三种致病弧菌感染对大黄鱼非特异性免疫功能的影响

溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)、哈维氏弧菌(Vibrio harveyi)、副溶血弧菌(Vibrio parahaemolytic-us)是引起大黄鱼(Pseudosciaena crocea)溃疡病的3种主要致病菌.将试验大黄鱼随机分成4组,分别腹腔注射哈维氏弧菌、溶藻弧菌、副溶血弧菌和灭菌生理盐水,在感染后的不同时间采样,通过白细胞数量、白细胞分类计数、NBT阳性细胞数量以及溶菌酶活力的变化趋势来探讨3种致病弧菌感染对大黄鱼非特异性免疫功能的影响.结果表明,大黄鱼各项血液指标的变化主要发生在感染后的1～7 d.在人工感染的初期,各实验组大黄鱼外周血的白细胞数量、NBT阳性细胞数量呈现先增加后降低的趋势,淋巴细胞、嗜中性粒细胞百分比显著降低(p<0.05),单核细胞百分比显著提高(p<0.05);随着时间的延长,白细胞数量开始下降;淋巴细胞、嗜中性粒细胞百分比有所上升,7 d以后各类血细胞数量变化不显著.其中哈氏弧菌感染组在白细胞数量、NBT阳性细胞数量等多个指标上的变化最为明显.血清中溶菌酶活性显著高于脾组织,鱼体受感染后两者溶菌酶活性均较对照组有显著提高,不同致病菌与大黄鱼非特异性免疫功能之间呈现一定的时效差异.研究认为反映鱼体受感染后从应激反应发生至非特异性免疫功能的发挥主要发生在病原菌感染前期,不同致病菌与大黄鱼非特异性免疫功能之间呈现一定的时效差异.     

盐度骤降胁迫对大黄鱼血清生化组分的影响

以大黄鱼(Larimichthys crocea)为研究对象,通过研究急性低盐度胁迫对大黄鱼血清生化组分的影响,评估盐度骤降引起鱼体的应激反应。急性低盐度(15、8)胁迫下,在72h的实验周期中,大黄鱼血清葡萄糖(GLU)含量整体显著下降(P<0.05);血清总蛋白(TP)、白蛋白(ALB)及球蛋白(GLB)含量在15盐度胁迫下呈波动变化,与对照组相比无显著性差异(P>0.05),8盐度胁迫下,TP含量呈显著下降后逐渐升高趋势;血清甘油三酯(TG)和总胆固醇(CHOL)含量在15盐度胁迫下均在初始阶段显著变化后逐渐恢复至对照组水平,而8低盐胁迫后二者含量均在实验后期(48 h和72 h)大幅度显著升高;血清中的丙氨酸氨基转移酶(ALT)和天门冬氨酸氨基转移酶(AST)含量在低盐胁迫下均显著高于对照组水平,且呈现出盐度相关性。研究结果表明,急性低盐胁迫会引起鱼体应激反应,实际生产中应避免养殖环境盐度的剧烈变化。     

盐度对日本鳗鲡生长及非特异性免疫酶活性的影响

利用实验生态学和酶学方法,在浙江省海洋水产养殖研究所清江试验场研究了盐度对平均体长为25．1±5．6cm的日本鳗鲡（Anguillajaponica）生长及其血清溶茵酶（LZM）、超氧化物歧化酶（SOD）及碱性磷酸酶（AKP）活性的影响,实验持续60d．实验设置了5个盐度梯度（盐度5、10、15、20、25）和对照组（盐度0）,每梯度设3个平行组,各组盐度和pH值保持一致．日本鳗鲡血清中免疫酶活力指标：碱性磷酸酶、溶茵酶、超氧化物歧化酶在实验的第7天和第14天测定．实验结果表明,盐度5组相对增重率最高（279．78％±28．37％）,其次是盐度10组（278．74％±22．25％）,盐度15、20、25组相对增重率分别为234．39％±21．28％、230．28％±26．31％、228．01％±29．29％．对照组相对增重率为233．20％-4-25．18％,盐度5和10组与对照组差异显著（P〈0．05）,其余各组与对照组差异不显著．第7天和第14天,盐度10组碱性磷酸酶活性最高,分别为225．05U／dm。和251．11U／dm’,其次是盐度5组,分别为221．76U／dm。和236．01U／dm。,显著高于对照组（P〈0．05）．第7天和第14天盐度20、25组溶菌酶活性显著高于对照组（P〈0．01）．超氧化物歧化酶随着盐度的升高呈逐步上升趋势．第14天,盐度20、25纽溶菌酶活性仍保持较高水平,SOD回落至对照组水平,而各组AKP较第7天略有上升．     

急性低盐度胁迫对可口革囊星虫存活、Na+/K+-ATP酶及磷酸酶活力的影响

为探讨低盐度急性胁迫对可口革囊星虫(Phascolosoma esculenta)的影响规律,研究可口革囊星虫对急性低盐度胁迫的响应机制,本试验先通过急性毒性试验确定可口革囊星虫96 h内对低盐度的耐受范围,再选取96 h最小死亡率盐度,研究该盐度急性胁迫下可口革囊星虫(平均体质量0.85±0.07 g)体质量、体壁含水量、Na~+/K~+-ATP酶活力以及酸碱磷酸酶活力在96 h内的动态变化。结果表明:在本试验盐度3.0～7.0范围内,可口革囊星虫24 h的最大死亡率盐度是3.0,可口革囊星虫96 h的最小死亡率盐度为7.0;可口革囊星虫死亡率随盐度降低逐渐升高,但相同盐度下随着时间延长,可口革囊星虫死亡率基本不变,可口革囊星虫96h内能耐受的最低盐度是7.0;在低盐度7.0胁迫下,可口革囊星虫体质量和体壁含水量在12 h内显著增大(P0.05),12 h后趋于平稳(P0.05);Na~+/K~+-ATP酶活力也在6 h内显著升高至最大值(P0.05),6 h至12h又显著降低(P0.05),此后稳定在高于对照组水平;酸性磷酸酶和碱性磷酸酶活力变化趋势与Na~+/K~+-ATP酶活力类似,均是先显著升高(P0.05)后显著降低(P0.05),最后稳定在高于对照组水平。以上研究表明,可口革囊星虫能够通过Na~+/K~+-ATP酶、酸碱磷酸酶等渗透和免疫相关的生理调节机制,迅速响应低盐度环境,其对低盐度有很强的适应力和耐受力。     

长蛸的盐度耐受性及盐度胁迫对其血细胞和体内酶活力的影响

通过控制暂养水体盐度,用盐度突变与盐度渐变2种方法测定长蛸的盐度耐受性.测定了长蛸血细胞密度、各类血细胞数量比例以及各种酶的活力几组数据,并分析其血细胞与体内酶活力的变化.结果表明：长蛸的生存盐度范围为7.0~30.3,适宜盐度范围为16.3~27.3,最适盐度范围为18.3~24.3,对盐度的适应范围较广,有利于长蛸大规模养殖的开展.在盐度胁迫下,长蛸血细胞密度,各种血细胞数量比例均发生显著改变,长蛸个体也随着胁迫加大变得越来越不适应,出现喷墨、休克、甚至死亡,这表明长蛸的免疫机能降低.无论在低盐度还是高盐度胁迫情况下,受渗透压的影响,长蛸肌体大量吸水和失水,呼吸作用减弱,体内供氧降低,导致长蛸体内有氧呼吸降低和无氧呼吸提高,于是催化有氧呼吸的LDH酶活力降低.同时,细胞内与免疫和消化相关的细胞器由于细胞吸水或失水作用功能受到影响,保护酶（SOD、POD、CAT）、磷酸酶（ACP、AKP）和消化酶（蛋白酶和脂肪酶）的活力均呈下降趋势.由此可见,盐度胁迫对长蛸的影响是显著的.     

大黄鱼FcRs基因的克隆及其在免疫应答中的初步功能分析

Fc受体（Fc Receptors,FcRs）是一类与免疫球蛋白的Fc段特异性结合,介导多种免疫反应的受体分子。本研究克隆得到了大黄鱼（Larimichthys crocea）6个FcRs基因,分别是LcFcγRⅠL、LcFcγRⅡ、LcFcγRⅡaL、LcFcγRⅢ、LcFcRL5和LcFcRLA,其开放阅读框（ORF）大小分别为1 070、2 486、1 145、 1 955、4 125、1 659 bp。大黄鱼的6个LcFcRs都具有一个信号肽和2~8个免疫球蛋白（Ig）结构域,LcFcγRⅡ、LcFcγRⅢ和LcFcRL5还包含一个跨膜区。实时荧光定量PCR结果显示LcFcγRⅠL、LcFcγRⅡ、LcFcγRⅡaL和LcFcγRⅢ主要在鳃或肠等黏膜组织中表达,而LcFcRL5和LcFcRLA主要在脾和头肾等系统免疫组织中表达;革兰氏阴性细菌细胞壁脂多糖（LPS）刺激后,这6个LcFcRs基因头肾和脾脏中的表达在不同时间出现了显著上调;双链RNA病毒类似物Poly(I:C)刺激后,6个LcFcRs在头肾和脾脏中的表达出现不同程度的上调,而LcFcRL5在脾脏中的表达显著上调,在头肾中则明显下调,提示大黄鱼FcRs可能在LPS和Poly(I:C)诱导的免疫反应中起着重要但又不同的作用。     

不同盐度胁迫对坛紫菜叶状体生理指标的影响

以坛紫菜(Pyropia haitanensis)Z-61叶状体为材料,检测了高盐(110)胁迫与低盐(0)胁迫处理不同时间(0、4、8、24h和恢复4h)后叶状体中的羟自由基(·OH~-)清除能力、过氧化氢(H_2O_2)含量、丙二醛(MDA)含量、超氧阴离子(O_2~-·)含量、超氧化物歧化酶(SOD)活性、过氧化氢酶(CAT)活性、抗坏血酸过氧化物酶(GSH)活性以及叶绿素荧光参数[包括PS II最大光化学效率(Fv/Fm)、表观光合电子传递效率(ETR)、非光化学荧光猝灭系数(NPQ)、实际光合作用效率Y(II)]的变化,以探究坛紫菜叶状体对不同盐度海水的耐受机制.结果表明,在高盐和低盐胁迫下,H_2O_2的含量和·OH~-的清除能力随时间增加而呈现逐渐上升的趋势,而O_2~-·的含量在胁迫4h显著升高后无显著变化.且相比于高盐(110),低盐(0)胁迫下坛紫菜叶状体会产生更多H_2O_2、O_2~-·和·OH~-,膜脂过氧化物丙二醛(MDA)含量增加更明显,说明低盐胁迫引起坛紫菜叶状体的氧化损伤要显著高于高盐胁迫.高盐胁迫24h后,SOD的活性达到了最大,CAT、抗坏血酸过氧化物酶(APX)、谷胱甘肽(GSH)的活性均呈现先上升后下降的变化趋势.低盐胁迫下,SOD、GSH的活性均不断增加,CAT、APX的活性先上升后下降.此外,低盐和高盐胁迫下,随时间的增加,叶绿素荧光参数均明显下降.上述结果表明,高盐和低盐胁迫下,坛紫菜叶状体的光合作用受到抑制,机体通过维持较高的抗氧化酶活性以提高活性氧的清除能力,进而保证藻体的正常存活.     

盐胁迫对番茄同工酶基因表达的影响

分析了普通番茄（Lycopersicumesculentum）在NaCl胁迫下酯酶（EST）和过氧化物酶（PRX）同工酶的变化，考察了盐胁迫对10个同工酶位点21个等位基因在特定组织中表达的影响。发现许多EST和PRX等位基因在盐胁迫下表达，产生盐诱导同工酶；另有些等位基因的表达受盐抑制，它们在盐胁迫下的表达活性显著减弱或消失。实验表明，EST和PRX同工酶表达的变化与番茄对盐胁迫的遗传适应性有密切关系。     

低盐胁迫后两种龙须菜(Gracilariopsis lemaneiformis)叶绿素荧光特征的对比分析

以龙须菜981品种和其绿色突变型为材料, 运用叶绿素荧光分析技术, 比较低盐胁迫(盐度28和22)下二者光合生理的差异。研究结果证实, 在正常状态下, 龙须菜绿色突变型具有较高的光能利用效率(α)、最大相对电子传递速率(r_ETRmax)、半饱和光强(I_k)和光性能指数(P_Iabs), 表明其光合性能优于龙须菜981。在2种低盐条件下培养3 d, 盐度28处理后, 龙须菜981的最大相对电子传递速率下降了20.4%, 而龙须菜绿色突变型无显著变化, 表明盐度28可使龙须菜981的光合活性减弱。在盐度22培养3 d后, 龙须菜981的最大光量子产量(F_V/F_m)下降幅度高达16.0%, 而龙须菜绿色突变型的下降幅度为11.9%; 龙须菜981电子传递的量子产额(φ_EO)下降了20.3%, 而龙须菜绿色突变型则无显著变化; 另外, 盐度22处理后, 龙须菜981的光能利用效率和最大相对电子传递速率分别下降31.5%和22.1%, 下降幅度均高于龙须菜绿色突变型, 这表明龙须菜绿色突变型光合活性对低盐胁迫的耐受性高于龙须菜981。     

盐度胁迫对小黄鱼(Larimichthys polyactis)抗氧化酶、非特异性免疫酶和Na+/K+-ATP酶活力的影响

为了研究不同盐度对小黄鱼生理的影响,以人工养殖的4月龄小黄鱼(体质量为(12.6±3.1)g)为实验对象,将在自然海水(对照组盐度为22.1)中养殖的小黄鱼转入到盐度为5(低盐组)和34.5(高盐组)的海水中进行急性盐度胁迫处理10 d,测定并分析肝脏中超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)、碱性磷酸酶(AKP...     

Isolation and characterization of polymorphic microsatellite loci in large yellow croaker, Larimichthys crocea

An (AC)n-microsatellite-enriched library for Larimichthys crocea was constructed in this study. Primers for fifty simple sequence repeat (SSR) loci were synthesized and genotyped on 30 L. crocea individuals from Guanjingyang wild population (WP) in Fujian Province and 38 individuals from Ningbo cultured population (CP) in Zhejiang Province. Only 21 loci were successfully amplified and polymorphic in two populations. In WP, the observed heterozygosity (H_O ) ranged from 0.233 to 0.900 and the expected heterozygosity (H_E ) ranged from 0.326 to 0.893, with an average of 7.8 alleles/locus, the polymorphism information content (PIC) ranged from 0.283 to 0.866 (mean 0.731). In CP, the H O ranged from 0.189 to 0.892 and the H E ranged from 0.333 to 0.800, with an average of 4.4 alleles/locus. The probability test showed significant departures from HWE in 9 and 2 of the 21 loci in WP and in CP, respectively. Deficiency of heterozygotes at four loci showed the presence of null alleles (P <0.01). The PIC of 20 microsatellite loci in WP were greater than 0.50. Overall, these novel markers are potentially useful for the study of population genetics, construction of genetic linkage and quantitative trait loci maps in large yellow croaker.     

大黄鱼肝脏免疫保护蛋白的鉴定

本研究以大黄鱼(Larimichthys crocea)肝脏为研究对象,采用比较蛋白质组学技术分析大黄鱼免疫保护后蛋白表达水平的变化。结果发现,对照组和免疫保护组中共有20个表达水平差异显著的蛋白点,经MALDI-TOF-MS分析,获得18个差异蛋白点肽质量指纹图谱(peptide mass fingerprint,PMF),通过数据库查询,与免疫型受体、新型抗原受体等蛋白具有高度同源性。在此基础之上,进一步选取4个蛋白差异点(1、10、14和18号)进行Westen blot验证。结果表明,该4个蛋白差异点可以与所制备的抗体发生特异性的结合,且变化趋势与蛋白质组学分析结果一致。由此推测,免疫型受体等18个蛋白应该与大黄鱼免疫保护密切相关,所获研究结果为揭示大黄鱼免疫保护机理奠定了良好的基础。     

大黄鱼抗菌肽hepcidin-like的抗菌和抗寄生虫活性分析

近年来,我国重要经济鱼类大黄鱼（Larimichthys crocea）遭受了严重的海水白点病的感染,造成了巨大的经济损失。海水白点病是由体外寄生虫刺激隐核虫（Cryptocaryon irritans）感染引起,不仅能引起被感染鱼类生理的破坏,还能够引发二次细菌感染。有报道指出一些抗菌肽（antimicrobial peptides）具有抗刺激隐核虫的活性。大黄鱼hepcidin-like（命名为Lc-HepL）是从刺激隐核虫感染大黄鱼后的比较转录组中挖掘到的一个差异表达基因。本研究中,在基因和蛋白水平上分析了该抗菌肽的生物活性。刺激隐核虫感染后,qRT-PCR检测到Lc-HepL在鳃、肌肉、肝脏、头肾、肠道和脾脏6种组织中显著上调,并且上调的时间点出现在幼虫感染阶段、滋养体脱落阶段和二次细菌感染阶段,结果显示Lc-HepL在抗刺激隐核虫和二次细菌感染的免疫反应中发挥重要作用。在体外成功诱导并纯化的重组Lc-HepL（rLc-HepL）对某些病原菌具有剂量和时间依赖性的强抗菌活性。本研究首次探究了rLc-HepL的抗刺激隐核虫活性,显微观察结果显示其能引起幼虫细胞膜破裂、内容物外泄,该结果首次提供了大黄鱼hepcidin-like具有强抗刺激隐核虫活性证据。研究数据表Lc-HepL很可能是大黄鱼抗刺激隐核虫感染的一种重要的先天免疫因子,具有应用到未来的药物中的潜力。     

大黄鱼选育群体与普通养殖群体部分免疫指标的比较

以本课题组选育的“闽优1 号”及未经选育的普通大黄鱼(Larimichthys crocea)养殖群体为研究对象, 比较了两者的白细胞吞噬活性、血清溶菌酶活性、杀菌活力、白蛋白及免疫球蛋白含量、血清及血细胞超氧化物歧化酶(SOD)活性等免疫指标的差异。结果表明: 选育的“闽优1 号”大黄鱼血清溶菌酶和血细胞SOD 活力显著高于对照组(P<0.05), 而血清中的免疫球蛋白含量低于普通养殖群体。在病原菌攻毒后8 d 内, 选育群体累积死亡率显著低于非选育群体, 提示非特异性免疫在大黄鱼抗病免疫的早期阶段可能起着重要作用。     

大黄鱼脊椎骨及其早期发育研究

为完善大黄鱼(Larimichthys crocea)的骨骼生物学特性和以脊椎骨为数量性状的新品种选育提供理论依据,作者统计了大黄鱼成鱼脊椎骨骨节数量性状,并采用软骨—硬骨双染色方法对其成体及5～40日龄仔稚幼鱼脊椎骨骨节的发育过程进行观察,并对骨节数量和生长进行统计分析.结果表明:统计成体48尾中,骨节数主要是26,...     

中国近海大黄鱼和日本带鱼群体数量变动及其资源保护措施探讨

作者根据长期调查研究,分析了大黄鱼(Larimichthys crocea)和日本带鱼(Trichiurus japonicus)群体数量变动的因果关系,并提出了加强我国海洋渔业资源科学监管的建议:(1)正确划分大黄鱼和带鱼地理种群及其产卵群体,为资源繁殖保护提供参考依据;(2)修订若干《渔业法》条款,重新审定《官井洋大黄鱼繁殖保护区管理规定》;(3)充分合理开发利用闽东渔场近海岛屿周边海域,并且采用抗风浪升降式圆柱形深水养殖网箱养殖大黄鱼;建立内湾性官井洋大黄鱼海洋牧场渔业基地,并新建中国著名舟山渔场大黄鱼繁殖保护区;(4)继续加强大黄鱼原种场建设,大力开展大黄鱼良种选育研究,每年提供大批量野生大黄鱼人工培育的原种子一代幼鱼进行增殖放流;(5)巩固和扩大伏季休渔效果,全年禁止违法而严重损害带鱼幼鱼资源的各种张网作业;(6)以法治渔,加快制定符合于我国实情的海洋渔业科学监管的有效措施.     

大黄鱼cGAS-like基因isofrom X1的克隆鉴定及在感染刺激隐核虫后的表达变化

cGAS(cyclic GMP-AMP synthase)基因是近几年来新发现的先天免疫中一个新型的信号分子。作者基于大黄鱼(Larimichthys crocea)基因组信息,用cDNA末端快速扩增(RACE)技术在鳃组织中克隆鉴定了cGAS基因cDNA全长序列:包含1个231 bp的5′端-非翻译区(5′-UTR)、207 bp的3′-UTR和1 488 bp的开放阅读框(ORF),命名为Lc-cGAS-like X1。该基因编码1个由495个氨基酸残基组成的多肽,预测的分子量(Mw)大小为56.57kDa,理论等电点(pI)为9.45;序列分析表明其预测的蛋白无信号肽,第115～431位氨基酸序列为Mab-21功能域,第470～492位氨基酸序列为跨膜结构域。基因组全长3 153 bp,包含8个外显子和7个内含子,所有内含子的剪切特点都符合GT-AG规则。同源比对结果显示:Lc-cGAS-likeX1与鱼类cGAS的相似性大于66%,与高等脊椎动物的相似性较低。系统进化分析表明Lc-cGAS-like X1与鱼类cGAS聚成一支。荧光定量PCR(qPCR)检测显示Lc-cGAS基因(X1/X2两种剪切体)在大黄鱼9种组织中均有表达,其中在鳃中的表达量最高;刺激隐核虫感染后,大黄鱼免疫器官头肾中Lc-cGASmRNA分别在刺激隐核虫幼虫感染阶段和滋养体脱落阶段出现了极显著上调(P0.01);解毒器官肝脏中分别在滋养体脱落阶段和细菌感染阶段出现极显著上调变化(P0.01)。本研究结果暗示大黄鱼cGAS基因参与了大黄鱼感染刺激隐核虫的免疫防御过程,为进一步了解鱼类cGAS基因的多样化功能提供参考。