Dysadherin基因沉默对胰腺癌细胞侵袭移行能力的影响

目的 探讨靶向封闭dysadherin基因对胰腺癌细胞PANC1、BxPC3体外侵袭移行能力的影响.方法 应用脂质体转染方法将小分子RNA(siRNA)转染细胞.实验分为dysadherin-siRNA转染(dysa)组、阴性对照siRNA转染(HK)组、脂质体对照(对照)组、.采用RT-PCR、免疫组化方法检测转染细胞的dysadherin mRNA及蛋白表达;采用Transwell侵袭小室检测转染细胞体外侵袭移行能力.结果 转染dysadherin-siRNA(5 nmol/L)的PANC1和BxPC3细胞的dysadherin mRNA表达较HK组细胞分别下降95.4%、52.1%(P＜0.05);dysadherin蛋白表达亦分别降低91.2%、83.6%(P＜0.01).PANC1细胞的对照组、HK组和dysa组穿膜细胞数分别为163.2±15.5、154.4±17.3和53.6±7.9;BxPC3细胞的对照组、HK组和dysa组穿膜细胞数分别为30.7±3.2、27.5±2.8和4.7±2.4.dysa组显著低于HK组和对照组(P值均＜0.01).结论 应用RNA干扰技术沉默人胰腺癌细胞株PANC1、BxPC3的dysadherin基因可使细胞的侵袭移行能力下降.     

RNAi抑制存活素基因表达对前列腺癌细胞侵袭的影响

目的 探讨存活素(survivin)基因对前列腺癌细胞侵袭的影响和可能机制. 方法 采用survivin基因小干扰RNA(small interfering RNA,siRNA)转染处理人前列腺癌细胞系PC-3后,分别采用实时-定量RF PCR和Western blot检测survivin基因和基质金属蛋白酶家族-2、-9(matrixmetalloproteinases-2、-9)mRNA和蛋白水平,分别采用软琼脂集落培养试验和Boyden小室模型试验检测癌细胞的锚着不依赖性增殖和侵袭能力;其次,将转染48 h的细胞接种裸鼠,观察对癌细胞体内侵袭的影响. 结果 软琼脂集落形成试验显示,3.125、6.250 nmol/L和12.500 nmol/L siRNA组集落形成数分别为17.8±1.6、13.6±1.5、8.8±1.4,而对照组为22.65±1.8(P<0.05);Boyden小室模型试验显示,3.125、6.250 nmol/L和12.500/ nmol/L siRNA组穿过滤膜的细胞数分别为33.6±2.1、19.5±1.9、8.1±1.8,而对照组为49.4±2.3(P<0.05).体内试验显示,对照组裸鼠组织癌细胞侵袭横纹肌和血管,而转染组未见这些现象.同时发现,转染组细胞MMP-2、-9基因mRNA和蛋白水平明显下调,呈浓度和时间依赖性(P<0.01). 结论 采用survivin siRNA转染可抑制前列腺癌细胞侵袭转移,其机制可能与下调MMP-2和MMP-9表达有关.     

cripto-1基因siRNA对乳腺癌细胞侵袭力的影响

目的观察cripto-1基因小于扰RNA（siRNA）对乳腺癌细胞侵袭力的影响。方法将人乳腺癌MDA—MIM68细胞分为4组,A组不处理,B组转染空载脂质体,C组转染错配siRNA,D组转染分别转染含3．125、6．25、12．5nmol／Lcfipto-1基因siRNA的脂质体。分别于处理24．48、72h收集各组细胞。采用实时定量RT—PCR法和Western blot法检测MDA—MB468的cripto-1 mRNA和蛋白,采用软琼脂集落培养试验和Boyden小室检测MDA—MB468的锚着不依赖性增殖和侵袭能力。结果与A、B、C组比较,D组MDA—MB468的cripto-1 mRNA、cripto-1蛋白、集落形成数量、穿膜细胞数均呈浓度依赖性减少（P均〈0．005）。结论cripto-1基因siRNA可抑制乳腺癌细胞侵袭。     

RNAi沉默PRL-3基因对大肠癌细胞侵袭的抑制

目的:探讨RNA干扰(RNA interference,RNAi)沉默促肝细胞再生磷酸酶3(proteins in regenerating liver cell-3,PRL-3)基因对大肠癌细胞侵袭的影响.方法:应用PRL-3基因小干扰RNA(small interfering RNA,siRNA)转染处理大肠癌细胞系HCT116后,采用荧光实时定量PCR方法检测PRL-3基因mRNA水平,分别采用软琼脂集落培养实验和Boyden小室模型实验检测癌细胞的锚着不依赖性增殖和侵袭能力.其次将转染48 h的细胞接种裸鼠,观察对癌细胞体内侵袭的影响.结果:与两对照组比较,siRNA组PRL-3mRNA水平明显降低,且呈浓度和时间依赖性(P＜0.05).体外实验发现:与对照组比较,PRL-3 siRNA转染组软琼脂集落形成数和穿过滤膜的癌细胞均呈剂量依赖性减少(P＜0.05,P＜0.05).体内实验发现:空白对照组和空载对照组有较多癌细胞侵袭癌肿组织周围的横纹肌,并侵犯血管,而siRNA转染组未见这些现象.结论:PRL-3在大肠癌细胞侵袭中起着重要的作用,采用PRL-3 siRNA转染可抑制大肠癌细胞侵袭.     

HDAC1基因沉默对人胰腺癌细胞PaTu8988细胞周期的影响

目的 探讨组蛋白脱乙酰基酶1( HDAC1)基因沉默对人胰腺癌PaTu8988细胞周期影响及可能机制.方法 常规培养胰腺癌PaTu8988细胞,分为对照组、阴性siRNA转染(c-siRNA)组及15、30 nmol/L HDAC1 siRNA转染组.采用脂质体2000转染细胞48 h后,应用蛋白质印迹法检测细胞HDAC1基因沉默效率及p21基因表达;流式细胞法检测细胞周期的变化.结果 与对照组比较,30 nmol/L HDAC1 siRNA组PaTu8988细胞的HDAC1蛋白表达明显下降,P21蛋白表达明显增加;G2/M 期细胞比例显著减少[(21.48±3.67)％比(28.28±2.94)％,P＜0.05],S期细胞比例显著增加[(50.20±6.85)％比(32.49±2.78)％,P＜0.05].结论 HDACl siRNA能特异、有效地抑制人胰腺癌PaTu8988细胞HDACl的表达,引起细胞S期阻滞,其机制可能与上调p21蛋白表达有关.     

RNA干扰沉默NF-κB p65基因表达抑制胰腺癌PANC1细胞增殖与侵袭的研究

目的 运用RNA干扰技术阻断人胰腺癌细胞株PANC1的NF-κB p65表达,观察该基因沉默后对细胞增殖能力及体外侵袭能力的影响.方法 采用阳离子脂质体LipofectamineTM 2000将化学合成的人NF-κB p65的小干扰RNA(siRNA)转染人胰腺癌细胞PANC1作为siRNA组,另设无同源性siRNA转染细胞的阴性对照组和蒸馏水空白对照组.实验重复6次.应用RT-PCR检测转染细胞NF-κB p65 mRNA与细胞间黏附分子-1(ICAM-1)mRNA的表达.MTT结合克隆形成实验测定细胞生长抑制率.Matrigel细胞侵袭实验测定细胞体外侵袭能力.结果 siRNA组、阴性对照组和空白对照组NF-κB p65 mRNA相对表达量分别为0.227±0.045、0.381±0.038和0.404±0.031;ICAM-1 mRNA相对表达量分别为0.597±0.083、0.983±0.068和1.027±0.098;细胞生长抑制率(72 h)分别为18.3%、2.3%和0;克隆形成率分别为(14.1±3.1)%、(24.5±2.1)%和(27.2±2.6)%;侵袭细胞数分别为80.25±6.35、123.83±8.80和127.68±9.23.siRNA组均明显低于2个对照组(P＜0.01).结论 NF-κB p65的RNA干扰能抑制胰腺癌PANC1细胞NF-κB p65 mRNA和ICAM-1 mRNA的表达,抑制细胞的生长和侵袭.     

Jagged1基因沉默对人胰腺癌细胞SW1990和PANC1血管相关因子分泌及迁移能力的影响

目的 以RNA干扰技术靶向沉默人胰腺癌细胞株Jagged1基因,观察细胞VEGF、Angiopoietin2、bFGF、MMP9的分泌及细胞迁移能力的变化.方法 应用靶向Jagged1的siRNA、对照siRNA(c-siRNA)转染人胰腺癌细胞株SW1990和PANC1,实时PCR法和蛋白质印迹法检测细胞Jagged1 mRNA和蛋白的表达,ELISA法检测细胞培养上清中VEGF、angiopoietin2、bFGF、MMP9的分泌量,Transwell小室观察细胞的迁移能力.结果 SW1990和PANC1细胞均高表达Jagged1基因.15 nmol/L Jagged1 siRNA转染胰腺癌细胞72 h后,SW1990、PANC1细胞的Jagged1 mRNA表达被抑制,分别为c-siRNA组的(59.62 ±2.75)％和(76.96 ±6.16)％,Jagged1蛋白表达几乎完全被抑制.SW1990、PANC1细胞的VEGF分泌量均较c-siRNA组显著减少[(867.93±58.69) pg/ml比(1516.24±37.58)pg/ml,(951.13±120.49) pg/ml比(1413.68±33.56) pg/ml,P＜0.05],但angiopoietin2、bFGF、MMP9蛋白分泌无明显变化.另外,Jagged1 siRNA转染后,SW1990细胞VEGF mRNA表达水平为c-siRNA组的(52.26 ±4.85)％ (P＜ 0.05);PANCI细胞为c-siRNA组的(59.75±4.91)％(P＜0.05).转染后的SW1990和PANC1细胞的穿膜细胞数分别为(65.25±5.56)、(57.50±8.58)个,较c-siRNA组的( 122.25±11.09)、(112.00±12.52)个显著减少(P＜0.05).结论 人胰腺癌细胞高表达Jagged1,沉默Jagged1基因可明显抑制人胰腺癌细胞VEGF的产生和分泌,并且可降低癌细胞的体外迁移能力.     

S100A6基因沉默对胰腺癌细胞侵袭的影响

目的 探讨S100A6基因沉默对胰腺癌细胞侵袭的影响和可能机制。方法 将不同浓度(3.125、6.25、12.5 nmol/L)的靶向S100A6的小干扰RNA( S100A6-siRNA)转染人胰腺癌BxPC3细胞,分别采用荧光实时定量PCR和蛋白质印迹法检测S100A6 mRNA和蛋白的表达,采用Transwell小室检测癌细胞侵袭能力,明胶酶谱法检测基质金属蛋白酶-9(MMP-9)活性。结果 S100A6-siRNA转染组细胞的S100A6 mRNA和蛋白表达呈浓度、时间依赖性明显下调,穿膜细胞数呈浓度依赖性明显减少。12.5 nmol/L的S100A6-siRNA转染组细胞转染后48 h的S100A6 mRNA表达从对照组的(100±0.3)％降到(15.3±0.2)％(P＜0.01);S100A6蛋白的表达从(83.2±0.18)％降到(13.5±0.12)％(P＜0.01);穿膜细胞数从(44.5±2.2)个降到(7.6±1.5)个(P＜0.05)。同时,S100A6-siRNA转染组细胞的MMP-9活性明显下调。结论 抑制S100A6基因表达可抑制胰腺癌细胞侵袭转移,其机制可能与下调MMP-9活性有关。     

TLR4 shRNA质粒的构建及稳定转染人胰腺癌PANC1细胞株的筛选

目的 构建靶向人TLR4基因的短发夹RNA(shRNA)真核表达质粒,转染胰腺癌细胞,并筛选出稳定转染的克隆细胞株.方法 采用小分子干扰RNA(siRNA)软件设计3个靶向TLR4基因的shRNA,构建3个质粒表达载体,分别命名为TLR4-1、TLR4-2、TLR4-3;选取抑制效率最高的shRNA质粒,采用脂质体法转染胰腺癌PANC1细胞;实时定量PCR和流式细胞技术检测细胞TLR4 shRNA基因沉默效率和转染效率;G418抗性筛选和有限稀释单克隆形成法挑选培育稳定转染TLR4 shRNA的单克隆细胞系.结果 转染48 h后PANC1细胞瞬时转染效率为(46.72±5.06)％.转染TLR4-1、TLR4-2、TLR4-3的细胞的TLR4mRNA表达水平分别为0.025±0.004、0.027±0.003、0.019±0.006,均显著低于未转染组的0.061±0.018和阴性对照转染组的0.057±0.015(P值均＜0.05).以沉默效果最佳的TLR4-3转染细胞所获得的稳转细胞的转染效率为(82.79 ±8.16)％,较瞬转细胞显著提高(P=0.001);TLR4 mRNA表达水平为0.010±0.002,较瞬转细胞显著下调(P=0.001);TLR4蛋白表达率为(0.54±0.32)％,显著低于未转染细胞的(87.42±5.00)％和转染阴性对照细胞的(82.90±5.00)％(P=0.000).结论 成功筛选到TLR4基因沉默的稳转PANC1细胞.     

RNAi技术沉默Bcl-xL基因表达对食管癌细胞增殖和侵袭的影响

目的探讨RNA干扰（RNAi）技术沉默Bcl-xL基因表达对食管癌细胞增殖和侵袭能力的影响。方法将Bcl-xL小干扰RNA（siRNA）转染食管癌EC109细胞,分别采用荧光实时定量RT-PCR和Western blot方法检测食管癌细胞Bcl-xL mRNA和蛋白,采用软琼脂集落培养试验和Boyden小室模型检测癌细胞增殖和侵袭力。结果与对照组相比,siRNA转染组细胞Bcl-xL mRNA和蛋白水平明显下调（P均〈0.05）,所形成的软琼脂集落数和穿膜细胞数明显减少（P均〈0.05）,并均呈浓度依赖性。结论采用RNAi技术沉默Bcl-xL基因表达,可抑制食管癌细胞的增殖和侵袭能力。     

胰腺癌细胞TM4SF1的表达及其对细胞增殖、迁移及侵袭能力的影响

目的 检测5株人胰腺癌细胞株中TM4SF1 mRNA的表达,探讨TM4SF1基因对癌细胞增殖、迁移及侵袭能力的影响.方法 采用实时PCR方法检测人胰腺癌细胞株MPanc96、MiaPaCa-2、HPAC、PANC1、AsPC-1的TM4SF1 mRNA表达,并与人正常胰腺导管上皮细胞（HPDE）的TM4SF1mRNA表达进行比较.应用RNA干扰方法将靶向TM4SF1的siRNA及阴性对照siRNA瞬时转染MPanc96、MiaPaCa-2细胞.采用MTS法检测转染细胞的增殖能力,Transwell小室法检测细胞的迁移及侵袭能力.结果 胰腺癌细胞株MPanc96、MiaPaCa-2、PANC1、AsPC-1、HPAC的TM4SF1 mRNA相对表达量分别为1.205±0.073、1.096±0.260、1.382±0.075、1.374±0.363、0.744±0.096,均显著高于HPDE的0.020±0.003（F =22.26,P＜0.01）.与转染阴性对照siRNA的细胞比较,TM4SF1基因表达沉默的MPanc96、MiaPaCa-2细胞的增殖无显著变化,但细胞的迁移力分别降低（62.5±7.6）％、（72.8±4.0）％,侵袭能力分别下降（69.5±5.7）％、（78.6±6.3）％.结论 TM4SF1在人胰腺癌细胞中高表达,并增强胰腺癌细胞的迁移和侵袭能力.     

胰腺癌伴神经浸润动物模型的建立

目的 建立胰腺癌伴神经浸润的动物模型.方法 32只裸鼠分为4组,每组8只.将人胰腺癌细胞SW1990、CAPAN-2、PANC1分别注射于裸鼠的坐骨神经周围,以不做任何处理的裸鼠作为对照组.观察术后裸鼠体质量变化、成瘤情况、成瘤时间、造模成功率等指标.结果 对照组裸鼠体质量增加,各癌细胞注射组裸鼠成瘤后体质量明显下降,甚至呈现恶液质,成瘤侧肢体活动受限.CAPAN-2注射组及SW1990注射组的8只裸鼠最终均成瘤,PANC1注射组只有5只成瘤.以肿瘤最长径长至约0.8 cm为时间截点,CAPAN-2注射组、PANC1注射组、SW1990注射组裸鼠的成瘤时间分别为（49.8±5.0）、（56.6±2.4）、（25.4±3.0）d.SW1990注射组成瘤时间最短,PANC1注射组成瘤时间最长,3组间成瘤时间的差异具有统计学意义（F=73.51,P＜0.01）.CAPAN-2注射组、PANC1注射组、SW1990注射组裸鼠神经浸润造模成功率分别为87.5％ （7/8）、20.0％（1/5）、50.0％ （4/8）.结论 成功建立了胰腺癌伴神经浸润动物模型,但不同的胰腺癌细胞系建立的动物模型具有不同的特点.     

IL-6对肝癌细胞HepG2浸润迁移能力的影响

目的观察肝癌细胞系HepG2自身分泌的白细胞介素-6(interleukin-6,IL-6)对其浸润迁移能力的影响。方法 RNA干扰技术沉默IL-6,同时设空白对照组(不加转染试剂)、正常对照组(转染空脂质体)、无义对照组(转染无义对照siRNA)、实验对照组(转染沉默IL-6的siRNA)。进行细胞划痕损伤实验检测细胞的迁移能力。结果 RT-PCR检测各组IL-6 mRNA的表达分别为100±7.87、303±19.95、160±10.95、23±7.02;IL-6在沉默组细胞的浸润迁移能力受到抑制,正常对照组(转染空脂质体)、无义对照组(转染无义对照siRNA)细胞的浸润迁移能力增强。结论 IL-6被沉默能抑制肝癌细胞系HepG2的迁移,肝癌细胞系HepG2IL-6表达增高能促进其自身发生迁移。     

组蛋白去乙酰化酶1对人胰腺癌细胞增殖凋亡的影响

目的 观察沉默组蛋白去乙酰化酶1(HDAC1)基因对人胰腺癌PaTu8988细胞增殖及凋亡的影响.方法 培养胰腺癌PaTu8988细胞株,设空白对照组(未予任何处理)、阴性对照组[予30 nmol/L阴性小干扰RNA(siRNA)]、HDACI低剂量组(予15 nmol/L HDAC1 siRNA)和HDAC1高剂量组(予30 nmol/L HDAC1 siRNA),siRNA转染48 h后,分别采用相对实时定量PCR法和Western印迹法检测HDAC1基因在mRNA和蛋白水平的沉默效率,细胞计数试剂盒法检测siRNA干扰前、后细胞增殖变化,流式细胞技术检测干扰前、后细胞凋亡变化.结果 转染HDAC1siRNA 48 h后,低剂量组和高剂量组人胰腺癌PaTu8988细胞中HDAC1 mRNA表达率分别为46.1%±6.1%和32.3%±1.4%,均显著低于空白对照组(100.0%±3.4%)和阴性对照组(87.4%±28.3%),差异有统计学意义(P值均<0.05).空白对照组和阴性对照组HDAC1蛋白表达水平高于其余两组.空白对照组、阴性对照组、HDAC1低剂量组和HDAC1高低剂量组的细胞存活率分别为100.0%±17.1%、87.1%±5.0%、68.7%±4.7%和61.6%±2.0%,细胞凋亡率分别为4.20%±0.95%、4.59%±1.26%、10.09%±1.36%和11.19%±6.07%,空白对照组和阴性对照组与其余两组比较,差异均有统计学意义(P值均<0.05).结论 HDAC1 siRNA能特异、有效地抑制人胰腺癌PaTu8988细胞HDAC1表达,抑制细胞增殖、诱导细胞凋亡.     

MT2-MMP基因沉默对缺氧条件下培养的胰腺癌AsPC-1细胞增殖、凋亡及侵袭力的影响

目的 利用特异性siRNA沉默人胰腺癌AsPC-1细胞的膜型金属蛋白酶2（MT2-MMP）基因表达,观察其对缺氧条件下培养的细胞增殖、凋亡和侵袭力的影响.方法 采用脂质体转染法将插入MT2-MMP特异性siRNA的真核表达质粒转染至人胰腺癌AsPC-1细胞株（siRNA组）,以转染过表达MT2-MMP质粒（过表达组）或阴性对照质粒（空载体组）的AsPC-1作为对照.实时定量PCR法和蛋白质印迹法检测转染细胞的MT2-MMP mRNA和蛋白的表达.在缺氧条件（37℃、1％O2、5％ CO2、饱和湿度的三气培养箱）下培养后,应用CCK-8法检测转染细胞的增殖,流式细胞仪检测细胞的凋亡,Transwells小室检测细胞的侵袭能力.结果 成功获取MT2-MMP基因沉默的AsPC-1细胞株和过表达的细胞株.缺氧条件下培养24h后,空载体组、过表达组、siRNA组细胞增殖的吸光度值（A490值）分别为0.68±0.08、0.80 ±0.08、0.52±0.07;细胞凋亡率分别为（6.2±1.5）％、（2.8±1.1）％、（21.4±3.9）％;每个视野（200倍）的穿膜细胞数分别为（115.8 ±23.2）、（256.4±38.6）、（45.8±18.2）个.siRNA组较空载体组的细胞增殖显著被抑制,穿膜细胞数显著减少,而细胞凋亡率显著增加（P值均＜0.05）.过表达组较空载体组的细胞增殖显著增强,穿膜细胞数显著增加,而细胞凋亡率显著降低（P值均＜0.05）.结论 MT2-MMP基因沉默的AsPC-1细胞在缺氧条件下培养后细胞凋亡增加,增殖被抑制,侵袭力减弱.