弗氏志贺菌毒力大质粒导入大肠杆菌MG1655

目的:将弗氏2a志贺菌2457T的毒力大质粒pSF导入大肠杆菌MG1655。方法:通过诱动转移技术,将弗氏2a志贺菌2457T的毒力大质粒导入大肠杆菌MG1655。结果:构建了MG1655/pSF:pXL275-virG的毒力大质粒导入突变株,双向电泳初步比较分析表明在重组MG1655中有志贺菌毒力的表达。结论:成功地将弗氏2a志贺菌2457T毒力大质粒pSF导入了大肠杆菌MG1655。     

志贺菌毒力大质粒大片段敲除方法的建立

目的:构建志贺菌毒力大质粒大片段缺失突变体库。方法:首先利用λ-Red重组系统构建弗氏2a志贺菌301株毒力大质粒特定位点缺失株,再在距离此位点20 kb处缺失另一突变位点,最后根据重组酶识别远端FRT位点的特性,将两个远端FRT位点之间的DNA序列全部缺失。结果:敲除了毒力大质粒24 kb的DNA序列。结论:利用λ-Red重组系统及FLP-FRT位点特异性识别重组系统可以对志贺菌毒力大质粒逐步进行大片段的敲除,构建大质粒大片段缺失突变体库。     

福氏志贺菌两种血清分型方法的比较

目的评价福氏志贺菌两种血清分型方法。方法使用传统血清分型方法和多重PCR血清分型方法对255株福氏志贺菌进行血清型分析。结果传统血清分型方法的分型率为98.4%(251/255),多重PCR血清分型方法分型率为96.1%(245/255),两种方法的分型率经卡方检验,差异无统计学意义(χ2=2.644,P>0.05)。有46株菌(18.0%,46/255)通过这两种血清分型得到的结果不一致。结论两种血清分型方法的分型率差异无统计学意义,但部分结果判断有不同。多重PCR更适用于大量样本的检测,传统血清分型方法可以与其互为补充。     

志贺菌福氏2a毒力大质粒DNA全序列的测定与基因分析

对志贺菌福氏2a 301株的毒力大质粒pCP301的DNA全序列进行了测定, 并进行了结构分析. 结果表明, pCP301 DNA全序列由221618个碱基对组成, 基因分析共确定了272个开放读码框架(ORF), 经过与基因数据库比较, 其中194个ORF与已知基因或编码产物具有高同源性, 61个ORF同源性较低, 其余17个为新确定的未知功能的ORF. pCP301中的基因主要包括: (ⅰ) 与细菌毒力有关的ipa-mxi-spa, osp和iph基因; (ⅱ) 与调控有关的vir基因; (ⅲ) 与质粒的维持、稳定和DNA代谢有关的mvp, stb, rep和par等基因; (ⅳ) 转座酶编码基因. pCP301中的插入序列总长68 kb, 占全序列的 30%, 提示pCP301在细菌生长与进化过程中发生了多次基因重排. 研究结果对揭示志贺菌的致病机理及大质粒的遗传与进化有重要意义.     

一株新的多重耐药福氏志贺菌噬菌体生物学特性及基因组分析北大核心CSCD

抗生素的大量使用和滥用造成细菌耐药性问题愈发严峻,噬菌体疗法作为一种精准治疗多重耐药病原菌的有效方法开始被人们日益重视。采用双层琼脂平板法从活性污泥中分离出多重耐药福氏志贺菌(Shigella flexneri)噬菌体P003,鉴定为肌尾噬菌体科(Myoviridae)。通过生物学特性测定表明P003的最佳感染复数为10,潜伏期约10 min;在4-70℃、pH 3.0-10.0的条件下保持活性。全基因组测序表明,噬菌体基因组长约68 721 bp,GC含量46.14%,预测编码99个开放阅读框(open reading frame,ORF),未发现已知耐药基因和毒力基因。全基因组多序列线性与进化树分析结果表明,P003与大肠杆菌噬菌体有较近的亲缘关系,但不能侵染大肠杆菌。从活性污泥原位分离到一株新的多重耐药福氏志贺菌噬菌体P003,为利用噬菌体疗法防治多重耐药病原菌S.flexneri感染提供了新的菌种资源。     

驱除侵袭大质粒pINV对福氏2a志贺氏杆菌2457T影响的比较蛋白质组学研究

将福氏志贺氏杆菌2a 2457T及其驱除侵袭大质粒pINV的菌株培养至对数生长中期,制备了全细胞蛋白质。用双向电泳分离两种细胞蛋白质混合物并进行比较,找出差异点,这些点经过胶内酶切后进行MALDI_TOF质谱鉴定。每个蛋白质点的肽指纹图谱都在福氏志贺氏杆菌2a 2457T株的蛋白质数据库用Mascot进行检索,共发现了10个差异表达的蛋白质。结果显示驱除大质粒后几个参与核酸代谢途径的酶表达量有所上升。其中胞啶/脱氧胞啶脱氨酶、嘌呤核苷磷酸化酶和尿嘧啶核苷磷酸化酶表达量的上升可能造成尿嘧啶和尿（嘧啶核）苷合成的增加。     

福氏2a志贺氏菌2457T株argT基因突变体的构建

目的：构建福氏2a志贺氏菌2457T株argT基因缺失突变体和ArgT蛋白非降解突变体,以进行后续ArgT功能研究。方法：根据福氏2a志贺氏菌2457T株基因组全序列,采用λ-Red重组系统对argT基因进行缺失,并经PCR验证;采用定点突变的方法构建ArgT非降解株,并经SDS-PAGE验证;对野生株、argT缺失突变株和ArgT非降解突变株37℃时的生长曲线及生化反应进行比较研究。结果：构建了2457T的argT缺失突变株和ArgT非降解突变株;2种突变株初始生长均较慢,但最终和野生株状态一致;2种突变株利用甘露醇的能力都比野生株强,而利用葡萄糖的能力降低。结论：获得了福氏2a志贺氏菌2457T株argT基因缺失突变体和ArgT蛋白非降解突变体。     

与福氏2a志贺氏菌2457T株ArgT相互作用蛋白的筛选及鉴定

目的：筛选、鉴定与福氏2a志贺氏菌2457T株ArgT相互作用的蛋白,以进一步研究ArgT在福氏2a志贺氏菌致病过程中发挥的作用。方法：将ArgT与GST融合表达,通过体外GST沉降实验和MALDI-TOF MS技术,筛选并鉴定与福氏2a志贺氏菌2457T株ArgT相互作用的蛋白。结果：筛选并鉴定到与福氏2a志贺氏菌2457TArgT相互作用的蛋白OmpR。结论：OmpR与ArgT存在体外相互作用。     

宋内志贺氏菌1173质粒基因组及耐药基因转移机制

【目的】研究质粒介导宋内志贺氏菌1173耐药基因bla_(CTX-M-64)转移的机制。【方法】用双纸片协同扩散法验证1173是否产超广谱β-内酰胺酶(ESBL),用PCR扩增鉴定其携带的耐药基因,接合转移实验检验其耐药质粒是否可通过接合转移给其他细菌,并对接合子是否产ESBL和携带耐药基因进行检验,利用VITEK~?2检测1173和接合子的耐药谱,提取质粒进行高通量基因组测序,并对质粒序列进行生物信息学分析,以研究其耐药基因转移机制。【结果】1173是产ESBL的多药耐药宋内志贺氏菌,携带的耐药基因有bla _(CTX-M-64)和bla _(TEM),其中的bla _(CTX-M-64)可通过接合转移作用传递给受体菌EC600,并使接合子具有相应的耐药谱。经序列测定和生物信息学分析表明,介导bla _(CTX-M-64)水平转移的是ISEcp1-bla_(CTX-M-64)-Δorf477转座单元。【结论】质粒携带的bla_(CTX-M-64)介导1173对多类抗菌药物的耐药,ISEcp1-bla_(CTX-M-64)-Δorf477转座单元介导bla_(CTX-M-64)在细菌间的转移。     

一株新的沙门菌烈性噬菌体IME-SAL1的分离、全基因组测序和比较基因组分析

目的:分离鉴定一株沙门菌的烈性噬菌体,观察其形态大小,完成全基因组测序,分析其基因组结构和进化关系,为治疗沙门菌感染提供新的策略和实验依据。方法:以沙门菌SAL95作为指示菌从医院废水中分离噬菌体,分离到的噬菌体经浓缩和纯化后采用透射电镜观察其形态大小,提取噬菌体的基因核酸并完成全基因组高通量测序,分析其全基因组的结构特征,通过比较基因组分析研究其进化关系。结果:从解放军307医院未经消毒处理的废水中分离到一株烈性沙门菌噬菌体。电镜观察显示,该噬菌体头部呈立体对称,有一不收缩的长尾。其基因组全长113 183 bp,比较基因组分析确定该噬菌体为一株新的沙门菌噬菌体,命名为IME-SAL1。结论:从医院废水中分离到一株烈性沙门菌噬菌体IME-SAL1,研究了该噬菌体的分类、基因组结构、进化关系,可为其实际应用提供参考。     

贺氏福氏5型菌外膜蛋白ipa BC基因的高效表达及其免疫保护作用的研究

本文从一次克隆重组质粒pMG488中酶切回收了3．3kb的ipa Bc结构基因,将它在不同的位点插入带有PRPL启动子的载体pBV220中,构建了两种高表达重组质粒pMG501及pMG601。在大肠杆菌DH55a和无毒性福氏5M90TA菌中均获得了b、c多肽的高水平表达,初步的小鼠免疫攻毒试验显示b,c多肽可能有一定的免疫保护作用。     

一株鳢源鰤诺卡氏菌致病性与全基因组分析

【背景】鰤诺卡氏菌是一种典型的条件致病菌,感染鳢、鲈等多种名优鱼类,易造成存在机体损伤或免疫机能下降的鱼持续性感染,给水产养殖业造成了巨大损失。【目的】了解临床分离鳢源鰤诺卡氏菌对乌斑杂交鳢（斑鳢♀×乌鳢♂）的致病性,并从全基因组层面了解该病原菌的基因组和致病因子信息,为鰤诺卡氏菌后续病原学及鰤诺卡氏菌病防治技术和疫苗的开发研究提供有利的数据支撑。【方法】鰤诺卡氏菌NK201610020通过回归感染试验和发病鱼靶器官组织病理分析,了解鰤诺卡氏菌的毒力和病理特征。通过对试验菌进行全基因组测序和比较基因组学分析,挖掘该菌的基因组与毒力特征。【结果】回归感染试验结果显示,除1.5×10³组外,其余5个感染组致死率高达90%,LD₅₀为1.079×10³ CFU/mL,说明试验菌毒力较强。组织病理学观察到肝、脾、肾呈现严重的病理损伤,而且有肉芽肿结构形成。试验菌全基因组测序发现,全基因组大小为8294329bp,GC含量为68.10%,共预测到编码基因7812个。比较基因组学分析发现,不同地区不同宿主来源鰤诺卡氏菌在基因组基础特...     

两株超级广泛耐药结核分枝杆菌全基因组比较分析

【目的】结合现有数据,通过对两株临床超级广泛耐药的结核分枝杆菌全基因组的测序和分析,发现其型别相关的突变位点,解释发生广泛耐药的基因组突变机制。【方法】利用Solexa第二代测序技术对两株广泛耐药结核分枝杆菌(FJ05194和GuangZ0019)进行全基因组测序分析。以H37Rv为参考序列得到两株广泛耐药菌株的单核苷酸多态性(SNPs),构建系统发育树鉴定菌株型别,判断突变位点中型别相关和非型别相关的SNPs。定位SNPs所在的基因组区域,对型别相关的突变基因进行KEGG通路的富集分析,对非型别相关的突变基因和间隔区判断是否与耐药相关。【结果】两株广泛耐药菌株分别属于Lineage2和Lineage4型别,两菌株在碱基替换方面存在差异性,Lineage2型别相关的基因功能富集于ABC转运蛋白和核苷酸切除修复的通路。耐药方面,发现了已知的耐药相关基因的突变(rpoB、katG、rpsl、gyrA、gyrB、embB和ethA等),但卷曲霉素和卡那霉素相关的rrs、tlyA和eis启动子区域未发生突变,不足以解释其耐药性的产生。与最新报道的候选耐药基因比较,发现了卷曲霉素和卡那霉素相关的突变(Rv1393c、Rv0265c和narX等)和外排泵相关的pstB、Rv2333c和Rv2687c突变。【结论】结核分枝杆菌Lineage2型别相关的SNPs中含有影响结核分枝杆菌突变率和耐药性的突变。对于两株超级广泛耐药的结核菌,已知的激活药物或药靶相关的单耐药基因突变集合不能完全解释其广泛耐药性,还涉及新候选结核耐药基因、外排泵和补偿等其他潜在机制的相关基因突变。     

一株类志贺邻单胞菌噬菌体生物学特性及全基因组分析

[目的]多重耐药菌株的出现给食品安全带来严重威胁.噬菌体是不同于抗生素的一类重要杀菌因子,对其生物学特性及基因组的研究和分析可为噬菌体的抗菌应用提供依据.[方法]对噬菌体phiP4-7的生物学特性、基因组学、分类学进行研究.[结果]经透射电子显微镜观察,确定phiP4-7头部直径为(50.59±1.68) nm,尾部长...     

志贺氏菌属鲍氏(S. boydii)亚群基因组组成与进化分析

利用比较基因组杂交法(comparative genomic hybridization, CGH)对志贺氏菌属鲍氏(S. boydii)亚群共18个血清型代表菌株的基因组结构组成进行比较分析, 结果显示, 该亚群基因组的“共有骨架”包含2552个与非致病性大肠杆菌K12同源的ORFs. 比对K12基因组, 该亚群所有菌株基因组共同缺失ORFs为199个, 主要涉及外膜蛋白编码基因和O-抗原合成相关基因, 而属于亚群特异性的ORFs主要以噬菌体基因和未知功能ORFs为主, 一些参与铁离子代 谢、运输和Ⅱ型分泌系统基因在大多数的鲍氏菌株中存在. 以比较基因组杂交法得到的进化分析显示: 鲍氏亚群18个血清型代表菌株可分为4组, 其中13型与其他菌株有较大的差异. 这种分组结果与某些代谢相关的基因分布情况存在对应关系. 通过对该亚群“共有骨架”、缺失基因和株特异基因, 以及进化分类等方面的分析, 以期探索该亚群基因组的进化规律, 并为志贺氏菌属鲍氏亚群的致病机理、疫苗研制和药物开发等方面的研究提供重要线索.     

烟草棒状弯孢菌线粒体全基因组特征及系统发育分析

近年来,由弯孢属真菌侵染引发的病害在烟草上有上升的趋势,严重影响烟叶的产量和质量。为了更好地防治由弯孢属真菌引起的烟草叶斑病,本研究利用高通量测序技术对一株分离自烟草叶片的棒状弯孢菌Curvulariaclavata线粒体基因组进行测序,组装得到一个环状的线粒体基因组,并对其组成特征、与典型叶斑病真菌的系统发育关系进行分析。结果表明,烟草棒状弯孢菌线粒体基因组长度为41 763 bp,共编码38个基因(13个蛋白编码基因、2个rRNA基因和23个tRNA基因),其碱基组成有显著的A-T偏好性,占比高达70.35%。线粒体基因组中只有3个内含子和少量重复序列,这是造成其基因组大小收缩的主要原因。通过6个近缘病原真菌线粒体全基因的共线性分析,发现其线粒体基因组发生了基因重排事件。同时,物种同源区长度与对应物种的线粒体基因组大小呈正相关关系,同源区长度可能会影响物种的线粒体基因组大小。在选择压力分析中,发现烟草棒状弯孢菌线粒体为确保优势基因稳定遗传,自然选择和纯化选择起到了主导作用。系统发育分析表明烟草棒状弯孢菌与麦根腐平脐蠕孢Bipolarissorokiniana和稻平脐蠕孢Bipola...     

质粒拯救法克隆细菌基因组大片段

[目的]细菌基因组大片段尤其是基因簇的克隆与操作,是细菌基因功能分析的一个难点.基因组测序工作的不断完成和序列信息的大量积累,为细菌基因组:DNA的操作提供了方便.本文报道了利用细菌的全基因组信息和质粒拯救法的原理建立的一种克隆细菌基因组大片段的方法.[方法]首先,根据基因组序列信息,在待克隆片段的一侧扩增一段DNA,并将其克隆到自杀载体上构建打靶质粒,然后,将打靶质粒整合到细菌的基因组中构建重组菌,提取重组菌的基因组DNA,酶切,自连,转化,将自杀质粒与待克隆的目的片段一起拯救出来.最后,根据需要将拯救的DNA片段亚克隆到新的载体中.[结果]我们利用该方法克隆了布鲁氏菌中长度为11kb的virB操纵子,并构建了互补质粒.将该质粒导入到virB的突变株中后使virB操纵子的转录活性得到了恢复,表明该策略切实可行.[结论]这种重组克隆策略给我们提供了一种新的对细菌基因组大片段进行操作的方法.     

密度感应系统对弗氏志贺菌生长竞争能力的影响

密度感应系统调节细菌应答反应的发生,这些应答反应与细胞密度有关。通过对比大肠杆菌(Escherichia coli)和志贺氏菌(Shigella spp.)的序列发现,志贺菌属密度感应系统操纵子普遍存在丢失或突变。为研究其密度感应系统的功能,文章利用哈氏弧菌(Vibrio harveyi)BB170作为指示菌,检测弗氏志贺菌(Shigella flexneri)密度感应系统信号分子AI-2,证明其可以分泌有活性的AI-2;其次,采用Golden Gate克隆法将大肠杆菌MG1655的密度感应系统基因克隆至弗氏志贺菌301中,获得密度感应系统回复株301。通过菌落计数表明,在混合培养条件下,密度感应系统基因回复株301比野生株301存在生长优势;通过双向电泳初步比较分析表明,密度感应系统基因可以在志贺菌中表达,并鉴定到了其他一些与应激反应相关的差异表达蛋白, 如Hsp60、GroEL、SodB。     

来自南极洲类诺卡氏菌(Nocardioides sp.) InS609-2的全基因组序列分析

【背景】类诺卡氏菌（Nocardioides sp.） InS609-2是一株分离自南极洲罗斯海特拉诺瓦湾的恩克斯堡岛土壤中潜在的极地放线菌新种。尚无研究报道Nocardioides sp.InS609-2的全基因组序列，缺少对其功能基因、代谢产物合成途径及比较基因组学等的研究。【目的】解析Nocardioides sp.InS609-2的基因组序列信息，以深入挖掘次级代谢产物基因资源。【方法】利用Illumina HiSeq高通量测序平台对菌株InS609-2进行全基因组完成图测序，使用相关软件对测序数据进行基因组组装、基因预测和功能注释、预测次级代谢产物合成基因簇和共线性分析等。【结果】基因组最后得到的总长度为4 524 052 bp，G+C含量为69.42%，预测到4 656个基因、56个tRNA和6个rRNA。根据Nocardioides sp.InS609-2的全基因组测序结果，分别有3 761、3 052、1 767、4 134和2 725个基因在COG、GO、KEGG、NR和Swiss-Prot数据库中提取到注释信息。同时，还预测得到19个次级代谢产物合成基因簇。基因组测序数据提交至NCBI获得GenBank登录号为CP060034。Nocardioides sp.InS609-2与N. dokdonensis CP015079、N. yefusunii CP034929、N. euryhalodurans CP038267、N. seonyuensis CP038436、N. daphniae CP038462和N. okcheonensis CP087710这6株基因组同源性比较高的类诺卡氏菌进行共线性分析和蛋白聚类分类分析，得到的结果是7个基因组间既有保守性又各自有独特性。七个基因组共有44个蛋白聚类簇。最后进行16S rRNA基因系统发育树、泛基因组、core基因组和基因组进化树分析，进一步挖掘了Nocardioides sp.InS609-2的基因组信息。【结论】从基因组层面上预测了Nocardioides sp.InS609-2的次级代谢产物的生物合成基因簇，为InS609-2的后续相关研究提供了参考信息，具有重要意义。     

引起芭蕉芋细菌性软腐病的玉米迪基氏菌(Dickeya zeae)CE1的全基因组序列及比较基因组学分析

【背景】玉米迪基氏菌(Dickeya zeae)可引起香蕉、水稻等重要作物的细菌性软腐病,并造成巨大的损失。芭蕉芋抗性较好且与病虫害相关的报道很少,本研究团队首次报道了由D.zeae CE1引起的芭蕉芋细菌性软腐病。【目的】揭示CE1菌株的全基因组序列,并与同样来源于广东香蕉和水稻的D. zeae菌株作比较基因组学分析,初步探讨D. zeae种内不同病原细菌在与寄主互作过程中可能存在的遗传分化机制。【方法】采用三代测序结合二代测序对CE1菌株进行完整基因组测序,利用比较基因组学方法分析该菌株与香蕉和水稻菌株的进化关系和基因组特征差异。【结果】细菌基因组测序表明,CE1菌株的完整基因组大小为4 714 731 bp,注释预测到4 052个编码基因。与芭蕉芋和香蕉两个寄主亲缘关系类似,基因组比较分析发现来自芭蕉芋和香蕉的病菌菌株亲缘关系较近,它们在遗传进化上明显不同于水稻菌株。基因家族分析表明,编码重要致病因子如细菌分泌系统、鞭毛蛋白、胞外多糖、规律间隔成簇短回文重复序列(clustered regularly interspaced short palindromic repeats,C...