-statin基因序列一致.重组腺病毒质粒转染293细胞后24 h观察到绿色荧光,病毒纯化后制备出高滴度重组腺病毒(病毒滴度为2.0×1015pt/L).结论:成功构建了表达canstatin基因的重组腺病毒载体并制备了重组腺病毒颗粒,为研究该基因在肿瘤治疗中的作用奠定了基础.     

应用AdEasy腺病毒载体系统构建人GST-π基因的重组腺病毒

目的：利用AdEasy腺病毒载体系统构建人谷胱甘肽转移酶-π（GST-π）基因重组腺病毒并在HEK293细胞中扩增制备重组病毒。方法：从质粒中通过PCR的方法扩增出目的基因GST-π并带有适宜的酶切位点,双酶切后连pAdtrackCMV中构建成腺病毒穿梭质粒pAdtrack-GST-π,经酶切线性化后,采用电穿孔转化到含腺病毒骨架质粒AdEasy1的BJ5183大肠杆菌电感受态细菌中,挑选同源重组质粒AdEasy-GST-π,酶切线性化重组质粒并转染HEK293细胞包装成重组病毒颗粒,荧光显微镜观察绿色荧光表达。重组病毒上清乒乓交互感染HEK293细胞,荧光显微镜观察绿色荧光表达。结果：经限制性内切酶检测和GFP表达证实成功地构建了携带GST-π基因的重组腺病毒载体并制备出高滴度重组病毒。结论：成功地构建了携带GST-π基因的重组腺病毒载体,为利用GST-π基因转染造血干细胞的基因治疗奠定了基础。     

PTEN重组腺病毒载体的构建及其在气道平滑肌细胞的表达

目的 应用pAdxsi载体系统构建携带PTEN基因的腺病毒载体.方法 将PTEN cDNA自载体pcDNA3-PTEN中切出,克隆至穿梭质粒pShuttle-GFP-CMV中,然后与腺病毒质粒pAdxsi在化学感受态细胞DH5α菌株内同源重组,经Pac-Ⅰ线性化后,重组子通过脂质体2000介导转染HEK293细胞,产生有感染能力的腺病毒,并测定其滴度,通过荧光显微镜能观察HEK293细胞内绿色荧光的表达;PCR检测腺病毒载体PTEN mRNA的表达,Western blotting检测PTEN蛋白在气道平滑肌细胞的表达.结果 感染腺病毒载体的HEK293细胞表达GFP随着时间逐渐增强,并且出现明显的细胞病变效应,经过3轮扩增后病毒达到合适的滴度,构建的Ad-PTEN腺病毒滴度为2×1010pfu/ml,PCR扩增后经琼脂糖凝胶电泳证实其表达,Western blotting检测纠腺病毒感染的气道平滑肌细胞内PTEN蛋白表达明显增高.结论 成功构建了携带野生型PTEN腺病毒载体,为进一步研究PTEN基因应用于哮喘治疗提供了实验基础.     

密码子优化的HIV-1型gp120基因重组腺病毒载体疫苗的构建与鉴定

目的 构建密码子优化型gp120基因重组腺病毒载体（rAden-mgp120）,为研发新型HIV预防性疫苗奠定基础.方法 首先利用PCR的方法扩增mgp120基因,将目的基因克隆入载体pENTR/D-TOPO以获得重组穿梭载体克隆pENTR/D-TOPO-mgp120.经过穿梭载体克隆与表达载体（pAd-CMV/VS-DEST）间的重组反应获得表达克隆质粒pAden-mgp120,表达克隆线性化后转染HEK293A包装细胞,得到复制缺陷型重组腺病毒rAden-mgp120.结果 经PCR和测序鉴定,重组载体rAden-mgp120构建正确,转染HEK293A细胞并扩增后获得的病毒滴度为6.8x1011pfu/ml,该重组腺病毒载体能正确表达mgp120蛋白.结论 成功构建了重组腺病毒rAden-mgp120为HIV-1预防奠定了基础.     

虫荧光色素酶报告基因重组腺病毒表达载体的构建与鉴定

目的:构建表达虫荧光色素酶报告基因重组腺病毒载体,为腺病毒中和抗体流行水平的定量检测奠定基础?方法:采用腺病毒表达系统(ViraPower Adenoviral Expression System)构建重组腺病毒表达载体?首先利用PCR的方法扩增虫荧光色素酶基因使其具备特定的CACC接头,以连接?转化?提取质粒等方法克隆入载体pENTR/D-TOPO以获得入门克隆,经PCR及测序鉴定正确后,用重组酶(LR ClonaseTMⅡ Enzyme Mix)进行入门克隆与表达载体(pAd-CMV/V5-DEST)间的重组反应,以获得表达克隆rAd-Luci?表达克隆鉴定后,用限制性内切酶PacⅠ线性化后转染HEK293A包装细胞得到重组腺病毒?经过扩增后,用极限稀释法检测病毒滴度,用Western blot法检测rAd-Luci载体是否能正确表达虫荧光色素酶蛋白,并检测此酶蛋白的功能活性?结果:用PCR的方法扩增到具有CACC接头的虫荧光色素酶基因,其重组入门和腺病毒表达克隆经PCR和测序鉴定构建正确,重组表达克隆转染HEK293A细胞并扩增后获得的病毒滴度为1.8×1011 pfu/ml,此病毒能正确表达虫荧光色素酶蛋白,并且具有较强的功能活性?结论:成功构建了虫荧光色素酶报告基因重组腺病毒载体,为此重组载体用于腺病毒中和抗体的定量检测奠定基础?     

促血管生成素-2过表达重组腺病毒载体的构建

目的 构建小鼠促血管生成素-2(Ang-2)基因过表达重组腺病毒载体.方法 化学合成小鼠Ang-2编码序列,经PCR扩增、鉴定后连接至穿梭质粒.将含目的基因的重组质粒转化DH5α感受态细胞,所得阳性转化子经电泳分析并测序鉴定.将携带目的基因的穿梭质粒与辅助包装质粒共转染人胚肾细胞系HEK293细胞,反复冻融获取重组腺病毒,终点稀释法测定病毒滴度,重组腺病毒转染HEK293细胞并提取蛋白,采用免疫印迹法分析Ang-2蛋白的表达.结果 PCR产物电泳分析可见大小约1.5 kp的特征性条带,基因序列显示测序结果与GenBank提供的Ang-2序列一致,经 HEK293细胞包装后腺病毒滴度为1×108.8 pfu/ml,免疫印迹法分析可见大小57 kD特征性条带,即重组腺病毒可成功表达Ang-2蛋白.结论 Ang-2基因重组腺病毒载体可成功构建.     

促血管生成素-1基因重组腺病毒载体的构建及鉴定

目的构建携带小鼠促血管生成素-1(Ang-1)基因的重组腺病毒载体并鉴定。方法化学合成小鼠Ang-1基因经PCR扩增后亚克隆至穿梭质粒,重组质粒转化感受态细胞,所得转化子经PCR电泳分析并测序鉴定,携带外源基因的腺病毒穿梭质粒与携带腺病毒大部分基因组的辅助包装质粒共转染人胚肾细胞系HEK 293细胞,反复冻融获取重组腺病毒,终点稀释法测定重组腺病毒滴度,所得腺病毒转染293T细胞48 h收集培养上清,通过Western Blot分析Ang-1蛋白的表达。结果 PCR产物电泳分析可见大小约1.5 kbp的特征性条带,测序结果显示基因序列与Gen Bank提供的Ang-1序列一致,经HEK293细胞包装后腺病毒滴度为1×109pfu/ml,转染293T细胞后培养上清Western Blot分析可见大小58 k D特征性条带,即转染后能分泌正确大小的重组Ang-1蛋白。结论 Ang-1基因重组腺病毒载体可成功构建,为进一步研究Ang-1蛋白对造血干细胞动员及血管新生的作用提供实验依据。     

大鼠ACE2腺病毒载体的构建及其在INS-1细胞中的表达

目的构建携带大鼠血管紧张素转化酶2(angiotensin-converting enzyme 2,ACE2)基因的重组腺病毒表达载体并确定其对INS-1细胞的感染效率。方法采用RT-PCR方法,从大鼠肾脏组织中扩增出ACE2基因的全长cDNA序列,将ACE2基因定向克隆到穿梭质粒载体pShuttle-GFP-CMV,经与腺病毒骨架质粒pAdxsi载体同源重组后得到携带大鼠ACE2基因的重组腺病毒(pAdxsi-GFP-CMV-ACE2),采用PCR的方法对重组腺病毒进行鉴定,转染HEK293细胞进行包装和扩增,氯化铯密度梯度离心法纯化,半数组织培养感染剂量(50%tissue culture infective dose,TCID50)方法测定重组腺病毒的滴度。体外转染INS-1细胞,绿色荧光观察绿色荧光蛋白(GFP)和Western blotting检测ACE2蛋白的表达。结果克隆得到大鼠ACE2基因,经PCR鉴定和测序证实结果正确,成功构建得到高滴度的重组腺病毒,并能高效感染INS-1细胞。结论成功构建了表达ACE2的复制缺陷型重组腺病毒,为深入研究ACE2基因在胰岛细胞中的生物学功能提供了一定的工作基础。     

小鼠CD200基因重组腺病毒载体的构建及鉴定

目的：构建携带小鼠 CD200 基因的重组腺病毒载体,并鉴定其在小鼠胰腺内皮细胞（mile sven 1,MS1）中mCD200基因的表达情况。方法：mCD200 基因亚克隆至腺病毒穿梭质粒pYr-adshuttle-4,获得重组质粒 pYr-ads-4-mCD200。从该重组质粒上利用LR（attL×attR）特异性同源重组的方法,将 mCD200 表达框构建至腺病毒骨架质粒pAd/PL-DEST上,获得的重组腺病毒质粒经PacⅠ酶切,转染HEK293细胞,包装成重组腺病毒rAd-4-mCD200,并用酶切和PCR等鉴定。采用TCID 50（tissue cell infectious dosage 50,TCID50）法测定重组腺病毒滴度。同时在HEK293细胞中进行病毒扩增,并感染小鼠内皮细胞MS1,通过荧光显微镜、real-time PCR检测MS1中小鼠CD200基因的表达。结果：PCR鉴定重组腺病毒证实重组腺病毒rAd-4-mCD200 构建成功;扩增后检测病毒滴度约为109~1010 pfu/ml;荧光显微镜及real-time PCR检测发现该重组腺病毒能在MS1细胞中高效的表达。结论：构建的重组腺病毒 rAd-4-mCD200在MS1细胞中成功表达mCD200基因,为下一步开展关于CD200 基因免疫抑制调节等相关研究奠定了基础。     

细菌内同源重组构建携带人DMT1基因的重组腺病毒

目的 利用细菌内同源重组法构建携带二价金属离子转运蛋白1(DMT1)编码基因的重组腺病毒.方法 应用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)从人胚近段小肠中获取人的全长DMT1-IRE的cDNA,亚克隆至腺病毒穿梭质粒pAdTrack-CMV中,形成转移质粒pAdTrack-CMV-DMT1-IRE,在感受态大肠杆菌BJ5183内与腺病毒骨架质粒pAdEasy1同源重组,利用卡那霉素抗性平板初步筛选重组质粒阳性克隆,经PacⅠ酶切鉴定和PCR鉴定获得到重组腺病毒载体pAdEasy1-DMT1-IRE.线性化的重组质粒转染HEK293细胞,获得高滴度的重组腺病毒.结果 RT-PCR反应扩增出1 841 bp的片段,重组质粒阳性克隆pAdEasy1-DMT1-IRE经PacⅠ酶切后获得一大于20 kb的大片段和4.5 kb的特征性片段,PCR鉴定扩增出DMT1的片段,证明重组腺病毒质粒中已成功插入目的 基因DMT1-IRE.转染293细胞后细胞表达GFP荧光,显示293细胞稳定表达外源性的DMT1-IRE基因.结论 携带DMT1-IRE基因的重组腺病毒质粒构建成功,获得高滴度的重组腺病毒,为DMT1基因进一步功能的研究提供基础.     

人HIF-1α基因重组腺病毒的构建与鉴定

目的 构建人缺氧诱导因子-1α(HIF-1α)基因的重组腺病毒载体,并观察其对HepG2细胞的转染情况.方法 采用基因工程技术,经过亚克隆将人HIF-1α基因片段克隆至穿梭质粒pAdTrack-CMV上,利用pAdEasy系统进行细菌内同源重组后,经脂质体转染HEK293细胞,进行重组腺病毒的包装、扩增.采用PCR方法对重组腺病毒进行鉴定,利用穿梭质粒中带有绿色荧光蛋白GFP报告基因,进行病毒滴度的测定和对HepG2细胞感染效率的监测.结果 酶切鉴定及PCR结果证明重组腺病毒载体成功,人HIF-1α重组腺病毒滴度达1.15×1010 pfu/ml,阴性对照腺病毒的滴度为8×1010 pfu/ml,并对HepG2细胞具有很强的感染力.结论 应用细菌内同源重组法成功构建了含人HIF-1α基因的重组腺病毒载体.     

应用AdMax载体系统构建SCL基因重组腺病毒表达载体

目的 用AdMax载体系统构建人SCL基因重组腺病毒载体,为研究SCL基因对ICC样细胞功能恢复奠定基础.方法 采用PCR方法从含人SCL基因质粒中扩增SCL基因,连接到腺病毒穿梭质粒的多克隆位点上,构建重组穿梭质粒pDC315-EGFP/SCL,在脂质体介导下与腺病毒辅助大质粒pBHGlox(delta)E1、3Cre共转染293细胞,包装产生复制缺陷型重组腺病毒pDC315-SCL经HEK293细胞扩增,纯化后测定病毒滴度.结果 PCR结果和Western blotting检测证实pDC315-SCL重组腺病毒载体构建成功,滴度达到1×1010 PFU/mL.结论 AdMax载体系统可成功构建pDC315-SCL重组腺病毒载体.     

CXCR4-siRNA重组腺病毒载体沉默人卵巢癌细胞株CXCR4基因表达的研究

目的:研究CXCR4-siRNA重组腺病毒载体对人卵巢癌细胞株SKOV3的CXCR4基因表达的影响.方法:Pac Ⅰ酶切CXCR4-siRNA重组腺病毒载体使其线性化,应用HEK293细胞大量包装扩增病毒,收集病毒液,转染人卵巢癌细胞株SKOV3.细胞分为3组:siRNA组,转染空病毒载体的阴性对照组,细胞不做任何处理的空白对照组.通过PCR、Western blot、免疫组化检测CXCR4基因沉默效果.结果:包装扩增后病毒滴度为6×108 PFU/ml,荧光显微镜下可观察到SKOV3细胞中绿色荧光蛋白的大量表达,重组腺病毒能够有效抑制SKOV3细胞中CXCR4的表达.结论:CXCR4-siRNA重组腺病毒载体可高效转染靶细胞和沉默CXCR4基因的表达,为RNA干扰技术应用于卵巢癌的临床基因治疗奠定基础.     

人S100 A9重组腺病毒载体的构建和鉴定

目的制备人S100A9(hS100A9)重组腺病毒载体,为进一步研究人S100A9蛋白的分子生物学作用奠定基础。方法从pHAHA-hS100A9中PCR扩增hS100A9片段,亚克隆至穿梭质粒pAdTrack-TOX,获得重组穿梭质粒pAdTrack-TOX-hS100A9。酶切、聚合酶链反应(PCR)及测序鉴定正确后经PmeⅠ酶切电转入AdEasier感受态细胞,获得重组腺病毒质粒pAdhS100A9,该质粒经PacⅠ酶切后由脂质体转染至HEK293细胞中包装扩增重组腺病毒并进行滴度测定,最后通过PCR及蛋白印迹法(Western blot)鉴定重组腺病毒。结果正确扩增出hS100A9基因;重组穿梭质粒pAdTrack-TOX-hS100A9均及重组腺病毒质粒pAdhS100A9构建成功,并在HEK293细胞中成功包装且扩增后滴度为1 010 I U/mL;重组腺病毒AdhS100A9在HEK293细胞中成功转录和表达。结论用pAdEasy系统成功构建hS100A9重组腺病毒载体,为探讨其生物学作用奠定了基础。     

人白细胞介素21基因重组复制缺陷型腺病毒的制备与鉴定

目的 制备表达绿色荧光蛋白的含人白细胞介素21(IL-21)基因的重组复制缺陷型腺病毒,为IL-21基因治疗肿瘤的研究奠定基础.方法 从人外周血淋巴细胞提取总RNA,经RT-PCR扩增IL-21基因片段,PCR产物和pDC316-mCMV-EGFP载体分别经限制性内切酶Notl与HindⅢ双酶切,然后将酶切产物连接、转化,构建pDC316-IL21-EGFP重组质粒.重组质粒经酶切和测序鉴定后,与腺病毒骨架质粒pBHGlox_E1,3CreF35共转染293细胞,包装产生Ad5F35-IL21-EGFP重组腺病毒,并测定病毒滴度.观察Ad5F35-IL21-EGFP腺病毒转染后食管癌细胞EC-9706的生长曲线和细胞周期的变化.结果 pDC316-IL21-EGFP重组质粒经酶切和测序证实,IL-21基因片段正确插入pDC316-mCMV-EGFP栽体中且与GenBank中,IL-21基因序列一致.AdSF35-IL21-EGFP重组腺病毒栽体在293细胞中包装成功.获得成熟的病毒颗粒,经鉴定有IL-21基因和绿色荧光蛋白的表达.测得Ad5F35-IL-21-EGFP病毒颗粒滴度为9×1011VP/ml,感染性滴度为5×1010IU/ml.AdSF35-IL21-EGFP转染后,EC-9706细胞的生长缓慢(P＜0.05),G1期细胞增加,而G2期和S期细胞减少.结论 成功制备了表达绿色荧光蛋白的人IL-21基因的重组腺病毒,且病毒滴度较高.腺病毒介导的外源性IL-21基因可有效转染EC-9706细胞,并对其生长有抑制作用.     

热休克蛋白70重组腺病毒载体的构建及鉴定

目的 构建人热休克蛋白70(HSP70)的腺病毒表达载体,为进一步研究HSP70对应激状态下细胞的保护作用提供实验基础.方法 采用AdEasy系统构建携带外源性HSP70编码基因的重组腺病毒载体pAd-HSP70,脂质体法转染人胚肾293细胞,包装产生重组腺病毒vAdvHSP.收获病毒进行滴度鉴定, RT-PCR方法检测目的 基因在Hela细胞的转录表达.结果 PCR、序列测定以及限制性酶切证实HSP70基因正确插入腺病毒表达载体,并在HEK293细胞中包装出重组腺病毒;荧光显微镜下可观察到GFP的表达,收获病毒的滴度为3.2×1012 U/L.结论 成功构建pAd-HSP70重组腺病毒表达载体,且重组腺病毒在Hela细胞能有效转录.