细菌活的非可培养状态研究

综述了细菌活的非可培养状态的导致原因、生物学特性、检测及复苏方法,通过对活的非可培养状态的研究,使相关研究人员更加深刻的了解和认识活的非可培养状态下的细菌特性,从而对非可培养状态病原菌的防控起到积极的作用。通过细菌VBNC状态的综述进而对益生乳酸菌VBNC状态的研究提出新的思路,以解决乳酸菌发酵剂工业化生产中所面临的问题。     

细菌的活的非可培养状态及其研究进展

细菌的活的非可培养状态是指细菌具有生物活性和毒性,但用常规培养法检测不出来的一种特殊生理状态。由于这种状态在特定条件下可以复苏,将培养出来和致病,所以研究细菌的活的非可培养状态对正确地评价食品的卫生状况,改进检验方法具有重要的意义。本文介绍了细菌进入活的非可培养状态的各种诱导因素;活的非可培养状态细菌的生理特征;已研究的能进入活的非可培养状态的细菌种类;细菌的活的非可培养状态的检测方法;最后阐述了进行细菌的活的非可培养状态研究的重要意义。     

细菌活的非可培养状态的研究现状及发展趋势

微生物是危害食品质量安全的重要因素。细菌活的非可培养状态的概念提出,对于微生物学、食品质量安全、水质管理、流行病学等方面,都有重大意义。对细菌活的非可培养的研究现状及发展趋势进行了综述。     

细菌活的非可培养状态的分子生物学检测技术研究进展

许多细菌在不良环境下能进入活的非可培养状态(viable but nonculturable state,VBNC)。细菌培养技术常常造成VBNC状态的细菌漏检,应用分子生物学检测技术可以提高VBNC细胞的阳性检出率。针对VBNC细胞的分子生物学检测技术,基于细菌特异性DNA分子、mRNA分子是目前常用的检测方法,而利用报告基因(如绿色荧光蛋白基因)检测VBNC细胞是一种有效的方法。最近利用叠氮溴乙锭 (ethidium monoazide bromide,EMA)或者叠氮溴化丙锭 (propidium monoazide,PMA)联合PCR技术选择性抑制细菌死细胞扩增,该方法结合了EMA(PMA)选择渗透性和PCR特异性,作为一种区分细胞死活的方法,可以有效检测细菌VBNC细胞。     

细菌的活性的非可培养状态及其研究进展

细菌的活性的非可培养状态是指细菌具有生物活性的毒性,但用常耕检测不出来的一种特殊生理状态。由于这种状态在特定条件下可以复苏,将培养出来和致病,所以研究细菌的活的非可培养状态对正确地评价食品的卫生状况,改进检测方法具有重要的意义。本文介绍了细菌入活的非可培养状态的各种诱导因素;活的非培养状态细菌的生理牲;已研究的能进入活的非可培养状态的细菌种类;细菌的活的非可培养状态的检测方法;最后阐述了进行细菌的     

物理场加工中细菌活的非可培养状态相关研究进展

物理场加工技术是一类使用加热、加压和辐射等物理学方法的技术, 其中热加工、超声波、超高压和紫外辐照等技术已被广泛应用于食品加工。近年来多个报道显示, 在物理场加工中细菌可进入活的非可培养状态(viable but non-culturable, VBNC)。VBNC状态指微生物为了适应逆境而进入的一种特殊休眠状态, 在合适条件下能复苏, 甚至可能依然保持致病能力, 这提示我们应该对物理场加工食品的微生物安全予以高度重视。本文主要综述了物理场加工中食源性致病菌和腐败菌VBNC状态的研究进展, 并从共性机制的角度出发分析其形成原因。本文旨在为更好的应用物理场加工技术并保障食品安全提供新思路和新方向。     

金黄色葡萄球菌活的非可培养状态的诱导和复苏

研究金黄色葡萄球菌活的非可培养状态(viable but non-culturable state,VBNC)的诱导和复苏方法。采用不同pH、温度、盐度、不同浓度的食品防腐剂山梨酸钾处理进行诱导;复苏则采用了直接升温处理、添加液体培养基升温处理、添加酵母液升温处理、添加吐温升温处理的方法。结果表明,经过不同温度和山梨酸钾诱导后的金黄色葡萄球菌进入了VBNC状态;其中诱导时间最短(76d)的条件是0.5mmol/L山梨酸钾、-20℃寡营养条件;采用BHI培养基升温的方法,以及添加0.5%和1%的吐温20和吐温80的培养液升温方法使进入VBNC状态的金黄色葡萄球菌得到复苏。VBNC状态的金黄色葡萄球菌在形态上发生了变化;复苏后的菌株除尿素酶阴性外,其他代谢特征均与标准菌株相同。     

金黄色葡萄球菌活的非可培养状态的诱导和复苏

研究金黄色葡萄球菌活的非可培养状态（viable but non-culturable state,VBNC）的诱导和复苏方法。采用不同pH、温度、盐度、不同浓度的食品防腐剂山梨酸钾处理进行诱导;复苏则采用了直接升温处理、添加液体培养基升温处理、添加酵母液升温处理、添加吐温升温处理的方法。结果表明,经过不同温度和山梨酸钾诱导后的金黄色葡萄球菌进入了VBNC状态;其中诱导时间最短（76d）的条件是0.5mmol/L山梨酸钾、-20℃寡营养条件;采用BHI培养基升温的方法,以及添加0.5%和1%的吐温20和吐温80的培养液升温方法使进入VBNC状态的金黄色葡萄球菌得到复苏。VBNC状态的金黄色葡萄球菌在形态上发生了变化;复苏后的菌株除尿素酶阴性外,其他代谢特征均与标准菌株相同。      

茶多酚影响肠道菌群活的非可培养状态(VBNC)状态转变的研究

以代表性的肠道致病菌为研究对象,利用茶多酚干预其正常生长状态,促进进入活的非可培养状态(VBNC),该文对此进行了系列研究。通过在0³.0%浓度范围内调节茶多酚剂量,发现2.5%浓度的茶多酚溶液能达到最大抑菌效果。还研究了在0.6%3.0%浓度范围内调节茶多酚剂量,发现2.5%浓度的茶多酚溶液能达到最大抑菌效果。还研究了在0.6%¹.2%浓度梯度的茶多酚诱导下,细菌由正常生活状态进入VBNC状态所需的时间,随着茶多酚浓度的升高由25 d减少为15 d,最后用扫描电镜观察,发现沙门氏菌VBNC状态的个体形态相对于正常状态平均皱缩了0.3μm。另外,通过监测生长曲线发现,2.0%茶多酚在抑制肠道致病菌生长且延迟其进入对数生长期的同时,提高了益生菌67%的生长效率。研究结果证明,茶多酚对调节肠道菌群的生长起到了积极的作用,该研究为深入利用茶多酚在食品发酵生产和保健食品开发方面提供了理论基础。     

植物乳杆菌活的非可培养状态的初步研究

利用16S rDNA序列分析法测得实验室保藏的乳酸菌的16S rDNA序列,并与基因库中基因序列进行同源性比较,经鉴定此菌为植物乳杆菌。并研究了植物乳杆菌进入活的非可培养状态（Viable but Non-culturable,VBNC）的诱导条件和复苏条件。结果显示,在诱导条件为MRS液体培养基、pH5.5～6.2、温度-20℃和有氧环境时,植物乳杆菌在12d之后进入了VBNC状态;复苏条件为添加有6%吐温-80的MRS液体培养基和普通MRS液体培养基分别在48h和96h之内可以使VBNC的植物乳杆菌复苏。      

两种卫生指标菌在瓶装水中 “活的非可培养状态”的研究

在瓶装水的微生物指标检测中,大肠菌群通常作为微生物污染的指标菌。研究发现,经低温或Cu2+ 诱导可使大肠杆菌进入“活的非可培养状态”,这种状态下的大肠杆菌,在国家标准检测方法提供的培养基上不会出现菌落,检测结果为阴性。同时对另一种革兰氏阳性致病菌金黄色葡萄球菌进行研究,发现其同样存在非可培养状态,证明了现阶段的检测方法,将会造成该状态下微生物的直接漏检。在“活的非可培养状态”的复苏实验中,发现过氧化氢酶和吐温20 可以使处于非可培养状态中的两种细菌在短时间内实现复苏,重新具有可培养性。     

牛奶发酵过程中阪崎克罗诺杆菌可形成活的非可培养状态

该研究以保加利亚乳杆菌为牛奶发酵剂,研究了牛奶发酵过程中阪崎克罗诺杆菌与保加利亚乳杆菌的相互作用以及阪崎克罗诺杆菌存活量的变化情况,并结合16S rDNA高通量测序技术和PMA-qPCR方法分析阪崎克罗诺杆菌在牛奶发酵过程中是否形成“活的非可培养”状态。结果显示,保加利亚乳杆菌在牛奶中发酵48 h后pH值可达到3.40,酸度值可达212.00。在发酵前期接种阪崎克罗诺杆菌,48 h后pH值和酸度值分别为3.50和193.30;在发酵中期接种阪崎克罗诺杆菌,48 h后pH值和酸度值分别为3.47和214.30。发酵前期阪崎克罗诺杆菌的污染对保加利亚乳杆菌发酵结果的影响更大。阪崎克罗诺杆菌在牛奶中生长48 h后菌浓度可稳定在9.08 lg(CFU/mL);不论在牛奶经发酵前期或中期接种阪崎克罗诺杆菌,发酵后期平板计数法均检测不到阪崎克罗诺杆菌,但16s rDNA和PMA-qPCR技术均可检测到阪崎克罗诺杆菌活菌的存在。该研究结果说明,阪崎克罗诺杆菌在牛奶发酵后进入了“活的非可培养”状态,该状态的存在会导致该菌检测时活菌数量的低估,从而引发乳及乳制品的安全隐患。     

金黄色葡萄球菌活的非可培养状态复苏及PMA-qPCR检测

为研究金黄色葡萄球菌活的非可培养（VBNC）状态的复苏问题,采取温度、盐度和酸度3个因素复合诱导制备VBNC菌,尝试四种复苏方法,并以荧光定量PCR和PMA-qPCR技术结合的方法进行检测。结果证明：8%无菌Tween80可以使VBNC状态金黄色葡萄球菌48 h后复苏,同时PMA-qPCR能够有效检出VBNC状态金黄色葡萄球菌,克服传统平板计数法对于VBNC菌的漏检。     

毒素-抗毒素系统对微生物活的非可培养状态形成的影响研究进展

毒素-抗毒素（toxin-antitoxin,TA）系统广泛存在于微生物中,由稳定的毒素和不稳定的同源抗毒素组成,参与应激反应并可调控微生物生长。活的非可培养（viable but non-culturable,VBNC）状态是某些微生物在不良环境中形成的一种休眠状态,处于VBNC状态的微生物在常规培养基上不生长,但VBNC细胞仍具有代谢活性,且在适宜条件下能够恢复可培养性,因此VBNC状态的食源性致病菌对食品安全和人类健康构成潜在威胁。本文综述了TA系统和微生物VBNC状态形成关系的研究,进一步提出了TA系统对微生物VBNC状态形成的可能影响机制,以期为VBNC状态形成机制的研究提供一定参考。     

Induction of Viable but Nonculturable State in Beer Spoilage Lactic Acid Bacteria

Strong beer spoilage strains Lactobacillus lindneri DSM 20692 and Lactobacillus paracollinoides JCM 11969^T were repeatedly subcultured in degassed beer and their culturability on MRS agar was examined. As a result, the two strains were found to show decreased culturability, suggesting that the prolonged contact with beer reduces the culturability of beer spoilage lactic acid bacteria (LAB). After 30 subcultures in degassed beer, both strains were subjected to sublethal heat treatment. As a consequence, L. lindneri DSM 20692 and L. paracollinoides JCM 11969^T were no longer detectable on MRS agar despite the presence of 460 viable cells, indicating that the viable but nonculturable (VNC) states were induced for both strains. Problematically, the heat treated VNC strains were shown to exhibit beer spoilage ability, suggesting that spoilage incidents can occur without detection by culture media. It was also shown that, once acquired, the VNC states are stably maintained in beer without further heat treatment. These results suggest the possibility that beer spoilage LAB strains remain hidden in pitching yeast and work‐in‐process products without detection. Furthermore L. lindneri DSM 20692 and L. paracollinoides JCM 11969^T in VNC states were successfully stored at ?80°C with 10% dimethyl‐sulfoxide as a cryoprotectant and reconstituted in degassed beer without losing VNC characteristics. Taken together, these findings show that valuable bioresources can be acquired from culturable beer spoilage LAB strains and maintained for long‐term storage as frozen culture stocks.     

啤酒腐败有害片球菌生物被膜形成活的不可培养状态研究

有害片球菌是啤酒酿造环境中较为常见且危害较大的腐败菌。作者比较了啤酒腐败有害片球菌生物被膜和浮游细胞进入活的不可培养（VBNC）状态的能力差异。将5种有害片球菌的浮游细胞和生物被膜细胞在啤酒中于26 ℃下进行培养,结果发现,生物被膜细胞和浮游细胞均可以被诱导进入VBNC状态,但形成VBNC状态的时间有所不同。生物被膜细胞进入VBNC状态至少需要70 d,而浮游细胞进入VBNC状态的时间为126~189 d。作者还用单叠氮丙啶与PCR相结合来扩增16S rDNA和horA基因,以证实生物被膜中VBNC细胞的存在。另外,与浮游细胞相比,生物被膜细胞对0.025 mol/L NaOH具有更强的抵抗力,而VBNC状态生物被膜又比同样状态下的浮游细胞具有更强的耐受力。综上所述,在啤酒酿造过程中,相比于浮游细胞,有害片球菌生物被膜在低pH、高浓度的啤酒花苦味物质、乙醇等压力条件下更易被诱导进入VBNC状态,而且还拥有更强的碱耐受力。     

应用拉曼光谱对比分析德式乳杆菌保加利亚亚种ND02及其VBNC态细胞成分

采用扫描电子显微镜、单细胞拉曼光谱技术对比分析德氏乳杆菌保加利亚亚种ND02（Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus ND02）正常及其非可培养态（viable but non-culturable,VBNC）细胞的表观形态和细胞内部大分子化合物的变化。扫描电子显微镜结果显示,与正常细胞相比,德氏乳杆菌保加利亚亚种ND02的VBNC态细胞变短、变粗,且细胞表面发生褶皱;VBNC态细胞的拉曼光谱与正常细胞差异显著,主要集中在1 673、1 650、1 459、1 030、1 005 cm－1等处的12 个峰,主要反映细胞内蛋白质、核酸等生物大分子变化,结果表明德氏乳杆菌保加利亚亚种ND02在诱导进入VBNC态时可能通过调整核酸、脂类和蛋白质适应不利环境的影响;研究结果也证实拉曼光谱技术可以在单细胞水平上对德氏乳杆菌保加利亚亚种ND02及其VBNC态细胞内大分子物质进行无损、无标记检测分析。     

德氏乳杆菌保加利亚亚种ND02活的非可培养态诱导和复苏

为有效提高乳酸菌发酵剂菌种在生产和应用过程中的活性,对一株具有优良发酵特性的德氏乳杆菌保加利亚亚种ND02(保加利亚乳杆菌ND02)进行了活的非可培养(viable but non-culturable,VBNC)态诱导和复苏的初步研究。将活化的保加利亚乳杆菌ND02在不同复合条件下进行诱导,同时采用平板计数法和荧光显微镜两种计数方法对其进行检测,将诱导成功的样本通过改变温度及改变培养基成分进行复苏实验。结果表明:保加利亚乳杆菌ND02在液体MRS中4℃诱导190 d便可以进入VBNC态,并发现10%脱脂乳+0.1%酵母粉是有效的复苏方法。为保加利亚乳杆菌ND02在应用过程中避免VBNC态的产生及活性的提高提供一定的参考依据。     

生食三文鱼源活的非可培养状态副溶血弧菌诱导C57BL/6J小鼠肠道炎性损伤

本实验探究生食三文鱼中活的非可培养（viable but non-culturable,VBNC）状态副溶血弧菌（Vibrio parahaemolyticus,Vp）对小鼠的致病力。采用VBNC-VpRS1分离株和Vp17802毒力株分别灌胃C57BL/6J小鼠,连续观察小鼠感染72 h内行为变化,测定其疾病活动指数（disease activity index,DAI）评分、Vp定植量、肠道损伤、紧密连接蛋白表达和细胞因子水平。结果显示,VBNC-VpRS1组小鼠出现感染症状较Vp17802组延迟6 h;VBNC-VpRS1组和Vp17802组小鼠DAI评分、Vp结肠定植量和促炎因子水平高度显著或极显著高于对照组（P＜0.001、P＜0.01）,结肠长度、抗炎因子及紧密连接蛋白表达量显著低于对照组（P＜0.01、P＜0.001、P＜0.05）,且伴有结肠组织结构缺损、出血积液和中性粒细胞浸润;VBNC-VpRS1结肠定植和病理损伤程度高于Vp17802（P＜0.05）,而抑制肠屏障功能和促进炎症反应弱于Vp17802（P＜0.05）。综上可知,VBNC-VpRS1能够在小鼠体内复苏并具有较强的结肠黏附性和侵袭力,VBNC状态Vp严重威胁机体健康,应纳入生食海产品检测范围。