乌珠穆沁羊Myostatin基因的分子克隆及序列分析

采用纯种(多胸椎个体)乌珠穆沁羊,对该品种MSTN基因进行PCR分段扩增并克隆和测序。利用DNAMAN进行序列拼接,获得乌珠穆沁羊MSTN基因全长序列。该基因由3个外显子和2个内含子组成,外显子大小分别为373,374,381 bp,内含子大小分别为1 833,2 030 bp。CDS序列全长为1 128 bp,由375个氨基酸组成。MSTN基因编码蛋白的理论分子质量约为42.8 ku,PI值为7.01,亮氨酸的含量最高(9.9%),其次是赖氨酸(8.3%)。乌珠穆沁羊基因编码蛋白二级结构以随机卷曲结构为主,属于跨膜蛋白,跨膜区位于AA6-AA23之间,具有一个分泌信号肽结构。其氨基酸序列MQKLQICVYIYLFMLIVA具有TGF-β家族的特征。     

芝麻主要过敏原油质蛋白的基因克隆和原核表达

为克隆黑、白芝麻主要过敏原油质蛋白Oleosins的基因并在原核细胞中对其进行表达,本研究分别提取黑、白芝麻的总RNA,逆转录合成cDNA,根据序列设计简并引物,扩增芝麻主要过敏原油质蛋白Oleosins基因的完整开放阅读框,并与pET-28a载体连接,测序鉴定后转化大肠杆菌E.coliBL21（DE3）及用IPTG诱导表达。结果表明克隆获得黑、白芝麻主要过敏原油质蛋白Oleosins的全长基因约为438bp的开放阅读框（包括终止密码子）,编码145个氨基酸。所编码的蛋白相对分子质量约为15.5kDa,为小分子量蛋白,等电点为5.18,与理论值相符。序列同源性分析发现其与数据库中已知的黑、白芝麻油质蛋白Oleosins基因同源性很高（GenBank黑、白芝麻油质蛋白基因登录号分别为EU999158和EU999159）,并在DE3中高效表达。     

烤烟ζ-胡萝卜素脱氢酶基因的克隆与生物信息学分析

利用同源克隆和电子克隆方法,从烤烟栽培品种韭菜坪2号(Nicotiana tobacum cul.Jiucaiping2)中克隆获得烤烟ζ-胡萝卜素脱氢酶(zeta-carotene desaturase,ZDS)基因的全长cDNA序列(命名为T-zds1),并对其编码蛋白的一级、二级进行了预测。该基因在GenBank中的登录号为JF975566,全长为2312 bp,编码的蛋白含588个氨基酸,蛋白登录号AEG73891。BLASTp搜索结果及进化分析结果表明,烤烟T-zds1基因编码氨基酸序列与番茄、向日葵、胡萝卜ZDS基因编码氨基酸序列的相似性分别为97%,92%,90%。     

甜杏仁和苦杏仁野黑樱苷水解酶基因的克隆

以轮台小白杏（甜杏仁品种）和甲麦黄杏（苦杏仁品种）为实验材料,采用同源基因克隆方法克隆野黑樱苷水解酶（prunasin hydrolase,PH）基因。轮台小白杏PH基因命名为PaLTPh（GenBank登录号：KF888615）,序列长度3 686 bp;甲麦黄杏PH基因命名为PaMJPh（KF888616）,序列长度3 690 bp。PaLTPh和PaMJPh与扁桃Ph691基因相似性为94%。根据PaLTPh和PaMJPh保守区序列设计引物,克隆编码区（coding sequence,CDS）序列。PaLTPh CDS（KF888617）和PaMJPh CDS（KF888618）序列长度均为1 635 bp,与扁桃Ph691全CDS区相似性为97%。PaLTPh CDS和PaMJPh CDS序列均为全长的开放阅读框,编码蛋白质长度为544 个氨基酸。PaLTPH蛋白和PaMJPH蛋白均包含长度为26 个氨基酸的信号肽和糖基水解酶家族Ⅰ结构域,可催化野黑樱苷水解为扁桃腈和葡萄糖。杏PH基因与扁桃Ph691具有高度的同源性。     

变形假单胞菌葡萄糖酸脱氢酶操纵子的克隆与分析

该研究旨在明确变形假单胞菌JUIM01葡萄糖酸脱氢酶操纵子的结构及其基本的生物学信息。采用LA-PCR技术,从菌株JUIM01中克隆葡萄糖酸脱氢酶操纵子(gad操纵子)的全长序列;利用在线生物信息学工具,对克隆的序列进行分析;通过对变形假单胞菌膜结合葡萄糖酸脱氢酶的组成和结构分析,初步验证克隆和序列分析的结果。研究结果表明,变形假单胞菌gad操纵子具有3个结构基因gndS、gndL和gndC,分别编码膜结合葡萄糖酸脱氢酶的3个亚基。变形假单胞菌gndS基因与解淀粉欧文氏菌CFBP1430葡萄糖酸脱氢酶小亚基的编码基因的序列一致性为59.89%,其编码的蛋白属于gluconate_2-dh3 superfamily,为跨膜蛋白;基因gndL与铜绿假单胞菌PAMH19葡萄糖酸脱氢酶大亚基的编码基因的序列一致性为77.68%,其编码的蛋白属于GMC_oxred_C superfamily,为跨膜蛋白;基因gnd C与香茅醇假单胞菌P3B5葡萄糖脱氢酶中亚基的编码基因的序列一致性达85.31%,其编码的蛋白属于CccA superfamily。该结果为变形假单胞菌葡萄糖酸脱氢酶的转录调控机制研究提供了一定的理论基础。     

白菜型油菜八氢番茄红素脱氢酶基因PDS3的克隆与序列分析

利用电子克隆技术,从数据库中找到与拟南芥高度同源的油菜EST序列,继而通过RT-PCR和RACE等方法,成功克隆了白菜型油菜八氢番茄红素脱氢酶（类胡萝卜素合成途径中的一个关键限速酶）基因PDS3的cDNA,命名为BrPDS3（GenBank登记号GQ200741）。cDNA序列全长1 940bp,其中包含114bp的5＇前导序列和134bp的3＇不翻译序列,编码区长度为1 692bp,编码63kD的蛋白。序列分析表明,BrPDS3蛋白与其他植物的PDS蛋白具有较高相似性;在系统进化树中,BrPDS3与甘蓝亲缘关系最近。根据全长cDNA序列设计引物,从白菜型油菜青油13号DNA中克隆得到BrPDS3基因的全长DNA,长度为3 911bp,ORF（开放阅读框）1 692bp,含有15个外显子和14个内含子。     

贝酵母SSU1基因的克隆与分析

目的:克隆贝酵母SSU1基因,对其进行序列分析。方法:采用PCR技术首次在贝酵母基因组DNA中对SSU1基因序列进行全长克隆,用NCBI、ExPASy等网络数据库和ANTHEPROT等分子生物学软件分析其序列,对其功能进行预测,建立基于SSU1同源基因的系统发育树,对其分子进化进行分析。结果:克隆得到贝酵母SSU1基因,全长872 bp,包含1个387 bp的开放阅读框,编码126个氨基酸,其疏水性大于亲水性。编码的蛋白质不存在信号肽及卷曲螺旋结构,而含有跨膜区域。该蛋白为单链蛋白,主要由无规则卷曲和α-螺旋构成。基因编码的蛋白含有1个亚硫酸盐敏感蛋白SSU1及其运载体蛋白酶的TDT家族和1个TehA功能域。贝酵母与巴斯德酵母遗传关系较近。结论:贝酵母SSU1基因编码的质膜蛋白为疏水性转运蛋白,具有调节亚硫酸盐代谢的功能,是酿酒酵母中1个重要的亚硫酸盐调控基因。     

酿酒酵母抗镉基因CAD1的克隆和分析

目的:克隆CAD1基因,对其结构和功能进行预测,为后期研究利用该基因用于重金属镉的解毒作用及其他有毒物质的抗性研究打下基础。方法:使用PCR技术对酿酒酵母BZL06的CAD1基因序列进行全长克隆,再对其进行染色体定位和亲缘关系分析,使用在线分析工具ExPASy、ProtParam等对其编码蛋白质的一级结构、二级结构、三级结构、结构域和蛋白互作进行预测分析。结果:该CAD1基因位于Ⅳ染色体1318046~1319275;全长1230 bp,可编码409个氨基酸,亲缘关系分析表明该基因与酿酒酵母CEN.PK113-7D菌株CAD1基因(GenBank序列号为EIW11633.1)最为接近,同源性达到99%;编码的蛋白质为在细胞核中进行代谢调控的不稳定的亲水蛋白;存在明显的卷曲螺旋区域,不存在跨膜结构,二级结构预测中发现该蛋白主要存在α-螺旋和随机卷曲,β-转角与延伸链分散分布;预测存在bZIP和PAP1结构域;蛋白互作分析中相关系数0.7以上的蛋白有9个,其中相关系数为0.937的SKN7蛋白是CAD1蛋白。结论:分析结果得出克隆CAD1基因正确,其编码的蛋白结构不稳定,在细胞核中代谢,含有与重金属镉与其他有毒物的过表达中存在抗性的表达紧密相关的结构域bZIP和PAP1,在表达抗性时并与SKN7蛋白功能联系密切。     

烤烟八氢番茄红素合成酶基因的克隆与序列分析

利用同源性克隆方法,从烤烟栽培品种K326(Nicotiana tobacum K326)中克隆获得烤烟八氢番茄红素合成酶基因的全长cDNA序列(命名为T-psyl),GenBank中的登录号为HM345582,该基因全长为巧21 by,编码的蛋白含441个氛基酸,蛋白登录号为ADK25054,Blast搜索结果及进化分析结果表明,该基因序列与观赏烟草、番茄和辣椒的八氢番茄红素合成酶基因同源性分别为95%,91%,86%.其编码蛋白与观赏烟草、番茄、牛奶子的PSY基因编码蛋白一致率分别为97%,90%和74%.     

新型GH5家族β-甘露聚糖酶的基因挖掘及表达鉴定

为了获得性能优良的新型β-甘露聚糖酶,本研究采用基因挖掘技术从米曲霉(Aspergillus oryzae)RIB40基因组中挖掘到了2个假定的新型GH5家族β-甘露聚糖酶基因,分别命名为Aoman5A和Aoman5B。对这两条序列做了相关的生物信息学分析,同时借助p PIC9KM质粒将两个酶的成熟肽编码基因在Pichia pastoris GS115中实现了表达,并对表达产物进行了纯化和鉴定。生物信息学分析的结果表明Ao Man5A含有20个氨基酸残基的信号肽,而Ao Man5B含有21个氨基酸残基的信号肽和12个氨基酸残基的前导肽;序列比对的结果显示两个酶与目前已报道的序列最高的同源性分别为68%和79%,且Ao Man5A的N端还携带有一个1家族的CBM;三维结构预测的结果显示,两者均符合(α/β)8的TIM-桶状结构。表达鉴定的结果表明,在同样表达条件下,re Ao Man5A和re Ao Man5B上清液的酶活力分别为2.9、12.5 IU/m L;纯化后它们的酶比活力分别为8.3、104.2 IU/mg,前者的最适温度为35℃,而后者的最适温度为50℃,p H值特性的测定结果表明这两种酶均为酸性酶。硫酸-苯酚法测得re Ao Man5A和re Ao Man5B的糖含量分别为25.4%和12.6%,表明这两种重组酶均经过了糖基化修饰。本研究获得了两种新型的β-甘露聚糖酶,比较分析了它们的序列特征,并实现了它们的异源表达,为β-甘露聚糖酶的进一步研究及应用奠定了坚实的基础,也为其他新型酶的基因挖掘提供了可资借鉴的经验。     

栓菌漆酶的异源表达及重组酶碳端和氮端组氨酸标签修饰对酶学特性的影响

以来源Trametes sp.C30 的LAC3漆酶基因为研究对象,通过引物设计进行突变,在其C端和N端进行延长,分别引入6 个组氨酸标签,并异源表达于酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae中,将获得的重组酶进行比较发现漆酶末端氨基酸序列的改变对酶学性质的影响较大。C端引入组氨酸标签的重组酶的表达量不受影响,但是在N末端引入组氨酸标签的重组酶表达量只有LAC3的一半。添加组氨酸标签的融合蛋白对ABTS和SGZ两种底物的亲和力得到增强。而在酸碱稳定性耐受方面,与LAC3相比,N末端氨基酸的改变使其在酸碱稳定性方面得到了增强,中碱性条件下仍能保持较佳活性。C端和N端可塑性的研究对于漆酶新性状的获得具有重要意义。     

基于高通量技术分析龙门传统蜂蜜醋微生物多样性

测定蜂蜜醋pH、总酸、非挥发酸、氨基酸,结合宏基因组手段分析蜂蜜醋品质与蜂蜜醋菌种的关系。通过高通量技术分析,得到13490个Unigenes片段中95.37%能够注释到NR数据库,其中97.1%序列属于细菌界。微生物群主要菌属有Komagataeibacter、Gluconacetobacter、Acetobacter、Gluconobacter及少量Granulicella。共12374(91.73%)个ORFs比对到KEGG数据库,主要的碳水化合物及氨基酸代谢途径,分别为10和14条。蜂蜜醋品质分析中,发酵液共测得11种游离氨基酸,pH为2.13,总酸为33.5 g/L,非挥发酸为9.82 g/L。进一步分析几种主要功能微生物、代谢途径与醋品质的关系,表明木醋杆菌(Komagataeibacter xylinus)、欧洲葡糖醋杆菌(Komagataeibacter europaeus)、Gluconacetobacter sp.SXCC-1通过碳水代谢及氨基酸代谢途径产生乙酸、葡萄糖酸、丁酸、天冬氨酸、谷氨酸等风味物质。本研究为进一步优化传统龙门蜂蜜醋工艺和稳定产品质量提供理论依据。     

抗莠去津抗体基因构建及蛋白结构模拟

构建抗莠去津单链抗体基因,采用DNAStar软件对单链抗体基因进行氨基酸序列推导,用生物信息学在线网站预测莠去津单链抗体基本特性及二、三级结构。结果表明,抗莠去津单链抗体基因全长744 bp,对应248 个氨基酸,单链抗体相对分子质量约为26 061.9,等电点预测值7.81,为碱性蛋白质;二级结构中α-螺旋17 处,延伸链85 处,β-转角19 处,无规卷曲127 处;三级结构建模显示,重链和轻链的6 个环区共同组成了抗体的抗原结合区,符合单链抗体的结构特点,具有抗原结合位点的空间构象。该研究为抗莠去津单链抗体的进一步表达、纯化和活性研究奠定了基础。     

生物电化学法转化甘油生产1,3-二羟基丙酮

氧化葡萄糖酸杆菌中依赖辅基吡咯喹啉醌(Pyrroloquinoline Quinone,PQQ)的膜结合甘油脱氢酶(Glycerol dehydrogenase,GDH)是酶法转化甘油生成1,3-二羟基丙酮(1,3-Dihydroxyacetone,DHA)的关键酶。以铁氰化钾为电子媒介体,采用生物电化学法,再生甘油脱氢酶的辅基PQQ,从而实现酶法循环转化甘油生产DHA。设计电耦联反应装置,在(28±2)℃,370mV电压下反应18h,DHA质量浓度达到27.21g/L,甘油转化率为52.93%。     

牛肝谷氨酸脱氢酶的分离纯化及部分酶学性质

取新鲜牛肝,经匀浆、缓冲液抽提、正丁醇脱脂、硫酸铵分级沉淀、DEAE-Sepharose离子交换层析、Superdex-200凝胶过滤层析等方法纯化,获得了电泳纯的牛肝谷氨酸脱氢酶（glutamate dehydrogenase,GDH）。经过纯化后的结果：GDH的酶比活力为306.06 U/mg,纯化倍数为93.60 倍,酶活回收率为23.12%。GDH的分子质量为380.2 kD,亚基分子质量约为61.7 kD。酶学性质研究结果表明：GDH的最适反应温度为50 ℃,在温度为30 ℃以下时较稳定;最适反应pH值为8.2,该酶对烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（nicotinamide adenine dinucleotide,NADH）的Km值为0.696 mmol/L。甲醇、乙醇、异丙醇、Cd2+、Co2+、Ca2+、Ag+、Pb2+、Zn2+、Cu2+对该酶具有抑制作用,低浓度Ba2+、Mg2+、K+、Li+与乙二胺四乙酸（ethylenediamine tetraacetic acid,EDTA）对其具有一定的激活作用。     

永川豆豉发酵过程中总糖和氨基酸变化与滋味的形成

通过采集传统发酵过程中的永川豆豉样本,对其总糖、还原糖、糖化酶活性、总氨基酸、游离氨基酸构成进行测定。结果表明,在成品豆豉游离氨基酸中,鲜味氨基酸占总游离氨基酸的23.98%,鲜味风味突出。豆豉中甜味氨基酸和还原糖共同构成了其回甜的滋味特点。豆豉中短链脂肪酸和乳酸使其呈现一定的酸味,酚类物质和苦味氨基酸呈现一定的苦味。这些最终决定了永川毛霉型豆豉的特有的咸鲜回甘风味特点。