单细胞cDNA的制备及扩增

目的建立微量细胞的基因表达分析系统,解决细胞全基因组表达模式分析和同质细胞材料获取困难之间的矛盾。方法挑取单细胞直接进行逆转录,随后以１个含有ｏｌｉｇｏ（ｄＴ）的通用引物进行序列非依赖性的ｃＤＮＡ扩增并检测其代表性。结果从单个ＨＬ－６０细胞中成功地扩增了全ｃＤＮＡ。结论利用单个或少数细胞制备全ｃＤＮＡ探针,为在高分化的异质性系统中进行差异基因表达分析、建立细胞／组织特异性全基因表达图谱提供了一条合理的途径。     

PCR方法对单细胞SRY基因扩增效率的对比研究

目的探讨单细胞基因扩增时,巢式PCR和引物预扩增(PEP)-巢式PCR两种扩增方法对SRY基因脱扣的影响程度;并应用PEP-巢式PCR方法对单个卵裂球细胞进行SRY基因诊断。方法获取单个正常男女淋巴细胞,随机分为巢式PCR组和PEP-巢式PCR组。同时扩增SRY基因和ZP3基因位点。选用IVF-ET后冻存的4个胚胎,处理后获取单个卵裂球11个,用PEP-巢式PCR扩增,鉴定其性别。结果单个淋巴细胞经巢式PCR和PEP-巢式PCR方法扩增后,其基因扩增成功率分别为92.39%,98.91%;性别诊断正确率分别为86.00%,98.00%;SRY基因的脱扣率分别为16.67%,2.38%。两者有统计学检验均有显著性差异(P<0.05。对单个卵裂球应用PEP-巢式PCR方法进行SRY基因和ZP3基因扩增后,有3个胚胎的8个卵裂球被诊断为男性,而另外1个胚胎的3个卵裂球被诊断为女性。结论1.行单细胞基因扩增时,PCR扩增方法会影响等位基因脱扣的发生率。2.对性连锁遗传病进行植入前遗传学诊断时,采用PEP-巢式PCR方法扩增SRY基因和ZP3基因对单个细胞对进行性别鉴定时,可以有效地降低SRY基因脱扣的发生率,提高性别诊断的特异性和敏感性,能够用于单细胞的性别诊断,可用于性连锁遗传病的植入前遗传学诊断。     

单细胞逆转录PCR实验方法研究

目的：探索建立稳定可靠的单细胞RT-PCR实验体系。方法：以人β-actin和DPH2L基因为靶基因，通过各个环节上实验条件的比较优化，对单细胞RT-PCR扩增单个细胞中特异性目的基因和全细胞mRNA两种方法的扩增效果进行深入研究，并结合琼脂糖凝胶电泳和DNA测序技术，分析该方法的灵敏性、特异性、重复性和忠实性。结果：单个细胞中的全部mRNA均得到了扩增，扩增成功率为75%，产物经核酸定量均可达到μg水平，足够常规分子生物学实验之用。β-actin和DPH2L基因均得到特异性扩增产物，未见基因组DNA污染，经BLAST比对为100%吻合，不同条件下扩增成功率在30%~90%之间。结论：单细胞RT-PCR是一种行之有效的单细胞基因表达的研究工具，提高Mg2+反应浓度并采用巢式引物有利于提高扩增成功率。     

氯化铵裂解法与非裂解法提取人脂肪干细胞生物学特性的差异

文题释义： 氯化铵红细胞裂解液：含有氯化铵成分的红细胞裂解液,此种裂解液被广泛应用于骨髓干细胞及脂肪干细胞的提取,其目的是去除组织内的红细胞,使目的细胞群进一步纯化。其作用机制为：红细胞内有大量碳酸酐酶,可自发将NH₃转化为NH₄⁺,CO₂转化为HCO₃^-,促使胞外NH₃和CO₂连续内流造成细胞裂解。 基质血管成分：脂肪组织中除了含有成熟脂肪细胞外,还包含一组混杂的细胞群,即基质血管成分。基质血管成分包括血管内皮细胞、脂肪祖细胞、成纤维细胞、周细胞、脂肪干细胞,造血干细胞、红细胞等,其具有多向分化潜能及促进组织血管再生等功能,在组织及器官的再生、修复中具有极大的应用前景。 背景：脂肪干细胞的提取及纯化流程尚未建立统一标准。最常用的纯化脂肪干细胞的方法是利用红细胞裂解液处理基质血管成分。但这一步骤是否对脂肪干细胞存在不良影响仍缺乏证据,是否有利于未来临床应用仍有待探讨。 目的：比较氯化铵红细胞裂解液法和非裂解法提取脂肪干细胞的效率,并进一步比较两种方法提取脂肪干细胞的生物学特性。 方法：收集吸脂手术患者脂肪组织,经Ⅰ型胶原酶消化后,利用或不用氯化铵红细胞裂解液对基质血管成分进行纯化,Muse^TM细胞状态分析仪对活细胞计数及活细胞比例评估;将基质血管成分接种后培养人脂肪干细胞至第2代,光学显微镜观察脂肪干细胞形态,流式细胞学分析脂肪干细胞表型,CCK-8法绘制细胞增殖曲线,成脂及成骨培养基诱导后油红O及茜素红染色法分别评估成脂、成骨分化能力。该实验经中国医学科学院整形外科医院伦理委员会批准,并与患者签署相关知情同意书。 结果与结论：①与裂解组相比,非裂解组提取即刻的基质血管成分中非红活细胞数更多,活细胞百分比更大;②两组脂肪干细胞均呈梭形、鱼群状排列;③两组细胞均高表达CD90、CD73、CD105等细胞表面抗原,低表达或不表达CD11b、CD34、CD19、CD45、HLA-DR等细胞表面抗原;④非裂解组细胞增殖速度更快,成脂及成骨能力两组间无明显区别;⑤结果表明,利用氯化铵红细胞裂解液法提取基质血管成分降低了脂肪干细胞提取效率,抑制了脂肪干细胞增殖能力。非裂解过程不影响脂肪干细胞表型及成脂、成骨分化能力。因此不建议在人脂肪干细胞提取过程中进行氯化铵法红细胞裂解。 ORCID: 0000-0002-8958-4975(李梓菲) 中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞;骨髓干细胞;造血干细胞;脂肪干细胞;肿瘤干细胞;胚胎干细胞;脐带脐血干细胞;干细胞诱导;干细胞分化;组织工程     

单细胞测序分析病毒性肺炎患者T细胞受体基因差异

目的：采用单细胞测序分析病毒性肺炎患者外周血T细胞受体（TCR）基因差异,探讨可能发病机制。方法：利用NCBI数据库获得数据,设置病例组和对照组进行实验。使用RStudio软件R语言分析单细胞测序数据,绘制表格和图片,得出结论。结果：病例组和对照组TCR有显著差异。对TCR α链和β链V、J基因片段使用频率进行分析,其中病例组TRAV1-2、TRAV29/DV5、TRAJ33、TRAJ48、TRBV20-1、TRBV2、TRBJ2-3、TRBJ1-1等基因使用频率明显高于对照组（P<0.05）。进一步V-J基因组合分析显示,病例组α链V-J对使用频率最高的是TRAV1-2-J33,β链V-J使用频率最高的是TRBV20-1-J2-1,αβ双链V-J使用频率最高的是TRAV30-J24-TRBV3-1-J2-7。结论：病毒性肺炎患者外周血TCR基因发生了明显改变,可能与病毒免疫发病机制有关。     

应用巢式PCR对单细胞进行性别诊断的初步研究

目的：应用巢式PCR技术对人类植入前胚胎进行性别诊断。方法：收集单个或两个淋巴细胞和卵裂球（50个／组），按不同的方法处理单细胞（纯水法、冻融法、碱法），而后行巢式PCR扩增牙釉质基因。结果：纯水法、冻融法、碱法处理后，扩增率分别为83％、94％、95％。后两种处理方法的扩增效率明显高于纯水法（P＜0．01），通过检测正常男性单淋巴细胞基因型发现3种方法等位基因脱失率分别为24％、12％、4％，差异有显著性（P＜0．05）。两个淋巴细胞或卵裂球的扩增率及等位基因脱失率与单细胞相比差异无显著性。结论：提高植入前遗传学诊断的准确性主要取决于如何克服单细胞PCR的缺点，采用碱法裂解单细胞及取两个卵裂球进行检测可提高用于性别诊断的单细胞PCR技术准确性和敏感性。     

单细胞测序技术在肿瘤浸润B细胞研究中的应用

肿瘤浸润B细胞（tumor-infiltrating B cells,TIL-Bs）已经被证明在调节肿瘤免疫方面起着关键作用,既可以抑制也可以促进抗肿瘤免疫的效应,需要对其进行深入分析以研究具体的效应功能。单细胞测序技术是对单个细胞的基因组、转录组及蛋白组进行高通量测序,利用其高分辨率对单个细胞的详细分子状态进行定义。因此,单细胞测序技术已经成为生命科学研究领域不可或缺的工具,可以全面分析不同类型肿瘤中B细胞的状态。本文从单细胞的角度阐述了TIL-Bs的异质性、优势细胞群体的状态并希望将对表型的表征转化为对预后以及治疗的研究,旨在认识TIL-Bs的生物学作用、肿瘤特异性抗体的功能,为靶向肿瘤的治疗提供一个新的角度。     

LAK 细胞培养上清及裂解液诱导 Raji细胞凋亡的研究

用流式细胞仪、 Ｈｏｅｃｈｓｔ３３２５８ 荧光素核染后显微镜下计数和电镜三种方法观察 Ｌ Ａ Ｋ 细胞培养上清和裂解液诱导 Ｒａｊｉ肿瘤细胞的凋亡。发现该上清和裂解液与靶细胞共同作用３ｈ 后瘤细胞凋亡率显著增高， 到９ｈ 达最高点， 亚二倍体 Ｄ Ｎ Ａ峰积分面积可达４８ ％ 。在电镜下观察到胞体缩小、表面平滑化、染色质靠边浓集、不连续凋亡小体形成等典型的细胞凋亡现象。提示诱导肿瘤细胞的凋亡是 Ｌ Ａ Ｋ 细胞杀伤机制之一， 并可能通过可溶性因子发挥作用。     

单细胞RNA测序揭示星形胶质细胞的异质性

背景：星形胶质细胞是中枢神经系统含量最丰富的细胞,存在多种亚型具有很强的异质性,执行着多种特殊功能。近年来,单细胞RNA测序技术从转录组分析的角度扩展了人们对星形胶质细胞异质性的理解。目的：综述单细胞RNA测序技术对星形胶质细胞在不同物种、不同时空以及不同疾病状态异质性研究的进展,扩展对星形胶质细胞异质性在分子和功能层面的认识。方法：检索PubMed、Elsevier及中国知网数据库收录的星形胶质细胞异质性及单细胞RNA测序研究相关文献,中文检索词为“星形胶质细胞、单细胞RNA测序、异质性、阿尔茨海默综合征、脊髓损伤、多发性硬化症”;英文检索词为“astrocytes,scRNA-seq,heterogeneity,Alzheimer disease,spinal cord injury,multiple sclerosis”等,经过入组标准筛选,最终纳入74篇文献进行综述。结果与结论：星形胶质细胞的单细胞RNA测序相关研究显示,星形胶质细胞在不同物种、发育阶段、中枢神经系统区域和病理状态4个方面均存在明显的异质性。(1)不同物种的星形胶质细胞出现某些基因的独特表达,物种特异基因的发现...     

单细胞扩增技术在植入前诊断中的应用和研究进展

近10几年来,随着植入前诊断的迅速发展,避免了许多遗传病患儿的出生。植入前诊断是建立在单细胞扩增技术基础之上的,完善的单细胞扩增技术的建立是准确植入前诊断的前提和保障。本文综述了近几年单细胞扩增技术在植入前诊断中的应用和研究进展。     

Improved detection of cutaneous human papillomavirus DNA by single tube nested 'hanging droplet' PCR

A single tube nested ‘hanging droplet’ PCR was developed for detection of cutaneous human papillomavirus (HPV) DNA of the phylogenetic group B1. The nested PCR was compared with a single round PCR method by testing 56 fresh biopsies from Australian skin tumour patients. HPV DNA was detected in 64% (36/56) of the biopsies by nested PCR and in 30% (17/56) by single round PCR (P<0.001). HPV DNA was more often detected by nested PCR than by single round PCR in basal cell carcinoma [62% (16/26) vs. 19%; (5/26); P=0.003], squamous cell carcinoma [43% (7/16) vs. 25% (4/16)] and in solar keratosis [93% (13/14) vs. 57% (8/14); P=0.038]. The nested PCR and the single round PCR system detected 26 and 11 different HPV types/putative types/subtypes, respectively. Multiple types were found in eight samples by the nested PCR and two samples by single round PCR. The nested HPV PCR is more sensitive and capable of amplifying a broad spectrum of HPV types from skin tumours, but further improvements are needed before all HPV infections in skin can be detected by a single assay.     

菌落PCR和质粒PCR对转化菌的筛选

为建立简便,可靠转化菌的筛选方法。方法应用菌落ＰＣＲ和重组质粒ＰＣＲ方法对转化菌进行筛选和ＤＮＡ序列分析。克隆载体和表达载体筛选及鉴定采用与载体多克隆插入位眯序列互补的通用引物或免疫球蛋白家族特异性引物。结果菌落ＰＣＲ和质粒ＰＣＲ技术可作为基因克隆筛选和鉴定的方法。结论菌落ＰＤＲ和质粒ＰＣＲ方向简便,快速,可靠,其产可作为模板直接用于序列分析。     

PCR动力学数学模型在PCR产物直接核酸序列分析中的应用

使用ＰＣＲ动力学数学模型提供的ＰＣＲ产物数量计算方法计算经ＰＣＲ扩增获得的产物数量，纯化后用於ＰＣＲ产物的核酸序列分析。由於ＰＣＲ动力学数学模型提供了比较准确的产物数量计算，使测序模扳数量总能保持在比较适当的范围，因此测序结果的可读性、自显影条带的清晰度保持了较好的水平。提示了ＰＣＲ动力学数学模型是基本正确的。说明准确的定量计算ＰＣＲ产物数量对ＰＣＲ产物直接核酸序列分析是有益的。     

应用改进的SSP-抑制PCR技术扩增cDNA片段旁侧序列

结合抑制PCR和单链特异引物PCR技术，降低RACE过程中由公用引物引发的非特异扩增、增加目的cDNA在原始模板中的相对比例，从而提高RACE特异性，有效地扩增靶序列。     

PCR诊断生殖道感染性质发病率与男性不育症的关系

目的了解UU、CT、NG、HPV在临床男性不育症患者中的感染率以及各自的发病率。方法:应用PCR方法对诊断男性不育症合并感染的患者测定何种病原微生物感染,并测定其发病率。结果总感染率16.52%,合并感染率1.15%,其中UU占第一位,8.33%,其次为CT 5.03%,NG 5.03%,HPV 1.29%。结论UU、CT、NG、HPV在男性不育中占有较大比率,是其发病原因之一,而且其发病率相互之间有显著性差异,UU发病率最高,其次CT。男性病人感染UU、CT由于症状不典型,易发生误诊,其结论对临床诊断治疗有一定指导意义。     

应用重组PCR技术克建人单链白细胞介素12融合基因

目的 构建人单链白细胞介素１２（ｈｓｃＩＬ－１２）融合基因并在真核细胞中进行表达,为进一步研究ｈｓｃＩＬ－１２融合蛋白的生物学活性奠定基础。方法 应用重组ＰＣＲ技术将ｈＩＬ－１２ｐ４０和ｐ３５亚单位两段编码序列的ｃＤＮＡ通过一疏水性多肽接头（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）３碱基序列进行前后拼拼（ＩＬ－１２ｐ４０－多肽接头－ｐ３５）,构建ｈｓｃＩＬ－１２融合基因,并进行核苷酸序列测定,进一步将ｈｓｃＩＬ－１２融合基因插入ｐｃＤＮＡ３．１真核表达载体中,转染ＣＯＳ－７细胞表达ｈｓｃＩＬ－１２融合蛋白,并行Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ分析。结果 该融合基因经ＤＮＡ序列分析表明：ｐ４０、ｐ３５、ｌｉｎｋｅｒ的连接顺序、方向及序列完全正确,融合基因可在ＣＯＳ－７细胞中表达ｈｓｃＩＬ－１２融合蛋白。Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ显示该融合蛋白分子     

聚合酶链反应预测宫颈癌的研究

采用聚合酶链反应对宫颈癌、宫颈糜烂、宫颈正常组织各50例进行人乳头瘤病毒感染率的检测，据结果提示人乳头瘤病毒感染与宫颈癌发生的密切相关性，对预测宫颈癌的发生进行了前瞻性的研究。指出(PCR)聚合酶链反应免除了昂贵繁杂的分子杂交过程，具有极高的敏感性是监测人乳头瘤病毒感染的“高危人群”，预测宫颈癌发生的最佳技术。     

Dynamic monitoring of single cell lysis in an impedance-based microfluidic device

A microfluidic device that is capable of trapping and sensing dynamic variations in the electrical properties of individual cells is demonstrated. The device is applied to the real-time recording of impedance measurements of mouse embryonic stem cells (mESCs) during the process of membrane lysis, with the resulting changes in the electrical properties of cells during this process being quantitatively tracked over time. It is observed that the impedance magnitude decreases dramatically after cell membrane lysis. A significant shift in the phase spectrum is also observed during the time course of this process. By fitting experimental data to physical models, the electrical parameters of cells can be extracted and parameter variations quantified during the process. In the cell lysis experiments, the equivalent conductivity of the cell membrane is found to increase significantly due to pore formation in the membrane during lysis. An increase in the specific capacitance of the membrane is also observed. On the other hand, the conductivity of the cytoplasm is observed to decrease, which may be explained the fact that excess water enters the cell through the gradual permeabilization of the membrane during lysis. Cells can be trapped in the device for periods up to several days, and their electrical response can be monitored by real-time impedance measurements in a label-free and non-invasive manner. Furthermore, due to the highly efficient single cell trapping capacity of the device, a number of cells can be trapped and held in separate wells for concurrent parallel experiments, allowing for the possibility of stepped parametric experiments and studying cell heterogeneity by combining measurements across the array.     

Detection of FMDV RNA amplified by the polymerase chain reaction (PCR).

Molecular detection of foot-and-mouth disease virus (FMDV) using the polymerase chain reaction (PCR) is a rapid and accurate method. In this study we present PCR for the detection of FMDV RNA in infected BHK cells. Using PCR and two primers selected from the RNA polymerase gene, a conserved sequence in all types and subtypes of FMDV, we were able to detect FMDV RNA present in RNA extracted from the FMDV-infected cells. RNA from uninfected BHK cells gave negative results. Another set of primers selected from the nucleotide sequence of the variable VP1 gene permitted the demonstration of variations among different FMDV Israeli isolates by PCR. Two 01 type FMDV isolates out of a total of 6 FMDV field isolates (including 01 Geshur) gave a positive PCR while two other 01 isolates and two ASIA isolates were detected with the RNA polymerase gene primers but not with the VP1 primers. Serial dilutions of the RNA used in each reaction showed that a very small amount of RNA may be detected by PCR. The PCR products from the RNA polymerase and the VP1 genes were sequenced and the nucleotide sequences obtained were compared with a known nucleotide sequence of the FMDV 01 genome.