海藻糖合酶研究进展

介绍了海藻糖合酶的来源、性质、固定化及细胞透性化技术.并通过实例探讨适合海藻糖工业化生产的方法,展望海藻糖合酶固定化及透性化技术的研究趋势.     

壳聚糖固定化海藻糖合酶

利用壳聚糖作为载体,将大肠杆菌BL21异源表达且纯化后的海藻糖合酶(TreS),采用吸附法制备成固定化酶。固定化单因素实验结果表明,最适海藻糖合酶与壳聚糖的加入量为32.0 mg/g,最适吸附时间为2.5 h。固定化酶最适反应温度为40 ℃,最适反应pH为6.0,酶活回收率为40.17%,重复使用9次后,固定化酶酶活残留率为64.64%,重复使用性良好。在4~60 ℃范围内放置20 min后,固定化酶的相对酶活均高于87%,与游离酶相比温度稳定性没有明显变化。在pH3.5~8.5范围内放置20 min后,固定化酶的相对酶活均高于60%,酸碱稳定性优于游离酶。反应进程试验结果表明,2 h时海藻糖得率达最大,为61.4%。     

产海藻糖合酶嗜热菌的筛选

采用薄层层析及高效液相色谱对酶反应产物进行分析的方法,从地热水样中筛选出一株产胞内海藻糖合酶的嗜热菌CBS-01菌株。该菌株在固体培养基中细胞为杆状,在液体培养基中细胞通常为丝状,丝状体长度可变,好氧,革兰氏染色阴性,无芽孢,菌落呈圆形,表面光滑,凸起,边缘整齐,暗红色,生长温度范围为40～70℃,最适生长温度为55～60℃,生长pH范围为6.5～9.5,最适生长pH值为7.5～8.5,初步鉴定为亚栖热菌(Meiothermus sp.)。     

透性化海藻糖合酶的研究

海藻糖是一种新型食品添加剂 ,目前其主要生产方法是利用微生物酶法合成。文章研究了在不易破壁取得胞内酶的情况下 ,采用渗透处理细胞技术生产透性化细胞酶的方法 ,获得较高酶活力     

海藻糖合酶基因在毕赤酵母中的表达

首次构建来源于恶臭假单胞菌海藻糖合酶基因（AE015451.1）的真核表达载体,探索在毕赤酵母中的表达。PCR扩增目的基因,经EcoRⅠ/XbaⅠ双酶切后连接至同样双酶切的pPICZaA中,经PCR检测和序列测定准确后,通过电击法将重组质粒转入毕赤酵母GS115中,利用含Zeocin的YPD平板筛选到阳性转化子,提取阳性转化子基因组并利用特异性引物PCR得到一条与目的基因大小相同的条带,说明目的基因转入成功,诱导重组蛋白表达并用SDS-PAGE检测可见一条约76 ku与目的蛋白大小预测相符合的蛋白条带,最后HPLC检测重组蛋白可将麦芽糖特异转化为海藻糖,说明外源表达的海藻糖合酶具有一定酶活。通过PCR、SDS-PAGE和HPLC结果说明成功构建重组pPICZaA-TreS质粒并整合到巴斯德毕赤酵母的基因组上,且海藻糖合酶基因得到预期的表达并具有活性,为下一步研究奠定基础。     

细菌纤维素固定化海藻糖合酶的研究

以细菌纤维素为载体，采用吸附-交联的方法将海藻糖合酶固定化，在最适固定化条件下，15℃吸附20h，然后与6％戊二醛在15℃交联20h。实验发现，与游离酶相比，固定化酶的最适pH值向碱性方向移动0、4，为pH7．4，最适作用温度为45℃，比游离海藻糖合酶提高10℃，酸碱稳定性、热稳定性均有较大提高；重复使用6次后，酶剩余活力保持在87％左右，有较好的操作稳定性和重复使用稳定性。     

海藻糖合酶固定化及细胞透性化技术的研究进展

介绍了海藻糖合酶性质、固定化及细胞透性化技术.通过几个海藻糖合酶固定化及透性化技术的实例,探讨适合海藻糖工业化生产的方法,展望海藻糖合酶固定化及透性化技术的研究趋势.     

透性化细胞海藻糖合酶特性的研究

海藻糖是一种新型食品添加剂，目前多以微生物酶法生产。海藻糖合酶是近年来新发现的一种海藻糖合成酶。本文研究了经渗透细胞技术处理得到的透性化细胞海藻糖合酶的酶学特性。结果表明，该细胞酶的反应最适温度为35℃，最适pH7.4,Mg^2 及K^ 对该细胞酶有明显激活作用，Zn^2 ,Mn^2 及Cu^2 则可强烈地抑制酶活力。该酶对底物特异性极强，能特异性地将麦芽糖转化为海藻糖。     

Lys490饱和突变提高海藻糖合酶转化率的研究

分析预测海藻糖合酶的空间结构,并进行分子对接和序列比对,选择Lys490位点进行定点饱和突变。利用全质粒PCR方法构建饱和突变体库,并利用高效液相色谱法筛选优势突变。经过筛选获得优势突变体K490L、K490I,对比分析表明,突变体K490L、K490I的转化率较原始酶分别提高了18%和15%。突变体酶学性质分析表明,K490L、K490I的最适反应温度及最适pH与原始酶保持一致,皆为25℃和pH 8.0,但两种突变酶的耐热性及耐酸性较原始酶有明显增强。在pH 7.0环境下,突变体K490L、K490I放置60 min后,剩余酶活力均达80%以上,而原始酶低于68%。     

产海藻糖合酶菌株筛选的研究

通过高温、高渗等手段从土壤中筛选到l株产海藻糖合酶（trehalosesynthase）滑性较高的菌株T007，其生长湍度15℃-41℃、pH3．0～9．0，并能往〈7％的NaCl盐性培养基中生长。实验证实，T007菌广生的海藻糖合酶能以麦芽糖为底物合成海藻糖。     

大肠杆菌产海藻糖合成酶发酵条件优化

采用单因素试验和正交试验,研究海藻糖合成酶发酵过程中加诱导剂时菌浓OD600 nm、诱导温度、诱导时间、海藻糖合成酶转化海藻糖时间4个因素对转化率的影响,确定大肠杆菌产海藻糖合成酶转化海藻糖的最优条件组合。结果表明,转化时间和诱导温度对转化率的影响较大,在大肠杆菌生长到菌浓OD600 nm值为0.8时加诱导剂,诱导温度26 ℃保持8 h,在转化过程中反应14 h为最佳搭配。在此最佳条件下,海藻糖的转化率可达69.29%。     

基于DO-stat流加培养控制的海藻糖合成酶发酵条件研究

溶氧浓度对重组大肠杆菌的生长和外源蛋白的高效表达影响较大,为进一步增加菌体量和重组蛋白表达量,该研究采用DO-stat流加培养进行控制,分别研究了溶氧浓度20%、30%、35%和40%条件下大肠杆菌的生长情况以及海藻糖合成酶的表达情况。结果表明,当发酵罐中溶氧浓度控制在30%时,发酵40 h,菌体干质量可达53.9 g/L,是分批发酵时的6倍,海藻糖转化率达到80.9%,是分批发酵时的2.25倍。     

海藻德合酶基因工程菌诱导表达条件的研究

实验将构建后的重组质粒pET21TreS转入大肠杆菌Rosetta gami(DE3)中,得到海藻糖合酶基因工程菌,并通过对培养时间、温度及诱导剂浓度等条件的优化,对其进行诱导表达,得到了该基因工程菌诱导表达的最适条件:发酵培养至菌体浓度(OD_(600))至0.6～0.8时,以1mmol/L浓度的异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTC),37℃,诱导2h后得到的蛋白表达量较高.     

重组海藻糖合酶工程菌高密度发酵条件的研究

目的:通过对前期构建的海藻糖合酶基因工程菌进行高密度发酵的研究,获得了其高密度工艺条件。方法:采用摇瓶发酵和10L自控罐高密度发酵研究了培养基、pH、发酵方式对工程菌生长及目的蛋白表达的影响,并考察了工程菌中重组质粒的遗传稳定性。结果:海藻糖合酶基因工程菌高密度发酵的培养基为2YT+0.2%葡萄糖,最适pH为7.0,发酵方式为分批补料,通过10L自控罐高密度发酵最终得到的工程菌细胞密度达到了50.78g/L,酶活达到了3.197U/mL。所构建的重组质粒在宿主中得到了稳定遗传。结论:优化了海藻糖合酶基因工程菌高密度发酵的条件,为海藻糖规模化生产奠定了基础。      

海藻糖生物合成及应用研究进展

海藻糖是一种非还原性二糖,是生物细胞抵抗不良环境的应激代谢产物,它可广泛用于食品、化妆品、生物医药和农业等领域。本文对最近几年海藻糖在生物细胞中的合成途经及酶调控机制、海藻糖生产合成方法及生产菌种、海藻糖对生物细胞保护作用机理及海藻糖在相关领域中的应用等研究进展进行了综述。      

水生栖热菌FL-03海藻糖合酶基因克隆及原核表达

海藻糖合酶(Trehalose synthase,TreS)属于α-淀粉酶家族(α-amylase family),是生物体内通过TreS途径生成海藻糖的一种酶类。利用PCR技术,从水生栖热菌FL-03菌株FL-03中扩增了海藻糖合酶基因(TresC01),将其克隆到原核表达载体pET-28a(+),得到重组质粒P-TresC01,转化E.coliBL21(DE3),IPTG诱导表达,重组蛋白经SDS-PAGE分析,得到一条分子量约为110ku的特异条带,并经Western blotting分析鉴定,表明成功构建重组质粒P-TresC01并在大肠杆菌中表达,为进一步的研究奠定基础。     

酶法生产海藻糖研究进展

海藻糖是一种安全的非还原性二糖,广泛存在于自然界中,具有保湿性,抗冻抗干燥性,热酸稳定性等特殊的生物学功能,对生物大分子有着非特异性的保护作用,因此在医学、农业、化妆品、食品等行业应用潜力巨大.自20世纪80年代后,各国相继开展了海藻糖生理生化和分子生物学的研究,该糖现已成为国际上最近开发的主要低聚糖之一.本文介绍了海藻糖的生产背景、功能和机理、研究意义和酶合成的生产方法,着重讨论了透性化细胞技术生产海藻糖的国内外研究进展和意义,列举了一些有实际意义的实例,并指出在多种发酵生产海藻糖的技术中,利用基因工程大幅度提高酶活,将透性细胞固定,连续化生产海藻糖成为未来生产的趋势,特别是利用海藻糖合酶一步法转化麦芽糖为海藻糖最具应用前景.     

一株芽孢表面稳定展示海藻糖合酶工程菌的构建

以枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)168-Tres基因组为模板,PCR扩增得到同源臂基因sleB1和cwlJ1,重叠PCR连接sleB1与卡那霉素抗性(kmr )基因,电转获得B. subtilis 168-TresΔsleB菌株;连接cwlJ1与博来霉素抗性(zeor)基因,电转获得B. subtilis 168-TresΔsleBΔcwlJ菌株。结果表明,经kmr、zeor抗性筛选及PCR鉴定,成功获得sleB、cwlJ基因双缺失菌株B. subtilis 168-TresΔsleBΔcwlJ;发酵结果显示,B. subtilis 168-TresΔsleBΔcwlJ与出发菌株的芽孢形成率一致,约为88%;在LB固体培养基和麦芽糖转化生成海藻糖体系中B. subtilis 168-Tres的芽孢萌发数为4.8×108 CFU/mL,B. subtilis 168-TresΔsleBΔcwlJ芽孢未萌发;在麦芽糖转化生成海藻糖体系中,重组菌海藻糖合酶酶活为10.42 U,比原始菌提高了78.7%。敲除sleB、cwlJ基因后,不影响枯草芽孢杆菌生成芽孢的量,但能有效控制芽孢在上述转化体系中的萌发,使芽孢表面稳定展示海藻糖合酶,提高了芽孢的利用率。