S100A7A在胃癌中的表达及对增殖转移的影响

目的 探讨S100A7A蛋白在胃癌细胞和组织中的表达及其对胃癌细胞恶性表型的影响。方法 采用免疫组化实验检测S100A7A在21例胃癌组织和癌旁组织中的表达特点;通过质粒转染构建S100A7A过表达胃癌细胞,分别采用细胞增殖实验（EdU法及平板克隆实验）、细胞迁移和侵袭实验（Transwell法及划痕实验）检测S100A7A对胃癌细胞增殖、迁移及侵袭能力的影响。结果 S100A7A蛋白在胃癌组织中的表达高于癌旁组织;过表达S100A7A能够促进胃癌细胞的增殖、迁移及侵袭能力。结论S100A7A是胃癌潜在的癌基因,有望成为该疾病新的诊断标志物及治疗靶点。     

S100A4、SEPT7在儿童胶质瘤中的表达及临床意义

目的:探讨S100A4、SEPT7在儿童胶质瘤中的表达及临床意义。方法:选取2012年1月~2017年1月我院神经外科手术切除的儿童胶质瘤标本98例为研究组,同期颅内肿瘤阴性尸检儿童正常脑组织标本50例为对照组。两组均采用免疫组化法检测S100A4、SEPT7的表达,计算其阳性细胞的标记指数和阳性细胞表达率,分析S100A4、SEPT7的表达和儿童胶质瘤的相关性。结果:S100A4在儿童胶质瘤中呈棕黄色颗粒散在分布,在细胞质和细胞间质中阳性表达。研究组S100A4阳性表达率高于对照组(P<0.05);研究组中高恶性组S100A4阳性表达率、S100A4蛋白标记指数均高于低恶性组(P<0.05)。SEPT7在儿童胶质瘤中的表达主要存在细胞质内。研究组SEPT7阳性表达率低于对照组(P<0.05);研究组中高恶性组SEPT7阳性表达率、SEPT7蛋白标记指数低于低恶性组(P<0.05)。结论:S100A4、SEPT7在同一级别儿童胶质瘤中的表达呈负相关,联合检测神经胶质瘤中的表达,对判断儿童胶质肿瘤的恶性程度及预后具有重要的临床意义。     

S-100A4和MMP-2在胃癌组织中的表达及意义

目的通过检测S-100A4和基质金属蛋白酶2(MMP-2)在胃癌组织中的表达,探讨其在胃癌侵袭和转移中的作用。方法采用SP法检测S-100A4和MMP-2在91例胃癌组织以及91例配对切缘正常黏膜和72例转移淋巴结组织中的表达,分析其与胃癌临床病理特征的关系。结果 S-100A4在切缘正常黏膜、原发癌和淋巴结转移灶中的表达率分别为12.1%、29.7%和29.2%;MMP-2在相应组织中的表达率为20.8%、58.2%和59.7%。S-100A4和MMP-2在胃癌组织中表达均明显高于正常黏膜组织(P<0.05),而且其表达与肿瘤的浸润程度密切相关。S-100A4与MMP-2在胃癌组织中的表达呈正相关(r=0.27,P<0.05)。结论 S-100A4和MMP-2的表达与胃癌的侵袭密切相关,联合检测S-100A4和MMP-2表达有助于判定胃癌临床病理特征及预后。     

人Regucalcin cDNA真核表达载体的构建及表达

目的构建人regucalcin（RGN）全长cDNA的真核表达载体，观察其在人肾皮质近曲小管上皮细胞（HK-2细胞）中表达。方法用RT-PCR技术扩增获得人HK-2细胞RGN全长cNDA，将扩增的产物连接入pMD18-T克隆载体上。将重绢质粒转化人大肠杆菌DHSa内并提取质粒，双酶切鉴定、DNA测序鉴定准确，再用双酶切方法将RGN基因定向连接到真核表达载体DECFP-NI中，构成pEGFP-RGN，将pEGFP-RGN转化人大肠杆菌DHSa内并提取质粒，双酶切鉴定、DNA测序鉴定准确。再用双酶切方法将RGN基因与EGFP定向连接到真核表达载体pcDNA3．1（＋）-zeocin中，构建真核表达pcDNA3．1-RGN-EGFP-zeo的重组体。将pcDNA3．1-RGN．EGFP-zeo转化人大肠杆菌DHSa内并提取质粒，双酶切鉴定、DNA测序鉴定准确，用脂质体转染入HK-2细胞。荧光显微镜、激光共聚焦显微镜观察pcDNA3．1-RGN-EGFP-zeo表达情况。结果RGNcDNA全长是897bp。以此构建的pcDNA3．1-RGN-EGFP-zeo真核表达载体，经DNA测序与GenBank中的人RGNcDNA序列一致。荧光显微镜、激光共聚焦显微镜观察到pcDNA3．1-RGN-EGFP-zeo转染的细胞中有绿色荧光蛋白的表达。结论本实验成功构建了pcDNA3．1-RGN．EGFP．zeO真核表达质粒，并在HK-2细胞中表达。     

侧脑室注射S100A4蛋白对局灶性脑梗死大鼠神经功能及脑内S100B表达的影响

目的：观察经侧脑室注射S100A4蛋白对脑梗死大鼠神经功能以及脑内S100B蛋白表达的影响。方法：36只健康成年SD大鼠线栓法成功复制大鼠大脑中动脉闭塞模型（MCA0）,随机分为A、B组各18只,术后第1天A组侧脑室行人工脑脊液注射;B组行S100A4蛋白注射。在MACO术后第1、7及14d时各组各取6只行神经行为学评分,免疫组织化学法检测脑内S100B蛋白的表达情况。结果：B组大鼠在术后第7,14天时神经行为学评分与术后第1天比较有明显下降（1．96±0．49、1．75±0．40与2．94±0．72,P〈0．05）,并低于相同时间点A组大鼠。S100B阳性细胞数在术后第7天2组脑内达到峰值,以后开始减少,2组间比较,B组少于A组（P〈0．05）。结论：侧脑室注射S100A4蛋白可一定程度改善脑梗死大鼠神经行为学功能缺损,减少S100B蛋白在脑内的表达。     

人同源盒基因HoxB4真核表达载体的构建及鉴定

本研究旨在构建人同源盒基因HoxB4真核表达载体并进行鉴定,为进一步研究HoxB4的作用提供物质基础。采用RT-PCR的方法从健康产妇脐血单个核细胞中扩增出该基因,并将HoxB4的PCR产物用EcoRI和BamHI双酶切后连接到用EcoRI和BamHI双酶切的带有EGFP编码序列和内部核糖体转入位点(IRES)的真核表达载体pIRES2-EGFP中,重组质粒在大肠杆菌DH5α内扩增后,对其进行双酶切及测序鉴定以证实载体构建成功。结果表明,双酶切和质粒测序结果证明HoxB4基因正确的连接到真核表达载体pIRES2-EGFP中,开放阅读框架正确,pIRES2-EGFP/HoxB4真核表达载体构建成功。结论 :利用PCR,DNA重组等分子生物学技术,成功构建了pIRES2-EGFP/HoxB4真核表达载体,为探讨HoxB4基因在造血干细胞的增殖和分化的调控功能提供了实验基础。     

人sTRAIL基因载体构建及其在真皮干细胞的表达

背景:基于肿瘤坏死因子(tumour necrosis factor,TNF)可溶性相关凋亡诱导配体(soluble related apoptosis inducing ligand,sTRAIL)抗瘤的生物特性,克隆sTRAIL基因,构建其真核表达载体,为肿瘤细胞凋亡的实验研究奠定基础.目的:构建真核表达载体pEGFP-N1/sTRAIL,并转染真皮干细胞,以探究sTRAIL基因导入真皮干细胞的表达情况.方法:采用RT-PCR二步法,以人胎盘组织总RNA为模板,扩增sTRAIL的cDNA序列,将其克隆入pMD18-T载体,随后亚克隆入载体pEGFP-N1中,构建其真核瞬时表达载体pEGFP-N1/sTRAIL,以Fugene 6转染技术,将sTRAIL基因导入真皮干细胞.倒置显微镜下观测转染后真皮干细胞生长变化及sTRAIL在其中的表达等情况.RT-PCR法对目的基因转染的真皮干细胞进行鉴定.结果与结论:克隆到sTRAIL基因的cDNA序列,成功构建了其真核表达载体,该真核表达载体能携带sTRAIL基因在真皮干细胞中正常表达.倒置显微镜下观测到转染后真皮干细胞生长状态与未转染的真皮干细胞无差异.以经sTRAIL基因转染的真皮干细胞该基因组DNA为模板,用RT-PCR法能扩增到sTRAIL基因cDNA序列.     

Tiam1基因慢病毒表达载体构建及其在HT29细胞中的表达

目的:构建Tiam1与绿色荧光蛋白(GFP)融合基因慢病毒表达载体,观察其在人结直肠癌HT29细胞中的表达.方法:通过酶切Tiam1/C1199HA质粒获得Tiam1 cDNA片段,并将其克隆到慢病毒载体表达质粒pCDF1-copGFP中,经酶切、测序鉴定.慢病毒表达质粒和包装质粒共转染293FT细胞,获得携带Tiam1和GFP融合基因的重组慢病毒.取病毒上清感染人结直肠HT29细胞株,荧光显微镜检测绿色荧光蛋白及免疫细胞化学检测Tiam1在靶细胞中的表达.结果:重组慢病毒质粒pCDF1-Tiam1-copGFP酶切鉴定结果与目的基因条带吻合,克隆测序结果与NCBI收录的Tiam1基因序列(NM_003253)完全一致.重组慢病毒质粒可高效转染293FT细胞,病毒包装效率为88.34%.收获慢病毒上清可高效感染HT29细胞,荧光显微镜下可观察到大量绿色荧光,感染效率为55.89%,感染后靶细胞中Tiam1稳定高表达.结论:成功构建了携带Tiam1与GFP融合基因的慢病毒表达栽体pCDF1-Tiam1-copGFP,并使目的基因在靶细胞中得到稳定表达,为进一步研究Tiam1基因的相关功能提供了优质的稳定转染载体.     

S100A4蛋白在结直肠癌中的表达及意义

[摘要] 目的 探讨S100A4蛋白在结直肠癌中的表达及其临床意义。方法 采用S-P免疫组织化学染色技术,检测68例结直肠癌组织和20例正常结直肠组织中S100A4蛋白的表达情况。结果 S100A4蛋白在20例正常结直肠组织中无阳性表达(0%),在68例结直肠癌组织中有42例(61.8%)呈阳性表达,两者统计学差异显著(P=0.003);S100A4蛋白的表达在结直肠癌不同年龄、性别、肿瘤部位、大体类型、组织学类型、分化程度中差异均无统计学意义(P>0.05);在不同Dukes分期、淋巴结转移、生存期中差异明显(P<0.05),且分期越晚、发生淋巴结转移、生存期短者表达越高。结论 S100A4蛋白表达与结直肠癌的侵袭和转移密切相关;S100A4蛋白可作为判定结直肠癌临床病理特征及预后的重要指标。     

S100A4和hMLH1在甲状腺腺瘤和滤泡癌中的表达及其鉴别诊断意义

目的探讨S100A4和hMLH1蛋白在甲状腺滤泡性良、恶性肿瘤中的表达及鉴别诊断意义。方法采用免疫组化PV-9000二步法检测60例甲状腺滤泡型肿瘤中S100A4和hMLH1蛋白的表达。结果 S100A4在甲状腺腺瘤及甲状腺滤泡癌中的阳性表达率分别为26.33%(7/30)和70%(21/30),而在30例癌旁正常组织中的阳性表达率为100%,腺瘤与滤泡癌间差异极显著(P<0.01)。hMLH1蛋白在甲状腺腺瘤及甲状腺滤泡癌中的阳性表达率分别为83.33%(25/30)和20%(6/30),两组差异极显著(P<0.01)。结论 S100A4和hMLH1蛋白在甲状腺滤泡性良、恶性肿瘤中的表达差异,有助于临床的鉴别诊断。     

大肠癌中P73、S100A4蛋白的表达及意义

目的探讨P73、S100A4蛋白在大肠癌、大肠腺瘤、癌旁正常组织中的表达情况,及其在大肠癌中表达与临床病理特征的关系,并分析二者的相关性。方法应用免疫组化PV二步法检测80例大肠癌、10例癌旁正常组织、10例腺瘤中的P73、S100A4蛋白的表达情况,并结合临床病理资料进行统计学分析。结果 P73、S100A4蛋白在大肠癌组织中表达明显高于正常组织和腺瘤(P0.05),P73蛋白的表达与大肠癌分化程度、有无淋巴结转移、肝转移及TNM分期有关(P0.05);S100A4蛋白的表达与有无淋巴结转移、肝转移、TNM分期有关(P0.05),2种蛋白在大肠癌组织中的表达呈正相关(P0.05)。结论:P73、S100A4蛋白在大肠癌中呈高水平表达,二者可能共同参与了大肠癌的发生发展过程。     

甲状腺滤泡性增生结节galectin-3和S100A4蛋白的表达

目的:研究galectin-3和S100A4蛋白在良恶性甲状腺滤泡性增生结节中的表达情况。方法:采用免疫组织化学方法检测68例甲状腺滤泡性增生结节中galectin-3和S100A4蛋白的表达,包括17例滤泡性腺瘤、6例腺瘤性甲状腺肿、14例滤泡型乳头状癌和31例滤泡癌。结果:Galectin-3和S100A4在甲状腺滤泡性增生结节恶性组中的阳性率显著高于良性组(P<0.001)。滤泡癌与滤泡型乳头状癌组间比较,galectin-3表达差异有统计学意义(P=0.019)。结论:Galectin-3和S100A4蛋白可作为鉴别良恶性甲状腺滤泡性增生结节较有价值的肿瘤指标,galectin-3对滤泡癌与滤泡型乳头状癌的鉴别诊断具有参考意义。     

S100A8在膀胱移行细胞癌中的表达及其临床意义

目的探讨S100A8在膀胱移行细胞癌(BTCC)组织中的表达及其临床意义。方法应用免疫组织化学方法检测68例BTCC和10例癌旁正常膀胱组织中S100A8蛋白的表达,并分析其与BTCC临床病理特征的关系。结果 S100A8蛋白在BTCC组织中表达阳性率为55.9%(38/68),10例癌旁正常膀胱组织中表达均为阴性,两组比较,差异有统计学意义(P<0.01);在低度恶性倾向尿路上皮乳头状瘤+低分级BTCC组织中表达阳性率为29.2%(7/24),高分级BTCC组织中表达阳性率为70.5%(31/44),两组比较,差异有统计学意义(P<0.01);在pTa-pT1期和pT2-pT4期表达阳性率分别为46.9%(23/49)和78.9%(15/19),两组比较,差异有统计学意义(P<0.05);在复发性BTCC组织和初发性BTCC组织中表达阳性率分别为72.7%(16/22)和47.8%(22/46),两组比较,差异无统计学意义(P>0.05)。结论 S100A8蛋白表达阳性率在BTCC组织中明显高于癌旁正常膀胱组织,其表达与BTCC的病理分期、分级呈正相关,随病理分期、分级的增高,S100A8蛋白表达阳性率增高,提示S100A8蛋白的表达与BTCC的发生、发展密切相关。检测S100A8蛋白有助于BTCC预后的评估。     

小鼠Cdc14A基因真核表达载体的构建

目的构建小鼠pcDNA3.1-MYC-细胞分裂周期14A(Cdc14A)真核表达载体,并观察和验证其在真核细胞中的表达。方法将化学合成的目的基因Cdc14A定向克隆至真核表达载体pcDNA3.1(+)中,经酶切和测序鉴定正确后,采用脂质体法转染HEK293细胞,通过Western blot检测细胞内Cdc14A的表达,并检测Cdc14A基因序列。结果 pcDNA3.1-MYC-Cdc14A真核表达载体构建成功,将其转染HEK293细胞48h,提取细胞蛋白,采用Western blot检测到细胞内Cdc14A的表达,并且测序结果与预期结果一致。结论成功构建了真核表达载体pcDNA3.1-MYC-Cdc14A,为研究Cdc14A在小鼠一细胞期受精卵G2/M期转换中的作用奠定了基础。     

抗人S100A7抗体的制备

目的 制备兔抗人S100A7（hS100A7）多克隆抗体。方法制备原核表达重组人S100A7,用纯化的hs100A7为免疫原免疫新西兰大白兔,制备兔抗人S100A7抗体,并以问接ELISA测定抗体效价,以Westernblot和免疫组织化学法鉴定抗体的特异性。结果成功制备了重组人S100A7及其抗体,ELISA结果显示抗体效价达1：16000,Western blot和组织化学法分析表明该抗体能特异结合hS100A7。结论以纯化的重组人S100A7为免疫原,成功地制备了效价高、特异性强的兔抗人S100A7抗体。     

人表皮生长因子基因真核表达载体的构建及其基因转染

目的：构建人表皮生长因子基因真核表达载体，并将其导入细胞中表达表皮生长因子重组蛋白。 方法：经HindⅢ、BarnHI酶切PGEM-TEasy-hEGF，将人表皮生长因子基因定向克隆到真核表达载体pcDNA3．1中。在脂质体的包裹下将pcDNA3．I-hEGF导入角膜组织细胞中，分别从DNA、RNA、蛋白质3个水平上检测人表皮生长因子基因表达情况。 结果：经T7／SP6和hEGF内套引物进行PCR扩增及酶切鉴定重组体，分别得到310bp和162bp两条基因片段，将162bp条带经纯化后用AVa皿限制性内切酶切鉴定，可分别得到89bp和72bp两条片段；将人表皮生长因子基因序列与Genbank上公布的序列相比，碱基同源性达98．2％，氨基酸完全相同；PCR，RT．PCR在转染后21d之内，在DNA、RNA水平上可检测到人表皮生长因子基因；免疫组织化学检恻法在转染后第3天可检测到人表皮生长因子蛋白表达，2周之后，人表皮生长因子蛋白表达结果转为阴性。 结论：pcDNA3．1-hEGF重组质粒与LipofectamineTM2000以适当比例混合形成的微囊可携带人表皮生长因子基因进入细胞内并表达功能蛋白。     

携带人OCT4A基因的慢病毒载体的构建及其稳定转染K562白血病细胞株的建立

本研究旨在构建共表达人OCT4A与绿色荧光蛋白（GFP）慢病毒载体pLVX-OCT4A-ZsGreen1,并通过感染获得稳定表达重组质粒的白血病K562细胞系,观察OCT4A在其中的表达。根据Gen Bank数据库提供的OCT4A mRNA序列,合成编码mRNA基因的特异性引物序列,通过RT-PCR技术扩增出OCT4A全长片段,克隆至pCR-Blunt载体。将OCT4A DNA片段酶切回收后克隆至经EcoR1酶切线性化的慢病毒载体pLVX-IRES-ZsGreen1,构建pLVX-OCT4A-ZsGreen1慢病毒重组质粒,利用测序鉴定所构建的重组载体是否正确。经三质粒包装系统包装后获得高滴度慢病毒颗粒并感染人白血病细胞系K562,通过流式细胞仪分选获得稳定表达的白血病细胞系,应用Real-time PCR和Western blot方法分别检测稳定转染细胞系的OCT4A mRNA和OCT4A蛋白表达。应用CCK-8法和平板细胞克隆形成试验测定OCT4A对K562细胞增殖能力的影响。结果表明,经限制性内切酶检测及基因测序证实成功构建了携带OCT4A基因的重组慢病毒;包装病毒颗粒超速离心后病毒滴度达（1.43±0.25）×10^8U/ml;病毒感染K562细胞后经流式细胞仪分选获得GFP＋细胞,实时定量PCR及Western blot证实病毒感染后OCT4A基因及蛋白的表达可有效上调;CCK-8法及平板集落形成试验显示病毒感染的K562细胞体外增殖活性明显升高,与对照组相比均有统计学差异（P〈0.05）。结论：成功构建了表达OCT4A基因的慢病毒载体,并且获得可稳定上调OCT4A表达的K562细胞株。     

hVPS4A 基因克隆及真核表达载体的构建

目的：克隆人细胞空泡蛋白分选因子4A（human vacuolar protein sorting 4A,hVPS4A）基因,构建其真核表达质粒。方法以 Huh7细胞 cDNA 为模板,设计引物扩增全长 hVPS4A 基因,再将目的基因插入到真核载体 pRK5中。重组质粒经PCR、酶切和 DNA 测序确认。结果从 Huh7细胞 cDNA 中扩增得到约1350 bp 大小的目的片段,经回收、纯化、酶切后与载体pRK5连接,转化 DH5α大肠杆菌。选择 PCR 鉴定阳性的重组质粒,经 EcoRⅠ单酶切可见约一条5900 bp 片段;经 EcoRⅠ和HindⅢ双酶切可得到4600 bp 和1350 bp 两个片段,分别与载体 pRK5和目的片段 hVPS4A 预期大小一致;DNA 测序结果显示插入片段与 hVPS4A 参考序列一致。结论成功构建了含 hVPS4A 基因的真核表达载体,为进一步研究 hVPS4A 的生物学功能提供了条件。     

鼻咽癌患者血浆中S100A8和S100A9蛋白浓度测定及临床意义

目的探讨鼻咽癌患者血浆中S100A8和S100A9蛋白水平与临床分期及血浆EB病毒VCA-IgA抗体的相关性。方法用ELISA法检测鼻咽癌患者(Ⅱ期36例,Ⅲ期104例,Ⅳ期104例)和104例体检健康者血浆中S100A8、S100A9蛋白浓度和EB病毒VCA-IgA抗体水平,用SPSS 16.0统计软件进行数据分析。结果鼻咽癌患者血浆中S100A8、S100A9蛋白浓度分别为0.44(0.25,0.78)ng/mL和202.71(185.79,238.54)pg/mL,显著高于体检健康者0.29(0.18,0.44)ng/mL和192.43(170.66,193.42)pg/mL(P均0.05)。Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ期鼻咽癌患者血浆S100A8、S100A9蛋白浓度均高于体检健康者(P均0.05),且Ⅱ、Ⅲ期鼻咽癌患者血浆中S100A8、S100A9蛋白浓度高于Ⅳ期(P0.05);Ⅲ期S100A9蛋白浓度高于Ⅱ期(P0.05)。相关分析结果显示,鼻咽癌患者血浆中S100A8、S100A9蛋白浓度与EB病毒VCA-IgA抗体水平无相关性(r分别为-0.04,-0.07,P均0.05)。结论鼻咽癌患者血浆中S100A8和S100A9蛋白水平升高,且与临床分期有关。     

利用基因工程技术构建重组人血小板因子4真核表达载体

目的：构建携带绿色荧光蛋白标签的重组人血小板因子4基因(plateletfactor4，PF4)的真核表达载体，并在真核细胞中表达，为研究其生物学功能奠定基础。方法：人工合成PF4基因模板，通过PCR方法扩增PF4-cDNA，然后克隆至pUCl9克隆载体，经序列测定后重组入pIRES2-EGFP真核表达载体并进行酶切鉴定。将鉴定正确的质粒用脂质体转染法瞬式转染至COS7细胞中。结果：获得了PF4-cDNA基因，序列分析表明，该序列与GenBank数据库中的序列一致。重组质粒酶切鉴定表明，PF4基因已与pIRES2-EGFP真核表达载体正确连接。荧光显微镜示，此载体成功转染至COS7细胞中。并获得有效表达。结论：利用基因工程技术，成功的构建了携带绿色荧光蛋白标签的PF4的真核表达载体，并在真核细胞中获得有效表达，为下一步研究其在真核细胞中的生物学功能奠定基础。