水产品中副溶血性弧菌实时荧光PCR检测方法

建立了一种特异、灵敏、稳定的副溶血性弧菌(Vibrio parahemolyticus,VP)致病基因的检测方法。对已建立的副溶血性弧菌致病基因tdh、trh和tlh荧光PCR方法的特异性、灵敏度和重复性进行检测,以验证该方法的有效性。该方法与副溶血性弧菌反应良好,与其他弧菌属和非弧菌属的6株常见食源性致病菌无交叉反应;检测了6株副溶血性弧菌标准菌株和分离株,3种致病基因检出限分别为tlh 6～43 CFU/mL,tdh 97～1 700 CFU/mL,trh 1 100～4 000 CFU/mL;3种致病基因20次重复组内变异系数在0.96%～1.50%,组间变异系数在2.70%～4.10%。该方法操作简便,特异性强,灵敏度高,能够准确、快速、灵敏地检测水产品中副溶血性弧菌。     

海产品中副溶血性弧菌免疫磁分离和环介导等温扩增快速检测方法的建立

采用纳米免疫磁珠分离副溶血性弧菌,建立副溶血性弧菌环介导等温扩增检测方法。方法 采用副溶血性弧菌单克隆抗体,制备纳米免疫磁珠,特异性吸附副溶血性弧菌,结合环介导等温扩增技术,建立副溶血性弧菌快速检测方法。结果 副溶血性弧菌纳米免疫磁珠在菌体浓度为10³cfu/ml水平时,对副溶血性弧菌的捕获率达到74%。免疫磁分离结合环介导等温扩增技术,在纯培养、无需增菌情况下,检测灵敏度达到140cfu/ml增菌液;通过对134株副溶血性弧菌和74株非目标菌的测试,环介导等温扩增技术具有良好的特异性;食品基质添加试验中,在增菌时间缩短至8h的条件下,其检测限为2cfu/25g样品。结论 副溶血性弧菌免疫纳米磁珠结合环介导等温扩增技术,有效缩短了增菌时间,适用于副溶血性弧菌的快速检测。     

冷冻水产品中副溶血性弧菌的实时荧光PCR检测方法研究

文章研发了一种可在16 h内完成冷冻水产品中副溶血性弧菌快速检测的方法。方法在首先完成样品的预增菌工作后,采用高温热裂解法与核酸亲和膜吸附法提取冷冻水产品等样品中的检材总DNA,设计副溶血性弧菌专一引物探针,运用实时荧光定量PCR技术扩增试样中副溶血性弧菌基因组保守基因片段,同时开展与国家标准方法的比对工作证实方法的可靠性,建立了特异性好、高检测通量的PCR检测方法。为验证所建立方法的适用性与稳定性,本研究从市场中随机抽取共331份冷冻水产品样品开展副溶血性弧菌的筛查检测,结果表明采用该方法在上述抽样调查的冷冻水产品中3份样品的副溶血性弧菌特异性的基因片段被扩增检验出,试样的目标菌检出率约为0.9%(3/331),该研究PCR方法的DNA检出限可达到0.01 ng/μL。     

双重实时荧光PCR检测副溶血性弧菌毒力基因方法的建立和应用

目的 建立一种同时检测副溶血性弧菌两种毒力基因tdh和trh的双重荧光聚合酶链式反应(PCR)方法,并对我国2 771株食源性副溶血性弧菌携带的毒力基因进行全面检测.方法 针对副溶血性弧菌tdh和trh毒力基因分别设计荧光PCR引物和探针,优化荧光PCR反应体系及反应程序,建立可同时检测两种毒力基因的双重荧光PCR检测...     

海产品中副溶血性弧菌检测方法研究进展

副溶血性弧菌是一种重要的食源性致病菌,已经成为我国食源性疾病暴发事件的重要致病因素之一。目前该菌的检测方法较多,但各有利弊。本文就现有的检测手段进行总结,以便为其检测方法的应用和发展提供参考。     

双重聚合酶链式反应快速筛查副溶血性弧菌流行株方法应用与评价

目的基于种属特异性tlh基因和典型毒力基因(tdh1_368特异性位点)建立双重聚合酶链式反应(duplex PCR,DPCR)检测副溶血性弧菌(VP)体系并评价。方法对建立的DPCR检测体系,用单盲法评估特异性和灵敏度,用人工模拟样品、腹泻标本和水产品进行现场方法学评估。结果该法具有高特异性(100%)和灵敏度(≥1.5 ng/μl),用所建立的方法和培养法平行检测腹泻标本、市售水产品中的VP,阳性率差异无统计学意义,对VP流行株的正确判断率为93.5%(29/31);对腹泻标本24 h内、模拟样品增菌后4～8 h内检测并报告VP大流行株。结论 DPCR结合常规样品增菌能加快样品中VP的检测和报告,为及时处理疫情提供技术支持。     

基于磁分离-上转换荧光标记的副溶血性弧菌免疫检测新方法研究

将上转换荧光标记与磁分离富集技术相结合,通过免疫识别成功构建了一种检测副溶血性弧菌(Vibrio parahaemolyticus)的新方法。首先通过水/溶剂热法合成NaY0.78F4:Yb0.20,Er0.02上转换荧光纳米颗粒,并对其表面进行氨基功能化修饰,同时一步法合成了氨基化Fe3O4磁性纳米颗粒。分别将副溶血性弧菌全菌抗体与磁性纳米颗粒连接作为捕获探针,将副溶血性弧菌的鞭毛蛋白A抗体与上转换荧光纳米颗粒连接作为信号探针。通过免疫识别形成捕获探针-目标菌-显示探针的"三明治"结构复合物,利用980 nm激光诱导荧光进行检测。在实验优化条件下,上转换荧光强度与副溶血性弧菌浓度在5×103~5×105cfu/mL范围内呈良好线性关系,检测限为1×103cfu/mL。用鲫鱼进行加标回收实验,结果表明,本方法准确性良好。     

海产品中副溶血性弧菌检测能力验证分析报告

目的通过参加英国FAPAS分析实验室组织的海产品中副溶血性弧菌检测能力验证,对其实验结果出现的异常现象进行分析,找出导致本次能力验证组织失效的原因。方法按照GB 4789.7-2013、SN/T1870-2016及相关作业指导书等进行实验,通过采用本实验室经常采用的检测方法进行检验,对实验出现的异常结果进行分析。结果发现M224d21A和M224d21B这2个冷藏运输箱包装的冻干样品由于储藏和运输等问题,导致未检出副溶血性弧菌。结论此次能力验证分析对于我院在海产品中副溶血性弧菌检测方面技术水平的提高和品牌形象的确立起到了积极作用,同时也为检验工作者对于能力验证出现异常现象提供一种解决问题的新思路、新方法。     

海产品中副溶血性弧菌防控技术研究进展

副溶血性弧菌是沿海省份引起食物中毒的一种主要的食源性致病菌,因此必须采取有效措施预防控制副溶血性弧菌在海产品中的污染。随着近些年人们对副溶血性弧菌防控技术研究的深入,总结出了大量的经验,开发出了许多新方法。本文主要从监管、净化、物理、化学及生物控制等方面对现有的副溶血性弧菌防控技术进行系统阐述,旨在为这些方法的应用和发展提供参考,进而为海产品的质量安全控制提供有利保障。      

海产品中副溶血性弧菌防控技术研究进展

副溶血性弧菌是沿海省份引起食物中毒的一种主要的食源性致病菌,因此必须采取有效措施预防控制副溶血性弧菌在海产品中的污染。随着近些年人们对副溶血性弧菌防控技术研究的深入,总结出了大量的经验,开发出了许多新方法。本文主要从监管、净化、物理、化学及生物控制等方面对现有的副溶血性弧菌防控技术进行系统阐述,旨在为这些方法的应用和发展提供参考,进而为海产品的质量安全控制提供有利保障。     

基于弧菌毒力基因多重PCR法的建立及其在副溶血弧菌毒力基因检测中的应用

针对副溶血弧菌常见的11种毒力基因(tox R、Collagenase、tox S、trh、tdh、tlh、Ure R、Fla A、omp W、Asp A、fur),建立了两套六重PCR检测体系,应用于副溶血弧菌环境分离株和水产品分离株的毒力基因分布情况调查。在调查的248株副溶血弧菌中,鞭毛丝蛋白基因Fla A、外膜蛋白基因omp W和铁吸收调节蛋白基因fur的分布最广(100%),其次为碱性丝氨酸蛋白酶基因Asp A(99.60%),胶原蛋白酶基因Collagenase、不耐热性溶血毒素基因tlh以及毒力调控基因tox R和tox S的分布率均在90%以上且tox R和tox S的分布极为相似,尿素酶基因Ure R的分布极少(1.21%),而耐热直接溶血素基因tdh和耐热相关溶血素基因trh在这248株副溶血弧菌中没有检出。本研究建立的多重PCR检测体系能快速、高效地检测多个毒力基因的分布情况,为副溶血弧菌的毒力机制研究和风险评估提供方法和依据。     

副溶血弧菌的多重PCR检测

副溶血弧菌是一种致病性弧菌,毒力因子主要有不耐热溶血毒素、耐热直接溶血毒素和相对耐热直接溶血毒素三种。本实验根据FDA标准推荐的引物对其进行了检验,发现副溶血弧菌环境分离株中没有耐热直接溶血毒素和相对耐热直接溶血毒素基因,仅有不耐热溶血毒素基因。     

北京口岸进口鲜活海产品中副溶血性弧菌致病性分析

目的调查从北京口岸进口的鲜活海产品中是否存在致病性副溶血性弧菌。方法对2005年从北京口岸进口的鲜活海产品中分离的267株副溶血性弧菌（Vibrio parahaemolyticus）的尿素酶活性、神奈川现象和毒性基因（tdh和trh）进行了检测。结果267株副溶血性弧菌中27株尿素酶呈阳性，其中14株菌tdh基因和砌基因呈阳性。tdh基因和trh基因呈阳性的14株菌中有10株菌神奈川现象为阳性，并且全部分离自从加拿大进口的象拔蚌。结论北京口岸进口的鲜活海产品中存在致病性副溶血性弧菌，主要集中在象拔蚌中。应对从加拿大进口的象拔蚌加强监管，防止致病性副溶血性弧菌引起食物中毒发生。     

三重real-time PCR检测副溶血弧菌主要毒力基因

针对编码副溶血弧菌的特异性基因和主要毒力基因tlh、tdh、ureR进行引物及探针设计,通过优化反应条件,建立基于Taqman探针快速检测副溶血弧菌毒力基因的三重实时聚合酶链式反应（real-time polymerase chain reaction,real-time PCR）方法。利用10 株副溶血弧菌和22 株非副溶血弧菌对设计的引物及探针进行特异性验证,结果表明设计的引物及探针具有很高的特异性;优化后的引物浓度分别为tdh 0.15 μmol/L、tlh 0.15 μmol/L、ureR 0.80 μmol/L,探针浓度分别为HEX 0.50 μmol/L、FAM 0.50 μmol/L;该方法即使在高浓度的背景细菌存在下,DNA浓度与Ct值均呈良好的线性关系,检出限为1.8×102 拷贝/mL;以完整菌细胞的悬液为模板时,预变性时间为30 min,扩增检测效果与以基因组DNA（gDNA）为模板相当（ΔCt＜1）。本研究建立的三重real-time PCR方法能实现快速定量检测副溶血弧菌,并能有效区分致病性及非致病性副溶血弧菌,为副溶血弧菌的快速定量检测和风险评估提供快速、灵敏、准确的方法。     

Quantitative Determination of Vibrio parahaemolyticus by Polymerase Chain Reaction

Abstract

A method for quantitative detection of Vibrio parahaemolyticus, based on the polymerase chain reaction (PCR), was developed. Several lysis methods were compared and a recently developed lysis solution proved effective. The PCR amplification products were visualized after agarose gel electrophoresis with the nucleic acid stains GelStar and ethidium bromide. The relative fluorescent intensity of the DNA bands was analyzed using the NIH Image 1.61 software program. The GelStar stain was found to be more sensitive than ethidium bromide. The limit of detection by staining DNA bands with GelStar was 16 CFU per PCR and 48 with ethidium bromide. A log-linear relationship between the number of CFU per PCR reaction and the fluorescent intensity of the DNA bands was obtained and calibration curves were generated.     

Quantitative Determination of Vibrio parahaemolyticus by Polymerase Chain Reaction

A method for quantitative detection of Vibrio parahaemolyticus, based on the polymerase chain reaction (PCR), was developed. Several lysis methods were compared and a recently developed lysis solution proved effective. The PCR amplification products were visualized after agarose gel electrophoresis with the nucleic acid stains GelStar and ethidium bromide. The relative fluorescent intensity of the DNA bands was analyzed using the NIH Image 1.61 software program. The GelStar stain was found to be more sensitive than ethidium bromide. The limit of detection by staining DNA bands with GelStar was 16 CFU per PCR and 48 with ethidium bromide. A log-linear relationship between the number of CFU per PCR reaction and the fluorescent intensity of the DNA bands was obtained and calibration curves were generated.     

基于DNA染料EMA的RT-PCR技术定量检测海产品中病原性副溶血弧菌活细胞

将一种DNA染料叠氮溴化乙锭(ethidium bromide monoazide,EMA)与实时定量聚合酶链式反应(RT-PCR)技术相结合,建立一种能选择性定量检测牡蛎中trh阳性副溶血弧菌活细胞的新方法。结果表明：使EMA成功插入死细胞DNA并且光解溶液中游离EMA的最佳曝光时间为20min;不抑制副溶血弧菌活细胞DNA扩增的最大EMA质量浓度为2.0μg/mL;完全抑制热致死细胞DNA扩增的最小EMA质量浓度为1.0μg/mL;人工污染牡蛎样品,不经过富集,在2.0×103～2.0×107CFU范围内细胞数的常用对数值与Ct值之间呈严格的负相关性,并且纯培养与人工污染牡蛎样品的RT-PCR检测限均为2×103CFU,即人工污染牡蛎样品的RT-PCR检测灵敏度为每克牡蛎样品400个活细胞;冻融实验表明,在温度低于55℃的水浴中对冷冻海产品进行解冻时,冻融过程对副溶血弧菌活细胞几乎没有影响。该方法是一种快速、灵敏且能有效鉴别并定量检测病原活细胞的新方法。     

荧光染料EMA在实时荧光PCR定量检测海产品中致病性副溶血弧菌活细胞中的应用

将荧光染料--叠氮溴乙锭(ethidium bromide monoazide,EMA)与实时荧光-聚合酶链式反应(real-time polymerase chain reaction,RT-PCR)技术相结合,对其在RT-PCR定量检测海产品中致病性副溶血弧菌活细胞中的应用进行研究。纯培养条件下,在2.2×102～2.2×107CFU范围内细胞数的常用对数值与Ct值之间呈严格的负相关性,并且不添加EMA时的检测灵敏度(22CFU)略大于添加EMA(2.2×102CFU)时的检测灵敏度;人工污染牡蛎样品,利用RT-PCR和EMA RT-PCR以及平板计数法分别进行副溶血弧菌定量检测,结果表明EMA RT-PCR更接近于平板计数的结果,单纯RT-PCR定量的结果偏大;在采集的45份海产品样品中,不经富集培养,利用EMA RT-PCR方法仅有一份牡蛎样品呈阳性,牡蛎样品污染程度为114CFU/g。该方法能够快速、灵敏、准确地进行海产品中致病性副溶血弧菌活细胞的定量检测,具有很好的应用价值。