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参照羊痘病毒(CaPV)P32的基因序列,设计合成了2套引物和1条探针,建立了实时荧光定量PCR技术,对细胞培养物、皮肤丘疹、痂皮等组织病料中的GPV进行了特异性检测和敏感性试验。结果显示,用300nmol/L引物浓度和200nmol/L探针浓度,获得的CT值较小,而△Rn最大;可检测到相当于0.1TCID50的病毒DNA;制作的标准曲线中各浓度范围内有极好的线性关系且线性范围宽,相关系数为0.9995以上;组内和组间试验重复性的变异系数分别为2.3%和3.4%;与常规的PCR相比较,该方法具有快速、特异、敏感、可定量,可同时检测大量样品等优点。表明,荧光TaqMan PCR是一种检测CaPV的良好方法,可对组织病料中低含量的CaPV或持续带毒宿主进行准确检测。 相似文献
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针对羊痘病毒(capripoxvirus,CaPV)的A29L基因和羊口疮病毒(orf virus,ORFV)的H3L基因,设计、合成了2对特异性引物以进行二重PCR。结果表明,该方法可以在数小时、在同一反应体系中清晰地区分CaPV和)ORFV,其PCR产物大小分别为413bp和708bp,与预期的片段大小相符,序列分析证实目的基因序列与已发表的序列一致;该检测方法的灵敏度可达1个病毒蚀斑形成单位(PFU)。采用二重PCR对12株CaPV、ORFV和相关病毒、细菌培养物,以及22份田间样品进行检测,与预期结果完全一致,且与相关病毒或健康羊组织样品无交叉反应。结果表明,该方法具有快速、敏感、特异等优点,可作为临床样品中CaPV和ORFV的鉴定和诊断的有效方法。 相似文献
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根据GenBank发表的山羊痘病毒(goatpox virus,GPV)和羊口疮病毒(orf virus,ORFV)基因序列,分别合成针对GPV ITR和ORFV H2L基因片段的2对引物,以GPV和ORFV的核酸混合物作为模板,经优化反应条件,成功建立了快速鉴别检测GPV、ORFV的双重PCR方法。特异性试验结果显示,该方法对GPV与ORFV核酸的扩增能获得289和507 bp的特异性目的片段,而对FMDV、FPV、BTV、健康山羊皮肤的核酸扩增均为阴性;敏感性试验结果显示,该方法对GPV核酸的最小检出量为4 pg,对ORFV核酸为0.4 pg;对临床采集的12份病料进行双重PCR扩增,GPV检出率为25%(3/12),ORFV的检出率为75%(9/12)。结果表明,建立的双重PCR方法具有特异性强、敏感性高、快速简便等特点,可用于GPV或/和ORFV临床感染病例的联合检测与鉴别诊断。 相似文献
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感染细胞与痘疹样本中山羊痘病毒PCR检测方法的建立 总被引:1,自引:0,他引:1
比较Trizol法和SDS-蛋白酶K法提取山羊痘病毒DNA后,根据山羊痘病毒P32基因设计引物,建立了能检测感染细胞培养物与组织病料的PCR方法,结果显示以SDS-蛋白酶K法提取的病毒DNA在含量与纯度上均明显高于Trizol法;该PCR方法对山羊痘标准毒株细胞感染物能扩增出特异性的DNA条带,最小检出量为40.625ng;且能检出山羊痘疫苗毒Y株、贵州现场分离毒LD株和QL株的细胞感染物以及山羊痘疹样本中病毒DNA,而对鸡痘疫苗毒株感染细胞、正常细胞及正常山羊皮肤均为阴性反应。这些结果表明,建立的PCR方法具有特异性强、可靠性好、灵敏度高等特点,可用于山羊痘的临床诊断。 相似文献
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为了建立一种灵敏、特异、快速的山羊痘病毒实时定量检测方法,根据山羊痘病毒(AY077835)gp006基因序列,应用Beacon Designer 7.7软件设计合成一对PCR引物。将被检测的目的 DNA片段克隆PEASY-T1质粒,制备重组质粒标准品,以期建立以质粒拷贝数为单位的标准曲线。通过反应条件的优化及引物浓度的筛选,建立了山羊痘病毒SYBR GreenⅠ实时定量PCR(real-time PCR)检测方法,最佳引物浓度为400nmol/L。组内重复试验和组间重复试验变异系数均低于2%,最低检测限为1×101 copies/μL,上机检测时间在1h以内。用该方法对2011年流行于云南华坪、景谷及2003年流行于云南宣威、寻甸和昆明的山羊痘临床组织样品进行定量检测,结果送检组织样品抽提DNA中病毒含量分别为1.03×105、5.30×103、1.51×104、4.74×103、7.20×104 copies/μL。结果表明,所建立的real-time PCR具有灵敏、特异、快速的特点,适合于山羊痘临床组织样品的定量检测。 相似文献
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为建立一种灵敏、准确、快速的山羊痘病毒(GTPV)和小反刍兽疫病毒(PPRV)双重PCR检测方法,根据GenBank上登录的GTPV、PPRV两种病毒的基因序列设计检测引物,在常规PCR基础上,对反应条件及反应体系进行优化,建立了这两种病毒的双重PCR检测方法,并进行了特异性、敏感性检验。结果显示:仅GTPV和PPRV核酸样品扩增出与预期目标相符的目的片段,而其他病原对照均未出现目的条带;GTPV的最低检出量为0.283 ng/μL,PPRV的最低检出量为6.459 ng/μL。结果表明,本研究建立的双重PCR检测方法可一次性同时完成PPRV、GTPV两种病原的检测,且具有较高的特异性和敏感性。本方法的建立为山羊痘和小反刍兽疫的临床诊断、流行病学研究、疫情监测提供了技术支持。 相似文献
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为了建立一种快速检测猪繁殖与呼吸综合征病毒并且能够区分普通毒株和高致病性毒株的荧光PCR方法,根据GenBank已经公布的国内发表的高致病性PRRSV NSP2基因序列,针对Nsp2缺失区设计一对引物和探针,在结合PRRSV通用检测引物探针进行荧光定量PCR,对反应条件进行优化,用已知PRRSV普通株和高致病性株及其他病毒进行试验.结果表明,该方法可以特异检测并区分高致病性株和普通株.将该方法用于临床标本的检测,通过对32份样本检测,通用阳性为28份,阳性率为87.5%.高致病性株为17份,阳性率为59.38%.表明建立的方法可以用于PRRSV的快速检测,并且可以区分普通株和高致病性株. 相似文献
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猪细小病毒PCR检测方法的建立与应用 总被引:21,自引:0,他引:21
根据已报道的猪细小病毒基因组序列,设计并合成了1对寡核苷酸引物,通过对影响PCR扩增因素的筛选,成功地从猪细小病毒感染的组织和细胞中扩增出445bp片段,回收该片段用EcoR I酶切得到了预期的结果,证实了该扩增片段的特异性。敏感性试验表明,该方法可以检测出10^-4个TCID50的病毒含量。利用该方法对临床上24份流产病科的检测,查出阳性16份,而同时利用HA检测阳性只有10份。这些结果说明本试验建立的PCR诊断方法灵敏度高、特异性强。 相似文献
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根据GenBank中的牛结核分枝杆菌IS6110的基因片段,设计了1对引物,通过对PCR反应条件进行优化,研制了用于检测牛结核病的PCR试剂盒,该试剂盒扩增的阳性条带为317 bp;敏感性结果显示,该PCR检测试剂盒的最低核酸检测量为1.025 pg/μL;特异性试验表明,仅结核分枝杆菌扩增结果为阳性,副结核分枝杆菌、胸膜肺炎放线杆菌、大肠杆菌、巴氏杆菌、沙门氏菌、金葡萄球菌、链球菌的扩增结果均为阴性。-20 ℃至少可保存12个月,且重复性良好。应用该PCR试剂盒对24份临床样本进行了检测,其PCR检测结果与结核菌素试验检测结果相一致。结果表明,牛结核病PCR检测试剂盒能够对牛结核临床样本进行快捷、灵敏、准确的检测。 相似文献
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为建立羊痘病毒(CaPV)的环介导等温扩增(LAMP)检测方法,本研究根据GenBank中羊痘病毒的保守基因序列,设计出针对羊痘病毒的LAMP引物,利用LAMP Real Time Turbidimeter LA-320仪优化得到病毒核酸等温扩增最佳条件是62 ℃恒温反应60 min。在此条件下,病毒核酸的最低检测含量为3.1×10-2 pg/μL,灵敏度比OIE推荐的PCR方法高104倍。添加钙黄绿素(calcein)建立的目测法,还可实现对上述病原体检测结果肉眼观察。本研究获得的CaPV LAMP仪器法和目测法可特异性地扩增羊痘病毒属的山羊痘病毒、绵羊痘病毒及牛疙瘩皮肤病病毒核酸,具有反应快速、特异性强、灵敏度高、操作简便、设备要求低等特点。 相似文献
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ZHENG Jia-qi HUANG Hai-bi WANG Xiao-hui LI Zhen-ya XING Meng-en HAO Yong-qing 《中国畜牧兽医》2015,42(9):2240-2245
In order to establish a duplex PCR method for simultaneous detection of Mycoplasma ovipneumiae and Mycoplasma arginini, specific primers of Mycoplasma ovipneumiae and Mycoplasma arginini were designed, and evaluated its sensitivity and specificity after optimizing the reaction conditions of PCR.Then, a total of 40 nasal swabs were tested by duplex PCR.The assay could specifically amplify PCR fragments of 545 and 806 bp from Mycoplasma ovipneumiae and Mycoplasma arginini, respectively.While no PCR products were detected for other pathogens.The detection limits of the assay were determined to be 100 pg/μL for Mycoplasma ovipneumiae and 10 pg/μL for Mycoplasma arginini.The duplex PCR could detect Mycoplasma ovipneumiae and Mycoplasma arginini, and the coincidence rate could reach as high as 92.5% with enrichment culture about the 40 nasal swabs.The results suggested that the duplex PCR could be useful for clinical detection of Mycoplasma ovipneumiae and Mycoplasma arginini. 相似文献
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为建立绵羊肺炎支原体和精氨酸支原体的双重PCR检测方法,本试验分别设计了绵羊肺炎支原体和精氨酸支原体的特异性引物,优化反应条件后对其特异性和敏感性进行评价,并对40份鼻拭子进行了检测。结果显示,该方法能同时扩增出绵羊肺炎支原体545 bp和精氨酸支原体806 bp的特异性片段,而对其他病原的DNA扩增均为阴性。该双重PCR方法对绵羊肺炎支原体和精氨酸支原体的最低检测限分别为100和10 pg/μL。40份鼻拭子检测结果显示,双重PCR检测方法与分离培养法符合率高达92.5%,均能鉴定出绵羊肺炎支原体和精氨酸支原体。结果表明,本研究建立的双重PCR方法可用于绵羊肺炎支原体和精氨酸支原体的临床快速诊断。 相似文献