蝮蛇(Agkistrodon halys Pallas)蛇毒类凝血酶的研究——Ⅰ.分离提纯及理化、酶学性质的鉴定

(1)浙江产蝮蛇蛇毒中含有三种具有精氨酸酯酶活力的组分。它们分别是激肽释放酶、类凝血酶及类溶血纤维酶。其中类凝血酶的精氨酸酯酶活力最高,约占总酯酶活力的60%。(2)提纯后的类凝血酶在聚丙烯酰胺凝胶电泳上呈一条区带。经凝胶过滤及SDS 聚丙烯酰胺凝胶电泳测定,其分子量约43,000。氨基酸组成分析表明含有较多的酸性氨基酸及脯氨酸,此外还含有约6%的中性糖,9%的己糖胺及3.3%的唾液酸。(3)类凝血酶能直接使血纤维蛋白原凝聚,水解BAEE 的活力约是胰蛋白酶的2.7倍,K_(?)为3.4×10~(-4)M,高于其它已知的蝮亚科蛇毒类凝血酶活力。它不作用于BANA、BAPA 及其它蛋白底物。蛇毒类凝血酶与人凝血酶一样,对专一萤光底物Boc-Val-Pro-Arg-MCA 都有明显活力,但其凝结血纤维蛋白原的活力却远低于人凝血酶。(4)类凝血酶能被DFP 及PMSF 所抑制,但抑制速度缓慢,不能被胰蛋白酶的专一抑制剂TLCK 所抑制,因而是专一性很强的丝氨酸蛋白酶。     

蝮蛇(Agkistrodon halys Pallas)蛇毒类凝血酶的研究——Ⅱ.类凝血酶对纤维蛋白原的作用方式

许多蝮亚科蛇毒中含有类凝血酶。它们和蛇伤引起的毒理作用有密切关系。由于它对纤维蛋白原的作用特点,在临床上已被用作抗凝剂治疗血管阻塞性疾病。此外,它也被用来研究纤维蛋白的聚合机制。     

浙江蝮蛇(Agkistrodon halys Pallas)蛇毒激肽释放酶Ⅰ的分离纯化及其性质的研究

浙江产蝮蛇(Agkistrodon halys Pallas)蛇毒中含有激肽释放酶,不需活化即可水解激肽原,释放激肽,并具有较弱的精氨酸酯酶的活力。粗毒经DEAE纤维素(DE-22,DE-52)和Sephadex G-75分离纯化后,可得到两个激肽释放酶的组分:Ⅰ与Ⅱ,二者电泳行为与酶活力有所不同,激肽释放酶Ⅰ在聚丙烯酰胺凝胶电泳中呈一条带,而组分Ⅱ中还杂有少量组分Ⅰ。激肽释放酶Ⅰ为一糖蛋白,含糖量20.3%,约由221个氨基酸残基组成,凝胶过滤和SDS电泳测定其分子量分别为31,000和30,000。此酶具有严格的底物专一性,能作用于激肽释放肽的专一底物Z-Phe-Arg-MCA及Bz-Pro-Phe-Arg-PA,不作用于一般蛋白质底物酪蛋白,对TAME的水解速度仅是对BAEE的14%。以BAEE为底物时,其最适pH为8～9,K_m值为2.85×10~(-4)M。本文测定了不同pH和不同温度下酶的稳定性,pH低于5或大于9,温度在40℃以上,酶活力迅速下降。其精氨酸酯酶及激肽释放酶的活力均能被丝氨酸蛋白酶抑制剂PMSF和DFP所抑制,两者呈平行关系,但都不被胰蛋白酶的专一抑制剂TLCK所抑制,慈菇抑制剂与大豆(Kunitz)抑制剂对此酶有部分抑制作用。经磷酸纤维素等阳离子交换树脂层析或交联的慈菇抑制剂Sepharose-4B亲合层析也能提纯激肽释放酶Ⅰ,但提纯后精氨酸酯酶活力下降,激肽释放活力几乎全部丧失。经圆二色光谱测定表明,酶的构象已发生改变。     

江浙蝮蛇(Agkistrodon halys Pallas)蛇毒神经生长因子的分离纯化和特性

神经生长因子（ｎｅｒｖｅ ｇｒｏｗ ｔｈ ｆａｃｔｏｒ, Ｎ Ｇ Ｆ）是第一个被发现,也是迄今为止研究得最为清楚的一种神经营养因子 利用 Ｐ Ｃ１２ 细胞生物活力测定为跟踪检测手段,分别经过 Ｃ Ｍ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｃ Ｌ ６ Ｂ、 Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ ７５ 及 Ｆ Ｐ Ｌ Ｃ ｍ ｏｎｏ Ｓ层析,从３０ ｇ 江浙蝮蛇粗毒中分离纯化到２００ μｇ Ｎ Ｇ Ｆ,纯化倍数高达１０５经 Ｓ Ｄ Ｓ Ｐ Ａ Ｇ Ｅ 测定,该蛋白分子量为 ２６ ｋ Ｄ,由两个亚基通过二硫键交联组成二体形式等电聚焦显示其等电点为６７,与氨基酸组成分析结果相吻合 江浙蝮蛇神经生长因子的生物活力水平与小鼠２５ Ｓ Ｎ Ｇ Ｆ相当,在１～１００ μｇ／ Ｌ 的浓度范围内维持 Ｐ Ｃ１２ 细胞在无血清条件下的存活     

浙江产蝮蛇Agkistrodon halys(Pallas)蛇毒磷酸二酯酶的酶学性质及其对大分子核酸的作用

1.以双对硝基苯磷酸钠为底物,测得蝮蛇毒磷酸二酯酶的最适pH在10左右,最适温度在60℃左右;酶在37℃和60℃的Km分别为5.65×10~(-4)M和7.97×10~(-4)M。 2.酶在pH5—10.5范围和50℃以下稳定。 3.钙离子和镁离子对酶活力有激活作用,但钡离子、镁离子、锌离子、二价铅离子、钴离子、二价和三价铁离子、锰离子、镍离子等都有不同程度地抑制作用。 4.除乙酸根离子外,碳酸根,硫酸根,乙二胺四乙酸根、磷酸根,钼酸根,酒石酸根,柠檬酸根,亚硝酸根,巴比妥酸根和硫代硫酸根等阴离子都有不同程度地抑制作用。 5.蝮蛇毒磷酸二酯酶能充分水解RNA和DNA但后者的水解速度比前者快许多。     

蝮蛇(Agkistrodon halys Palls)蛇毒类凝血酶的研究——Ⅱ.类凝血酶对纤维蛋白原的作用方式

许多蝮亚科蛇毒中含有类凝血酶。它们和蛇伤引起的毒理作用有密切关系。由于它对纤维蛋白原的作用特点,在临床上已被用作抗凝剂治疗血管阻塞性疾病。此外,它也被用来研究纤维蛋白的聚合机制。     

蛇毒的研究与利用——Ⅳ.浙江产蝮蛇(Agkistrodon halys Pallas)蛇毒的柱层析分离及磷酸二酯酶的大规模纯化

应用二乙胺基乙基葡聚糖A-50和盐浓度梯度洗脱的方法,对浙江产蝮蛇毒进行了柱层析分离,获得14个蛋白峰,测定了磷酸二酯酶、磷酸单酯酶、5'-核苷酸酶、蛋白水解酶、氨基酸酯酶、L-氨基酸氧化酶、磷脂酶A、出血毒素、抗凝血活酶组份以及血纤溶酶样物质在蛋白质峰中的分布。介绍了一种大规模制备磷酸二酯酶的简便、经济的纯化方法,对用这种方法制备的酶制剂的某些主要质量标准进行了分析鉴定并与国外同类产品进行了比较,该酶用于人工合成核糖和脱氧核糖寡核苷酸的顺序分析获得了较为满意的结果。     

蝮蛇Agkistrodon halys Pallas蛇毒纤溶酶对纤维蛋白质的作用

应用SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳的方法证明蝮蛇毒纤溶酶对人体纤维蛋白原的α(A)链和β(B)链都有作用。借助酸性聚丙烯酰胺凝胶电泳观察到人纤维蛋白原经蝮蛇毒纤溶酶水解后,产生一系列分子量大小不等的碎片X′、Y′、D′和E′。     

浙江产蝮蛇(Agkistrodon halys Pallas)蛇毒抗凝血活酶组份抗凝机理的研究

应用三次离子交换柱层析和一次凝胶过滤从浙江产蝮蛇毒中分离纯化了抗凝血活酶组份。测定出该组份由119个氨基酸残基组成,分子量为15,000道尔顿,等电点为9.4,N—末端为组氨酸。 纯化的抗凝血活酶组份在体外对血浆重钙化时间有显著影响,但不延长血浆凝血酶原时间和凝血酶时间,对纤维蛋白也无溶解作用,极低浓度（0.5微克/毫升）的抗凝组份就能抑制血液凝血活酶的生成。家兔静脉注射抗凝血活酶组份后十分钟,全血凝固时间和血浆重钙化时间均明显延长,但血浆凝血酶原时间、纤维蛋白含量和全血凝块溶解时间却不受影响。 蝮蛇毒抗凝血活酶组份具有磷脂酶A_2活性,但血浆中磷脂的水解似乎并不是血浆凝固延迟的主要原因,很可能是抗凝血活酶组份能够同血浆中凝血活酶组份（磷脂部份）可逆地结合,从而干扰了凝血酶原的活化。     

浙江蝮蛇(Agkistrodon halys Pallas)毒激肽释放酶Ⅰ酶解产物激肽的鉴定

至今已知的蛇毒激肽释放酶作用于激肽原后都释放舒缓激肽,仅食鱼蝮(Agkistrodon piscivorus piscivorus)蛇毒激肽释放酶既释放舒缓激肽,又释放胰激肽(Iwanaga,1979)。今对浙江蝮蛇毒激肽释放酶Ⅰ作用于激肽原后的产物作了鉴定,证实也是舒缓激肽。因此蝮蛇毒激肽释放酶不同于哺乳动物的组织激肽释放酶,后者释放胰激肽(Fiedler,1979)。     

中国蝮蛇(Agkistrodon halys Pallas)蛇毒中舒缓激肽增强肽的研究

1.中国浙江产蝮蛇(Agkistrodon halys Pallas)蛇毒中至少含有两种以上的舒缓激肽增强肽,对其中之一的组分进行了分离提纯,经鉴定为11肽,N 端为环谷,其氨基酸组成与日本蝮蛇(Agkistrodon halys bromhoffii)蛇毒中舒缓激肽增强肽的组分A 极相似,仅多一个脯氨酸。2.豚鼠回肠纵行肌中含有能使舒缓激肽降解的各种激肽酶,经鉴定其中包括有氨肽酶,激肽酶Ⅰ及其他肽酶,但不具有激肽酶Ⅱ的活力,它们都属于含金属的外切酶,经邻二氮菲处理后活力不可逆地丧失。3.豚鼠回肠纵行肌经邻二氮菲处理后,其所含的激肽酶活力虽丧失,但对舒缓激肽增强肽的效应却仍保留,这说明在体外舒缓激肽增强肽的效应与激肽酶的活力无关。     

浙江产蝮蛇(Agkistrodon halys Pallas)蛇毒抗凝血活酶组份对凝血系统的作用

通过二乙氨基乙基葡聚糖A-50柱层析,从浙江产蝮蛇毒中得到一个抗凝血活酶组份。这一组份在体外显著地延长血浆复钙时间和凝血酶原时间,但不延长凝血酶时间,对纤维蛋白也无溶解作用。低浓度的抗凝组份就能干扰血液凝血活酶生成和抗组织凝血活酶。家兔静脉注射抗凝组份,全血凝固时间、血浆复钙时间、凝血酶原时间和凝血酶时间均显著而短暂地延长,纤维蛋白原浓度也会突然下降至原来的20％,而优球蛋白溶解时间始终大于24小时,没有缩短现象。     

蛇毒的研究和利用——Ⅲ.浙江产蝮蛇Agkistrodon halys Pallas蛇毒对凝血系统的作用

用体外和体内试验方法研究了浙江产蝮蛇毒对凝血系统的作用。实验结果表明,浙江产蝮蛇毒中至少含有两种抗凝组份——抗凝血活酶组份和胞浆素样物质。     

蛇毒的研究和利用——Ⅲ.浙江产蝮蛇 Agkistrodon halys Pallas 蛇毒对凝血系统的作用

用体外和体内试验方法研究了浙江产蝮蛇毒对凝血系统的作用。实验结果表明,浙江产蝮蛇毒中至少含有两种抗凝组份——抗凝血活酶组份和胞浆素样物质。     

浙江产蝮蛇(Agkistrodon halys Pallas)蛇毒纤溶组份对凝血系统的作用

用二乙氨基乙基葡聚糖A-50两次柱层析及葡聚糖凝胶过滤,从浙江产蝮蛇毒中得到一个纤溶组份。体内外试验研究表明,这一纤溶组份对纤维蛋白和纤维蛋白原均有显著的溶解作用,它也作用于第Ⅷ凝血因子和第V凝血因子。浙江产蝮蛇毒纤溶组份的这些性质与血浆素(纤维蛋白溶酶)相似,因而是一种血浆素样物质。     

江浙蝮蛇(Agkistrodon halys Pallas)毒的抑菌作用及其抑菌组分L-氨基酸氧化酶的分离纯化

我们用平皿测活法研究了江浙蝮蛇毒对真菌和大肠杆菌生长的抑制作用，并对其抗细菌的组分进行柱层析分离纯化，得到组分单一的LAO不仅有抑菌作用还有L-氨基酸氧化酶的活性。纯化后LAO的比活力为808U／mg。蛇毒经酸性聚丙烯酰胺电泳后测抑菌活性发现有3个抑菌组分(Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ)，LAO为抑菌组分Ⅱ。     

蛇岛产蝮蛇(Agkistrodon halys pallas)蛇毒的柱层析分离及各组分的生理活性测定

应用二乙氨基乙基葡聚糖A—50(DEAE-Sephadex A—50)和盐浓度直线梯度洗脱的方法,对蛇岛产蝮蛇毒进行了柱层析分离,获得16个蛋白峰,并对柱层析的各组分进行了致死活性、出血活性、徐缓激肽释放活性及7种酶活力的测定。     

浙江蝮蛇(Agkistrodon halys Pallas)蛇毒中舒缓激肽增强肽的研究——Ⅱ.舒缓激肽增强肽组分Ⅰ结构与功能的关系

1.浙江蝮蛇毒冻干粉的70%甲醇提取液,经Sephadex G-15层析柱,可分离出三个舒缓激肽增强肽的组分。对其中BPP_1的结构进行了测定,其氨基酸顺序为: (?)GIu·Gly·Arg·Pro·Pro·Gly·Pro·Pro·Ile·Pro·Pro 2.研究了BPP_1结构与功能的关系。当用焦谷氨肽酶移去BPP_1 N末端的焦谷氨酸残基时,对舒缓激肽的增强效应反而升高一倍左右;此后随着逐步进行Edman降解,活力也随之下降,但降解至C末端三肽时,生物活力仍保留约90%,至C末端二肽时,活力就骤然丧失。对BPP_1C末端用羧肽酶Y水解时,一小时后活力降低二分之一。这些部说明,BPP_1 C末端结构的完整,是其生物活力所必需的。     

浙江蝮蛇(Agkistrodon halys Pallas)蛇毒中舒缓激肽增强肽的研究 Ⅱ.舒缓激肽增强肽组分Ⅰ结构与功能的关系

1.浙江蝮蛇毒冻干粉的70%甲醇提取液,经Sephadex G-15层析柱,可分离出三个舒缓激肽增强肽的组分。对其中BPP_1的结构进行了测定,其氨基酸顺序为: -Glu·Gly·Arg·Pro·Pro·Gly·Pro·Pro·Ile·Pro·Pro 2.研究了BPP_1结构与功能的关系。当用焦谷氨肽酶移去BPP_1N末端的焦谷氨酸残基时,对舒缓激肽的增强效应反而升高一倍左右;此后随着逐步进行Edman降解,活力也随之下降,但降解至C末端三肽时,生物活力仍保留约90%,至C末端二肽时,活力就骤然丧失。对BPP_1C末端用羧肽酶Y水解时,一小时后活力降低二分之一。这些都说明,BPP_1C末端结构的完整,是其生物活力所必需的。     

浙江产蝮蛇毒(Agkistrodon halys pallas venom)凝血酶样酶的性质及其对血凝和血脂的影响

从浙江产蝮蛇毒中分离出一种凝血酶样酶,该酶能明显地延长全血凝固时间,白陶土部分凝血活酶时间(KPTT),并降低了血浆中的纤维蛋白原水平,同时全血的比粘度和血浆的比粘度及血清中的胆固醇和β脂蛋白均有所下降.该酶不激活凝血因子ⅩⅢ.