人β防御素-2与前列腺癌特异性膜抗原嵌合蛋白真核表达质粒构建及其诱导的小鼠特异性免疫应答

探索人β防御素2(hBF)-2)和前列腺特异性膜抗原(PSMA)共表达重组核酸疫苗对前列腺癌的免疫治疗。研究以pcDNA3．1为载体,构建重组质粒pcDNA3．1／PSMA和pcDNA3．1／hBD-2-PSMA．通过RT-PCR和免疫组化检测其表达。并免疫小鼠,进行血清中抗体检测．CD4^ 、CD8^ T淋巴细胞数目测定及CTL特异性杀伤作用检测。结果显示构建的质粒转染COS-7细胞后能表达目的基因,     

人β-防御素2联合乙肝疫苗对小鼠免疫效应的研究

目的:探讨人β-防御素2加强乙肝疫苗对小鼠免疫应答的作用。方法:采用乙肝疫苗2μg/次/只联合HBD2基因真核表达质粒pEGF-C1/HBD2 100μg/次/只,按间隔2周、共免疫3次的左后肢股四头肌肌肉接种方案免疫BALB/c小鼠,同时设立相应的对照。免疫后用双抗原夹心ELISA法测小鼠血清HBsAb水平。采用流式细胞仪检测脾脏CD4+T和CD8+T细胞百分率及CD4+/CD8+比值。应用CCK8试剂盒检测脾淋巴细胞在不同抗原刺激下的增殖反应。结果:pEGF-C1/HBD2质粒联合乙肝疫苗免疫小鼠抗体水平明显升高,CD4+T细胞百分率比其他免疫组都高,脾淋巴细胞体外增殖实验明显。与其他各免疫组相比,pEGF-C1空质粒联合乙肝疫苗免疫组抗体水平和淋巴细胞体外增殖情况及CD4+T细胞百分率都较低。结论:人β-防御素-2对乙肝疫苗在小鼠中的免疫功能有一定增强作用。     

前列腺特异性膜抗原在前列腺癌中的表达及临床意义

目的 研究前列腺特异性膜抗原(PSMA)在前列腺癌中的表达及其与Gleason分级之间的关系,同时探讨其在前列腺癌诊断中的价值.方法 采用免疫组化EnVision法检测PSMA在前列腺癌、前列腺上皮内瘤变(PIN)和良性前列腺增生症(BPH)中的表达.结果 PSMA在BPH、PIN和前列腺癌中均表达.在BPH中,PSMA阳性表达部位在前列腺腔缘或顶端/胞质表达,而在PIN中表达模式为胞质伴胞膜阳性,前列腺癌为顶端/胞质、胞质伴胞膜阳性或胞质表达阳性.PSMA在分化差前列腺癌中多为胞质表达,而在分化好的癌中为顶端/胞质和胞质伴胞膜表达.PSMA表达强度在PIN和前列腺癌中明显高于BPH(P＜0.05),同时PSMA染色强度与Gleason评分呈正相关(P＜0.05).结论 PSMA与Gleason分级密切相关,PSMA表达模式和染色强度的改变对PIN和前列腺癌诊断具有参考价值.     

人β防御素4基因原核表达载体的构建及其表达

人β防御素4（Humanpdefensin4，HBB4）是一种具有广谱抗微生物活性的抗菌肽。在人体先天免疫尤其上皮及黏膜防御中起重要作用。本研究用重叠延伸PCR扩增合成HBD4cDNA全长，并克隆人pMD18-T载体，用PCR法扩增HBIM成熟肽mamreHBD4，mHB4）编码序列并克隆入表达载体pGEX-4T-2中，在异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（isopropy-β-D-thiogalactoside，IPTG）诱导下，表达HBD4与谷胱甘肽S转移酶（glutathione S-transferase，GST）的融合多肽。用酶切鉴定、核酸测序、十二烷基磺酸钠一聚丙烯酰胺凝胶电泳等进行鉴定。结果表明：我们成功合成了HBD4全长编码基因，构建了克隆载体pMD18-T／HBIN和原核表达载体pGEX-4T-2／mHBD4，并在大肠杆菌中成功表达融合蛋白GST—HBD4。     

人β-防御素的研究进展

β-防御素是一类富含精氨酸,而且具有特殊结构的小分子阳离子多肽,是过去几十年里寻找新型抗生素的重要发现之一.对人类基因组序列的分析表明,人染色编码体的基因含有多达一百多种的β-防御素,它们是连接固有免疫和适应性免疫的重要因子.β-防御素不但对多种细菌、真菌、病毒等具有直接的杀伤作用,而且还与肿瘤发生、组织修复以及生殖成熟等生理过程密切相关.     

小鼠β-防御素2与甲型流感病毒HA1融合基因真核载体的构建与表达

目的：构建小鼠β-防御素2（mBD2）与甲型流感病毒A／PR／8／34（H1N1）血凝素（HA1）基因融合表达的真核载体，并检测其在HEK293细胞中的表达。方法：用PCR技术分别从质粒pcDNA3．1（＋）／mBD2和peDNA3．1（＋）／HA1中扩增mBD2与HA1基因片段，再用重叠延伸PCR法（overlap-PCR）将HA1与mBD2通过一段多肽接头Gly4Ser融合为mBD2-HA1。将mBD2-HA1融合基因插入真核表达载体pcDNA3．1（＋），经酶切、PCR和测序鉴定正确后，用脂质体转入HEK293细胞，通过免疫荧光检测其瞬时表达。结果：融合基因mBD2-HA1的真核表达载体pcDNA3．1（＋）／mBD2-HA1构建成功，并在HEK293细胞中成功表达融和蛋白。结论：融合基因mBD2-HA1真核表达载体的成功构建，为研究防御素在流感病毒核酸疫苗中的佐剂作用奠定了基础。     

乳杆菌细胞壁成分激活人阴道上皮细胞β-防御素-2表达机制研究

目的 探讨乳杆菌细胞肇成分(Lactobacillus cell wall extract,LCWE)对人阴道上皮细胞β-防御素-2的诱导作用及细胞内信号转导机制.方法 采用实时定量PCR和Western blot方法检测LCWE处理对人阴道上皮细胞(WZV-1)β-防御素-2表达的影响;Western blot方法检测LCWE处理后WZV-1细胞内NF-κB和p38MAPK信号通路活化情况;实时定量PCR和Western blot方法检测NF-κB抑制剂和p38MAPK抑制剂预处理WZV-1细胞对LCWE诱导β-防御素-2表达的影响.结果 LCWE可诱导WZV-1细胞β-防御素-2表达且存在着明显的时间效应和剂量依赖关系,50μg/mlLCWE处理细胞8 h对β-防御素-2的上调幅度最大,刺激0.5 h后可引起细胞内p38MAPK蛋白的磷酸化显著增加,1 h达到顶峰;刺激0.5 h后可引起细胞核内NF-κB含量显著增加(P<0.05),2 h达到顶峰.NF-κB抑制剂PDTC、p38MAPK抑制剂SB20380预处理WZV-1细胞,可明显抑制LCWE诱导WZV-1细胞β-防御素-2的表达.结论 LCWE具有激活NF-κB和p38MAPK信号通路诱导阴道-上皮细胞β-防御素-2的作用.

Abstract：

Objective To investigate the molecular and cell signal transduction mechanisms by Lactobacillus cell wall extract(LCWE)inducing human-β-defensin-2(hBD-2)expression in human vaginal epithelial cells.Methods The induction of hBD-2 in human vaginal epithelial cells(WZV-1)by LCWE was observed using real-time PCR and Western blot.After stimulating WZV-1.the activation of NF-κB and p38MAPK signaling pathways were determined by Western blot.The induction of hBD-2 in WZV-1 cells by LCWE was observed with signaling pathways inhibitors of NF-κB and p38MAPK using real-time PCR and Western blot.Results The results showed that LCWE significantly upregulated hBD-2 expression in the time and dose-dependent manner.The maximal stimulatory effect of LCWE on the expression of hBD-2mRNA in WZV-1 cells were observed at the concentration of 50μg/ml after treatment for 8 h.After stimulation by 50μg/ml LCWE,Western blot analysis demonstrated that the phosphorylation of p38MAPK increased at 0.5 h significantly,peaked at 1 h,moreover the concentration of NF-κB in nucleus increased at 0.5 h significantly(P<0.05),peaked at 2 h.Blocking with inhibitor of NF-κB and(or)p38MAPK pathways results in decreased levels of HBD-2 expression.Conclusion These findings suggest that p38MAPK and NF-κB pathways play the important roles in induction of hBD-2 expression by LCWE in human vagihal epithelial cells.     

前列腺特异性膜抗原蛋白在正常和肿瘤组织中的表达及其在前列腺癌诊断中的敏感性和特异性

前列腺癌主要是通过淋巴道和血道向远处器官转移，人体几乎任何一个器官均可发生前列腺癌转移，其中骨、肝脏和肺是最常转移的器官。另外，前列腺癌也能够直接侵犯邻近器官如膀胱。当怀疑有前列腺癌转移时，免疫组化被常规用于识别肿瘤来源。前列腺特异性抗原（PSA）和前列腺特异性酸性磷酸酶（PAP）是2种最常使用的免疫标记物，     

双歧杆菌胞壁蛋白诱导人肠腺上皮细胞β-防御素2(hBD-2)mRNA的表达

目的 :检测双歧杆菌对人肠腺上皮细胞 β 防御素 2基因的激活作用及其活性组分。方法 :应用逆转录聚合酶链反应 (RT PCR)法和Northern杂交检测HT 2 9细胞hBD 2mRNA的表达 ;采用超声破碎细胞、超速离心、蛋白萃取等方法分离双歧杆菌胞壁蛋白质成份。结果 :RT PCR和Northern杂交分析显示 ,在正常培养条件下HT 2 9细胞无可见的hBD 2mRNA表达信号 ,但在双歧杆菌菌体、细胞壁和胞壁蛋白刺激下均检测出显著的hBD 2mRNA表达。结论双歧杆菌能诱导人肠腺上皮细胞hBD 2基因的表达 ,双歧杆菌胞壁蛋白可能是其诱导作用的活性组分。双…     

小鼠β防御素2与柯萨奇病毒B3 VP1融合基因疫苗的构建和免疫效果研究

目的:构建小鼠β-防御素2(Mouse beta-defensin-2,mBD2)与柯萨奇病毒B组3型(Coxsackievirus B3,CVB3)VP1融合基因疫苗,并观察其对小鼠的免疫效果.方法:克隆mBD2基因,构建重组质粒pcDNA3/mBD2和pcDNA3/mBD2-L-VP1.将4～6周龄BALB/c雄性小鼠随机分为5组,分别于股四头肌注射PBS(A组)、pcDNA3(B组)、pcDNA3/mBD2(C组)、pcDNA3/VP1(D组)、pcDNA3/mBD2-L-VP1(E组),每次接种剂量100 μg/只,3周免疫1次,共3次.每次免疫后第14天眼眶静脉取血,用微量中和试验滴定血清中和抗体效价.第三次免疫后第21天,每组随机取3只小鼠,制备脾淋巴细胞悬液,用CCK-8细胞计数法检测特异性CTL的杀伤活性;每组取3只小鼠以3LD50 CVB3病毒攻击,第7天取血处死,检测血清病毒滴度.结果:成功克隆了mBD2基因,构建了pcDNA3/mBD2和pcDNA3/mBD2-L-VP1两种重组质粒;D组和E组血清中和抗体滴度随免疫次数增加而提高(P＜0.01);E组血清中和抗体滴度和脾细胞特异性CTL杀伤活性显著高于其他组(P＜0.01),血中CVB3病毒滴度显著低于其他组(P＜0.01).结论:pcDNA3/mBD2-L-VP1能诱导小鼠对CVB3产生较强的体液免疫和细胞免疫,能有效抑制病毒在体内增殖.     

PSMA基因疫苗抑瘤效应及免疫机制的实验研究

目的： 观察表达前列腺特异性膜抗原(PSMA)基因疫苗在荷瘤小鼠模型中抑瘤效应并探讨其免疫机制,为前列腺癌的预防和免疫治疗提供实验基础。方法: 将PSMA基因疫苗肌注入BALB/c小鼠体内,检测其血清中PSMA抗体水平并观察脾T细胞的增殖效应和杀细胞毒效应,以sp2/0-PSMA细胞攻击免疫后小鼠,观察小鼠的成瘤率、肿瘤大小、平均瘤重及生存率,评价PSMA基因疫苗的抑瘤效应。结果: PSMA基因疫苗可诱导实验组小鼠产生PSMA抗体,脾T细胞的增殖效应和杀细胞毒效应,在一定时间内随着免疫次数的增加和时间的延长,抗体水平、脾细胞的增殖和杀细胞毒效应均呈上升趋势。与对照组相比较,实验组小鼠成瘤率低,无瘤生存期延长,肿瘤生长缓慢。结论: PSMA基因疫苗能诱导实验组小鼠产生特异性体液及细胞免疫应答,且有明显的抑瘤效应。     

PSMA对JNK/SAPK通路的激活及对前列腺癌细胞凋亡的调控*

 目的：探讨前列腺特异性膜抗原(PSMA)是否通过c-Jun氨基末端激酶/应激激活的蛋白激酶(JNK/SAPK)通路对前列腺癌细胞凋亡进行调控。方法：利用前期研究中建立的高效阻断PSMA表达的shRNA慢病毒载体,阻断前列腺癌细胞中PSMA的表达作为实验的干扰组;同时利用构建的PSMA载体转染前列腺癌细胞,促进前列腺癌细胞中PSMA的表达作为阳性实验组;不做任何处理的细胞株作为空白组;加入JNK/SAPK抑制剂SP600125作为阴性对照。Western blotting及免疫细胞化学方法观察各组细胞p-JNK/SAPK的表达量,CCK-8法检测细胞生长情况、流式细胞术检测细胞周期及凋亡。结果：Western blotting及细胞免疫化学提示抑制PSMA表达后,p-JNK/SAPK表达水平下降;增强PSMA表达后p-JNK/SAPK表达水平上升;在SP600125作用下,3组细胞p-JNK/SAPK均处于较低水平,且彼此无明显差异。CCK-8法和流式细胞术检测细胞周期提示PSMA表达受抑制后细胞增殖能力下降,细胞S期百分比减少;增加PSMA表达,细胞增殖能力增强,S期百分比增加;在SP600125作用下,3组细胞增殖和S期百分比均处于低水平,无明显差异。在抑制PSMA表达组中,前列腺癌细胞的凋亡率明显升高;而在增强PSMA表达组,细胞凋亡率明显降低;加入SP600125后,细胞凋亡率均低于常规培养组。结论：PSMA通过上调JNK/SAPK信号通路对前列腺癌细胞的增殖、细胞周期及凋亡产生影响,但JNK/SAPK并不是唯一通路。     

TAT-凋亡素基因重组质粒的构建、蛋白的表达纯化及体内活性实验

目的 克隆构建TAT-凋亡素质粒并提取融合蛋白，为进一步研究该蛋白功能奠定基础。方法 PCR合成TAT-凋亡素基因，与pTYB2质粒连接后转入Rosetta菌，经IPTG诱导表达，几丁质亲和层析一步纯化目的蛋白，用昆明小鼠H22动物模型检测活性。结果 克隆载体经过PCR筛选、测序鉴定，其大小和核苷酸序列正确，诱导后融合蛋白出现在上清，纯化出的TAT-凋亡素蛋白具有明显的抗肿瘤活性。结论 本实验所构建的重组质粒pTYB2/TAT-apoptin经诱导表达出了可溶性目的蛋白TAT-凋亡素，纯化后具有明显的生物活性，为研究TAT-凋亡素蛋白的进一步研究奠定了基础。     

重组病毒rAAV2-IRES-EGFP/MnSOD的构建及其表达

目的构建含有大鼠源性锰超氧化物歧化酶(MnSOD)基因的重组病毒rAAV2-IRES-EGFP/Mn-SOD,检测其在大鼠耳血管纹边缘细胞和耳蜗组织内的表达。方法将大鼠心肌组织来源的SOD基因克隆入融合表达载体pEGFP-N1中,再以限制性酶切方法克隆入真核表达载体pSNAV2.0-IRES-EGFP中,最后将其包装为rAAV2-IRES-EGFP/MnSOD病毒颗粒,用激光共聚焦显微镜、流式细胞仪、RT-PCR及Western印迹检测MnSOD基因的表达。结果真核表达载体pEGFP-N1/MnSOD和pSNAV2.0-IRES-EGFP/MnSOD经酶切、PCR和测序鉴定均检测到MnSOD基因的完整序列,被rAAV2-EGFP/MnSOD感染的耳边缘细胞和内耳组织中MnSOD蛋白的表达均高于空白对照耳。结论成功构建了大鼠源性MnSOD基因的重组病毒rAAV2-IRES-EGFP/MnSOD,并使其在大鼠耳边缘细胞和大鼠耳蜗组织中成功表达,为抗氧化基因治疗内耳疾病的研究奠定了基础。     

人骨形成蛋白2基因克隆及真核表达载体的构建

在大肠杆菌中克隆人骨形成蛋白2基因并获得真核表达载体。由人成骨瘤细胞中提取总RNA，利用逆转录PCR方法扩增获得人骨形成蛋白2基因cDNA；将此基因片段重组到pGEM-T克隆载体中，转化到大肠杆菌DH5α后，蓝白斑筛选阳性克隆，利用限制性酶切、PCR扩增和核苷酸序列分析鉴定重组质粒；将pGEM-T克隆载体中人骨形成蛋白2基因重组到pcDNA3．1真核表达载体中，用限制性酶切和PCR扩增鉴定重组质粒。结果表明：重组在两种质粒中的基因片段为人骨形成蛋白2基因全编码序列。克隆获得人骨形成蛋白2基因．并得到此基因的真核表达载体，为人骨形成蛋白2的表达打下了基础。     

CVB3VP1/pcDNA3真核表达质粒的构建及免疫效果观察

用ＲＴ ＰＣＲ从ＣＶＢ３ 感染细胞中扩增出ＶＰ１ 片段,重组入真核表达质粒ｐｃＤＮＡ３ 中,转化大肠杆菌Ｃ６００,扩增后的质粒经ＣｓＣｌ 密度梯度离心纯化,体外转染ＣＯＳ ７ 细胞,用ＳＤＳ ＰＡＧＥ和Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔｔｉｎｇ 检测表达产物;并经胫骨前肌注射小鼠,每鼠１００μｇ／ 次,隔４ 周加强一次,共３ 次。免疫后不同时间检测抗体、淋巴细胞增殖反应等免疫指标。结果显示重组质粒体外转染真核细胞表达ＶＰ１ 蛋白,免疫小鼠后产生了特异性抗体和淋巴细胞增殖反应。表明ＣＶＢ３ ＶＰ１ ＤＮＡ疫苗获得初步有效结果。     

抗GD2单链抗体-IL-2融合蛋白基因的构建及表达

将已经突变了稀有密码子的人IL-2（Ala125）基因，与GD2单链抗体基因通过over-lap-PCR法，构建成ScFv-IL-2融合基因，并在基因的C端引入his tag序列。ScFv-IL-2基因经测序正确后连接到表达载体pSE380上，然后导入大肠杆菌BL21中表达。表达蛋白为包涵体，表达量占总蛋白的30％以上，经SDS-PAGE及Western blot鉴定表达蛋白的分子量为43kD，与预期的相符。包涵体粗提后，经Ni^2＋亲和层析柱及Sephacryl S-200HR柱分离复性，纯度可达90％以上。ELISA试验结果证明该融合蛋白保存了与相应抗原的结合活性和IL-2的生物活性。     

人HER2胞外区基因重组及重组蛋白的纯化

为在体外纯化可溶性HER2胞外区蛋白并提高其原核表达产量，将多聚酶链式反应（PCR）方法获得的HER2基因胞外段编码区重组至pGEX-6P-1质粒，转化大肠杆菌BL21，采用不同的诱导条件分析融合蛋白的表达及其溶解性，不溶的包涵体经变性复性，与裂解液上清分别经Olutathione Sepharose4B亲合纯化融合蛋白。结果发现，重组蛋白在原核细胞中以可溶和不可溶两种表达形式存在，但以不溶的包涵体形式为主。低温（30℃）、较高的细菌密度（A600—1．8）和适当的培养基添加剂能有利于可溶性融合蛋白的表达。Olutathione Sepharose4B亲合纯化细菌裂解液上清和复性后的融合蛋白，其产量为1．23mg／L菌液，最大限度地获得了可溶性的HER2蛋白胞外段，为HER2特异性抗体的制备及其功能研究打下了良好的基础。     

人β2GP1全长cDNA的分子克隆及重组质粒构建

采用逆转录ＰＣＲ技术自人胎肝细胞中克隆出人全长１０５９ｂｐ的β２ＧＰ１ｃＤＮＡ，经限制性内切酶图谱分析初步证实后，定向插入表达性载体ｐＧＥＸ－２Ｔ，并筛选出带有插入片段的阳性克隆，为研究抗磷脂抗体所针对的抗原及表位奠定了基础。     

HCV核心-包膜E2抗原融合基因DNA疫苗的构建及对小鼠的免疫应答试验

目的：观察一种结构新颖的HCV融合抗原DNA疫苗在BALB/c小鼠的免疫效果，探讨其用于防治丙型肝炎的可行性。方法：用重叠延伸PCR拼接编码小鼠IgG kappa链信号肽和通用型辅助性T细胞表位PADRE的DNA片段，PCR分别扩增HCV核心抗原基因和包膜E2抗原基因，将3段基因插入真核表达载体pcDNA3.1，构成重组表达质粒pST-CE2t，转染COS7细胞，免疫组化检测HCV抗原的表达。将pST-CE2t和HCV核心抗DNA疫苗pcDNA3.1core分别肌肉注射接种BALB/c小鼠，检测小鼠的血清抗体、T细胞增殖和CTL反应。结果：pST-CE2t可在COS7细胞内表达HCV核心抗原和E2抗原，接种于BALB/c小鼠能有效诱导体液和细胞免疫应答，其中抗HCV核心抗原免疫应答的强度明显超过pcDNA3.1core，且更趋向于TH1型免疫应答。结论：pST-CE2t对于丙型肝炎的防治有潜在的应用价值。