人羊水来源间充质干细胞冻存后生物学特征研究

目的体外分离培养人羊水间充质干细胞(human amniotic fluid-derived mesenchymal stem cells,HAFMSCs),观察低温冻存复苏后HAFMSCs生物学特征,为进一步研究奠定理论基础。方法取12份自愿捐赠的孕16～20周羊水标本,采用改良两步法分离培养HAFMSCs,用含量不同的FBS、DMSO冻存液冻存细胞,液氮冻存12周后42℃水浴复苏,锥虫蓝染色检测细胞存活率,MTT法检测细胞增殖速度并绘制生长曲线,流式细胞仪检测冻存复苏后HAFMSCs表型。对冻存复苏后的HAFMSCs进行成脂、成骨诱导分化培养,并分别采用油红O、von Kossa染色进行鉴定;实时荧光定量PCR分析细胞冻存前后Oct-4、Nanog mRNA表达差异。结果细胞冻存12周后,不同的冻存方案对细胞存活率影响有差异,优化的冻存方案为DMEM/FBS/DMSO=50%/40%/10%。冻存复苏后的HAFMSCs呈漩涡状排列,生长曲线呈S形,与冻存前细胞生长曲线相似。流式细胞仪检测示冻存复苏后细胞的MSCs表型CD29、CD44、CD73、CD90为阳性,造血干细胞表型CD34、CD45为阴性。成脂、成骨诱导21 d,油红O、von Kossa染色均呈阳性。实时荧光定量PCR检测示冻存前后Oct-4、Nanog mRNA表达水平差异无统计学意义(P>0.05)。结论 HAFMSCs具有体外增殖快、分化能力强的优势;并可耐受短期冻存,复苏后细胞存活率高,生物学特征及分化潜能未发生明显变化,冻存液DMEM/FBS/DMSO=50%/40%/10%是较好冻存方案。     

不同冻存液对人脐带间充质干细胞生物学特性的影响

观察不同冻存液对人脐带间充质干细胞(human umbilical cord mesenchymal stem cell,hUC-MSC)冻存复苏后生物学特性的影响,优化冻存方法.方法 脐带取自2011年1月至2011年12月在中山大学附属第三医院产科剖宫产的足月健康产妇.从脐带分离得到的hUC-MSC培养传代,取第3代细胞.根据冻存液不同分为3组,A组冻存液为二甲基亚砜(dimethyl sulfoxide,DMSO):胎牛血清(fetal bovine serum,FBS):低糖杜氏培养基(low glucose Dulbecco's modified Eagle's medium,LG-DMEM)为1∶2∶7,B组为DMSO:FBS:LG-DMEM为1∶5∶4,C组为DMSO∶ FBS为1∶9,不含LG-DMEM.经冻存12个月,复苏细胞,以第3代未冻存细胞悬液作为对照组,采用台盼蓝染色法比较hUC-MSC的细胞存活率,采用噻唑蓝(methyl thiazolyl tetrazolium,MTT)法比较细胞的生长情况绘制生长曲线,倒置显微镜下观察细胞的生长状况,采用流式细胞仪检测各组细胞的表面标记.结果 A、B、C三组的细胞存活率分别为(20±4)%、(71±8)%和(85±7)%.与C组比较,A组和B组的细胞存活率降低,差异有统计学意义(均为P <0.05).细胞生长曲线显示,与对照组相比,C组hUC-MSC在各时间点细胞生长迅速,但差异无统计学意义(P>0.05);B组hUC-MSC在24 h、48 h、72 h细胞生长差异无统计学意义(P>0.05),在96 h时间点生长速率低于对照组,差异有统计学意义(P<0.05);而A组hUC-MSC在各个时间点细胞生长减慢,差异有统计学意义(均为P<0.05).形态学观察显示,A组细胞胞体宽大多角,并且较多分支,B组和C组细胞饱满,折光性好,呈长梭形、纺锤形或多角形.A组细胞复苏后细胞数目过少无法进行表面标记,B组和C组hUC-MSC表面标记物CD31、CD34、CD45、人类白细胞抗原(HLA)-DR表达阴性,CD105、CD90、CD44表达阳性.结论 含高浓度血清的冻存液适合hUC-MSC的长期保存,含90% FBS的冻存液为hUC-MSC的最佳冻存保护液.     

冻存复苏人脐带间充质干细胞体外扩增和向脂肪细胞分化的研究

目的：分离培养人脐带间充质干细胞（human Umbilical Cord Mesenchymal Stem Cells hUCMSCs）,观察其冻存复苏后向脂肪细胞定向分化的能力。方法：将剔除动静脉的新鲜人脐带组织切成小块培养,得到贴壁细胞,观察细胞生长及检测其表面抗原。将第1代的hUCMSCs采用梯度冷冻技术冻存5个月,复苏后培养至第12代时,加入成脂诱导剂培养。当诱导至21天时行油红O染色,7天及14天时用RT—PCR技术分别检测成脂转化基因过氧化物酶增殖剂受体（PPAR γ-2）和脂蛋白酯酶（LPL）。结果：组织块培养法收获的单个核细胞培养传代后,能获得均一贴壁的间充质干细胞,hUCMSCs冻存复苏后,活细胞约为86％,流式细胞仪分析这些细胞表达CDI3、CD44和CD71等MSCs标志物,不表达CD14、CD34和HLA—DR表面抗原。复苏细胞在成脂诱导剂的作用下,细胞中有脂滴产生,通过油红0染色显示细胞核周围有脂滴聚集,通过RT—PCR检测有LPL及PPARγ2 mRNA的表达。结论：采用组织块贴壁培养法分离获得的人脐带间充质干细胞可冷冻保存。复苏后培养至第12代仍具有向脂肪细胞分化的潜能,可作为脂肪组织工程种子细胞来源。     

蜕皮甾酮对人脐带间充质干细胞冻存复苏后生物学活性的影响

目的：研究体外条件下蜕皮甾酮（EDS）对冻存复苏后人脐带间充质干细胞（hUCMSCs）生物学活性的影响。方法：hUCMSCs采用梯度冷冻技术冻存,6个月后复苏,扩增、传代,分3组培养：空白对照组用普通培养基培养;低剂量EDS组在普通培养基中加入100μg／mlEDS;高剂量EDS组在普通培养基中加入200μg／mlEDS。显微镜下观察细胞形态,10d时计算克隆形成能力,绘制细胞生长0～7d的细胞生长曲线,流式细胞仪鉴定hucMscs的细胞表面特异标记（CD34、CD45、CD29、CD105）,油红0染色及茜素红染色观察huCMSCs向脂肪细胞、成骨细胞分化的能力。结果：两EDS组克隆形成率约为75％,空白对照组约为40％。生长曲线显示两EDS组增殖速度较空白对照组快,但两EDS组增殖速度相近。流式检测结果显示两EDS组的CD29、CD105阳性率明显高于空白对照组,CD34、CD45里阴性表达,其表达明显低于空白对照组（P〈0．05）,两EDS组之间差异无统计学意义;成骨、成脂分化能力检测发现,各组细胞均能够向脂肪细胞、成骨细胞分化,而高剂量EDS组细胞在未加诱导培养基的情况下仍出现向成骨细胞分化的趋势。结论：在一定浓度范围内,EDS对细胞复苏后恢复细胞活性以及提高存活率方面具有积极作用,但是较高浓度的EDS有诱导细胞向成骨细胞方向分化的趋势。     

人脂肪间充质干细胞冻存方法的改进

目的：探索理想的冷冻人脂肪间充质干细胞的方法。方法：采用常规方法体外培养并扩增人脂肪间充质干细胞,消化细胞并洗涤离心加入10%二甲基亚砜、30%胎牛血清、60%MEM的细胞冻存体系,直接置-70℃冰箱贮存。冻存4、8和12周后,37℃水浴复温,通过检测细胞周期﹑细胞表型和成脂的多向分化潜能,以鉴定该方法的可行性。结果：消化后不经过传统的程序性降温冻存技术,直接在-70℃冰箱贮存,其细胞生物学特性无明显改变,细胞仍存在成脂的多向分化潜能。结论：人脂肪间充质干细胞悬液直接-70℃冰箱贮存不影响其生物学特性,是冷冻保存的一种可行方法。     

低温冻存对胚胎大鼠神经干细胞生物学特性的影响

目的 研究不同冻存液对胚胎大鼠神经干细胞的保护作用及低温冻存对神经干细胞增殖及分化潜能的影响。方法 分别应用冻存液Ⅰ和冻存液Ⅱ对源于胚胎大鼠的神经干细胞球进行冷冻,于复苏后进行传代培养,并鉴定其增殖和分化能力。结果 复苏后的神经干细胞可以多次传代,冻存神经干细胞的克隆增殖率为(36.80±3.81)％,未冻存者为(38.15±4.80)％,两者相比差异无显著性(P>0.05)。冻存液Ⅰ和冻存液Ⅱ保存的神经干细胞分化为神经元的比例分别为(7.61±0.74)％和(12.76±2.53)％(P>0.05);分化为少突胶质细胞的比例分别为(0.90±0.50)％和(2.18±0.33)％(P>0.05);分化为星形细胞的比例为(47.67±2.10)％和(35.38±3.14)％(P<0.05)。结论 冻存的胚胎大鼠神经干细胞复苏后仍具有活跃的增殖和分化潜能,含10％血清的冻存液可以促使神经干细胞向星形细胞方向转化。     

脐血间充质干细胞的生物学特性及其成骨细胞定向诱导

目的:研究人间充质干细胞(Mesenchymal Stem Cells,MSCs)的定向分化为成骨细胞的条件及其成骨活性.方法:采用标准Ficoll-Hypaque技术分离脐血和成人骨髓MSCs,以地塞米松、β-磷酸甘油和维生素C为辅剂定向诱导成骨细胞,碱性磷酸酶、骨矿化结节和Ⅰ型胶原作为成骨细胞鉴定与活性评价的指标.结果:两种MSCs的细胞形态和生物学特性无明显差异.定向成骨细胞诱导后,成骨细胞标志性产物碱性磷酸酶、骨矿化结节和Ⅰ型胶原均得到了稳定的表达,并显著高于未诱导MSCs.结论:脐血和成人骨髓MSCs在适当的条件下均可向成骨细胞定向转化.     

WNT2B对人骨髓间充质干细胞成脂肪细胞分化的影响

目的观察WNT2B对人骨髓间充质干细胞(hMSCs)向脂肪细胞分化的影响。方法采用慢病毒载体在hMSCs中过表达WNT2B基因(实验组),以空慢病毒载体作为对照(对照组),并将hMSCs进行脂肪细胞诱导分化7 d,以实时定量聚合酶链反应(qPCR)检测脂肪细胞标志基因过氧化物酶增殖物激活受体γ2(PPARγ2)、脂蛋白脂酶(LPL)和降脂素(Adipsin)的表达,在光镜下计数油红O染色阳性细胞的数目,并对油红O染色强度进行定量检测。计量数据组间比较采用t检验或者Mann-Whitney检验。结果在hMSCs成脂肪细胞诱导分化过程中,WNT2B的蛋白表达水平在分化早期即发生改变,实验组hMSCs的PPARγ2(3.85±0.01比0.70±0.10,t=54.289,P<0.01)、LPL(17.78±1.78比1.29±1.30,t=12.958,P<0.01)、Adipsin基因表达强度(0.88±0.11比0.38±0.05,t=7.167,P<0.01)显著低于对照组,实验组hMSCs单位面积形成脂肪细胞的数量显著低于对照组[(30.50±2.07)个比(10.33±1.63)个,t=50.230,P<0.01],油红染色定量分析显示实验组吸光度值显著低于对照组(0.77±0.02比0.49±0.02,t=10.397,P<0.01),差异均有统计学意义。结论过表达WNT2B可以抑制体外hMSCs向脂肪细胞的分化。     

人脐带间充质干细胞的生物学特性及应用前景

问充质干细胞（mesenchymal stem ceHs,Mscs）是来源于发育早期中胚层的具有高度自我更新能力和多向分化潜能的多能干细胞,可在体外培养扩增,并能在特定条件下分化为神经细胞、成骨细胞、软骨细胞、肌肉细胞、脂肪细胞等,在细胞替代治疗及组织工程等方面具有极大的应用价值。骨髓、胎儿、外周血及脐带血来源的MSCs都有其自身的劣势,而人脐带来源的MSCs有着无法比拟的优势：来源广泛、采集方便、无伦理法律限制、扩增迅速、免疫原性低、支持造血、多向分化等,在细胞治疗、基因治疗、组织工程等方面有着广阔的应用前景。     

长期体外培养对人脐血间充质干细胞成骨分化潜能的影响

目的观察体外长期培养对人脐血间充质干细胞（Human umbilical cord blood derived mesenchymal stem cells,UCB-MSCs）成骨分化潜能的影响,探讨其作为组织工程骨种子细胞的可行性。方法流式细胞技术观察长期体外培养的UCB-MSCs细胞表面抗原表达的变化规律,并通过Alizarin Red染色及碱性磷酸酶活性、骨钙蛋白含量和钙离子含量的检测观察长期体外培养对UCB-MSCs成骨特性的影响。结果第10代之前的UCB-MSCs能够高表达间充质干细胞表面标志物,7代之前的细胞体外增殖能力不随传代次数而发生明显变化。Alizarin Red染色及碱性磷酸酶活性、骨钙蛋白含量和钙离子含量的检测显示8代之前的UCB-MSCs仍能保持较强的成骨分化能力。结论7代之前的UCB-MSCs能保持稳定的体外成骨分化特性,有望成为较理想的组织工程骨种子细胞。     

脐血间质干细胞经肌源性诱导后细胞内游离钙的变化

目的研究3种不同的肌源性诱导方法对脐血间质干细胞（mesenchymal stem cells,MSCs）进行诱导后细胞内Ca2＋调控系统分化的影响。方法 2007年1月至2010年4月上海交通大学医学院附属新华医院采用5-氮杂胞嘧啶核苷（5-azacytidine,5-aza）、心肌裂解液和心肌诱导液分别诱导犬脐血MSCs。采用激光共聚焦显微镜检测5-aza、心肌裂解液和心肌诱导液诱导的细胞、心肌细胞和MSCs内Ca2＋荧光探针Fluo-3/AM结合的Ca2＋,每份细胞选取2~5个视野,每一种细胞观察记录30个视野,取每1 min摄得的10张图象的平均荧光强度值,以光密度值（OD）反映细胞内游离Ca2＋浓度;并连续监测细胞内游离Ca2＋浓度的变化。结果经3种方法诱导后细胞内游离Ca2＋浓度均高于心肌细胞内游离Ca2＋浓度（F=59.400,P=0.000）。5-aza、心肌裂解液和心肌诱导液诱导的细胞内游离Ca2＋浓度差异有统计学意义（F=18.988,P=0.000）。5-aza诱导的细胞内游离Ca2＋浓度与心肌裂解液诱导的细胞比较差异无统计学意义（OD 1 076.88±44.65 vs.1 040.90±37.48,P=0.186）,但其浓度高于心肌诱导液诱导的细胞（OD 1 076.88±44.65 vs.973.91±46.49,P=0.001）,心肌裂解液诱导的细胞内游离Ca2＋浓度高于心肌诱导液诱导的细胞（OD 1 040.90±37.48 vs.973.91±46.49,P=0.001）。3种诱导方法诱导后的细胞内游离Ca2＋呈自发性波动,与心肌细胞相似,但其频率和幅度有明显差异。5-aza、心肌裂解液诱导后的MSCs在KCl刺激下能使细胞内Ca2＋瞬时释放,心肌诱导液诱导后的MSCs对KCl也有反应,但不能诱发Ca2＋释放,而是使Ca2＋释放时间延长。结论 5-aza诱导、心肌裂解液和心肌诱导液诱导对MSCs的Ca2＋调控系统有分化作用,3种方法的效果不同,其产生差异的原因和效果的优劣需进一步实验阐明。     

人脐血间充质干细胞的分离培养及其多向分化潜能的实验研究

目的 研究人脐血间充质干细胞(MSCs)分离培养的生物学特性及其向成骨、成脂诱导分化的能力.方法 从人脐血中分离扩增MSCs,显微镜下观察其形态及生长情况,绘制生长曲线,电镜下观察超微结构,流式细胞仪检测细胞表面标志物;成骨、成脂诱导后以碱性磷酸酶(ALP)染色、茜素红染色鉴定MSCs成骨分化潜能,油红O染色鉴定成脂分化潜能.结果 人脐血MSCs为成纤维细胞样,漩涡状贴壁生长排列,传至第110代细胞形态无明显变化;电镜下显示为低分化细胞;细胞表面不表达CD34和CD45,强表达CD29、CD44和CD90;成骨诱导后可检测到ALP表达及钙化结节形成;成脂诱导后可检测到脂滴形成.结论 人脐血中可分离出MSCs,与其他来源的MSCs具有类似的生物学特性及多向分化潜能,脐血有可能成为骨组织工程种子细胞的来源.     

人腹膜中间充质干细胞生物学特性的初步研究

目的探讨人腹膜中是否含有间充质干细胞(Mesenchymal stem cells,MSC),并研究其生物学特性。方法腹膜取自接受胃大部切除及腹腔淋巴结清扫术的胃癌患者。将腹膜剪碎,Ⅰ型胶原酶消化后以低密度接种,2周后计算细胞群中成纤维细胞集落形成单位(Colony-forming unit-fibroblast,CUF-F)数量;流式细胞分析贴壁细胞表型;定向诱导2周后,碱性磷酸酶和油红O染色,观察细胞体外成骨和成脂肪能力。结果贴壁的细胞呈成纤维细胞样,消化的腹膜细胞群中,CFU-F比例平均为0.574‰(0.26‰～0.84‰)。流式分析显示,细胞均一表达CD29、CD44和CD73,不表达CD31、CD34和CD45。成骨细胞定向诱导后,细胞呈现碱性磷酸酶活性;成脂诱导后细胞内出现脂肪滴,油红O染色阳性。结论人腹膜中富含MSC,可作为一个含有生物支架的干细胞来源。     

人脐带间充质干细胞的分离培养及其与胶原支架材料的相容性

目的探讨人脐带间充质干细胞(Mesenchymal stem cells,MSCs)体外分离、培养的方法,观察其与胶原蛋白支架的相容性,为进一步研究提供依据。方法利用组织体外培养法分离人脐带MSCs,流式细胞学分析细胞表型,组织化学观察细胞分化能力;将细胞接种于胶原蛋白支块架上,观察细胞在材料中的形态、粘附情况和增殖特点。结果直接贴壁法分离的细胞表型均一,体外具有成骨和成脂肪能力;细胞在支架上有较好的粘附铺展,培养2周后,MSCs占据支架总体积的80%,细胞分布较均匀。结论组织块培养法可获得高纯度的人脐带MSCs,细胞在体外与胶原蛋白支架有较好的组织相容性。     

人脐带间充质干细胞向血管内皮祖细胞诱导分化的实验研究

目的探讨人脐带间充质干细胞定向诱导分化为血管内皮祖细胞的可行性,为构建组织工程血管瓣膜内皮化提供新的细胞来源。方法无菌条件下取剖宫产新生儿脐带,复合胶原酶消化法获取脐带间充质干细胞进行培养,以流式细胞仪检测脐带间充质细胞的表面标志。取扩增3～6代的脐带间充质干细胞用VEGF和b-FGF诱导分化。用免疫荧光法鉴定内皮祖细胞的标志。结果脐带间充质干细胞可以诱导分化为血管内皮样细胞,表达CD34、CD133和vWF,且Dil-acLDL实验阳性。结论脐带间充质干细胞可以诱导分化为血管内皮祖细胞,可为构建组织工程血管瓣膜提供新的种子细胞来源。     

脐血间质干细胞移植于梗死心肌后对心肌基本结构的保护作用

目的 探讨经诱导分化为肌源性干细胞的脐血间质干细胞（mesenchymal stem cell，MSC）移植于梗死心肌后对梗死心肌组织结构改变的影响。方法 将36只成年杂种犬随机分为脐血MSC移植组（移植组）和对照组，每组各18只。移植组：用5一氮杂胞嘧啶核苷（5-azacytidine，5-aza）诱导分化后的脐血MSC，经结扎的犬冠状动脉左前降支远端灌注移植入梗死区；对照组：给予等量含0．02％的4，6-联脒-2-苯基吲哚（DAPI）的IMDM培养液注射。于移植2周、4周和8周时用Nagar—Olsen染色法观察心肌组织基本结构改变，用免疫细胞化学染色法观察残存心肌细胞结蛋白（desmin）分布变化。结果 Nagar—Olsen染色结果显示：移植组梗死心肌组织内弹力纤维、胶原纤维排列整齐、规律；对照组排列较紊乱、无规律，部分发生融合。移植组梗死区域心肌细胞结蛋白表达明显高于对照组（P〈0．01），而两组正常区域心肌细胞结蛋白表达差别无统计学意义（P〉0．05）。结论 脐血MSC在体外经5-aza诱导分化为肌源性干细胞并移植入梗死心肌后，对梗死心肌组织结构具有保护作用。     

人脐带间充质干细胞移植治疗晚期外伤性癫痫

目的探讨人脐带间充质干细胞移植治疗晚期外伤性癫痫的临床价值。方法对31例晚期外伤性癫痫患者进行人脐带间充质干细胞移植,观察临床效果。结果癫痫发作完全消失或仅有先兆者21例,极少发作(≤3次/年)者5例,发作明显改善(减少≥75%)者4例,无明显改善(减少<75%)者1例,满意率83.87%。结论人脐带间充质干细胞移植对治疗外伤性癫痫具有较好的效果。     

不同分离方法及培养条件对人脐带间充质干细胞生物活性的影响

目的:观察不同分离方法及培养条件对人脐带间充质干细胞(Human umbilical cord-mesenchymal stem cells,hUCMSCs)生物活性的影响。方法:分别用组织块贴壁法、酶消化法获取hUCMSCs,进行原代培养,记录各组首次传代时间,相差显微镜观察细胞的形态,流式细胞仪鉴定其CD29、CD44、HLA-ABC、CD34、CD45、HLA-DR抗原表达。分别用DMEM-LG、DMEM-HG和DMEM-F123种培养基培养第3代、第7代细胞,MTT法比较不同时间点3种培养基培养细胞的生长情况。结果:两种分离方法均能得到较均一的梭形或者多角形贴壁细胞,胞核大胞浆丰富,CD29、CD44、HLA-ABC抗原表达阳性,CD34、CD45、HLA-DR抗原表达阴性。用DMEM-F12培养的细胞活力更好,细胞生长更迅速。结论:两种分离方法均能得到hUCMSCs,DMEM-F12培养基更能够促进细胞的增殖,较适合于培养hUCMSCs。