脱硫菌Rhodococcus sp.LY822专一性脱硫活性及相关基因的研究

以专一性脱硫菌Rhodococcus sp. LY822质粒DNA为模板,利用已知的脱硫基因序列设计引物,PCR扩增得到了3个脱硫基因片段dszA, dszB和dszC. 构建了相应的表达质粒pETA, pETB和pETC,在转化大肠杆菌BL21(DE3)中表达,得到了dszA, dszB和dszC基因的融合表达产物. SDS-PAGE分析结果显示,蛋白带分子量分别为50, 40和45 kDa. 3种重组菌BL21(DE3)(pETA), BL21(DE3)(pETB)和BL21(DE3)(pETC)的无细胞粗提液(2 mL)的活性检测结果表明,DszC酶的粗提液反应30 min能够将0.02 mmol/L二苯并噻吩完全转化为二苯并噻吩砜,DszA酶的粗提液能够将0.01 mmol/L二苯并噻吩砜完全转化为羟基联苯亚磺酸盐,DszA和DszB酶的粗提液联合作用能够将0.01 mmol/L二苯并噻吩砜完全转化为2-羟基联苯,证明LY822对二苯并噻吩的降解符合专一性脱硫的"4S途径".     

低温等离子体诱变选育高效脱硫菌的研究

采用低温等离子体对从延安黄陵某煤矿坑水中分离得到的氧化亚铁硫杆菌进行诱变育种,考察诱变时间和放电间距对诱变效果的影响,在最佳诱变条件下考察了突变菌株的脱硫性能。结果表明,原始菌株的生长周期2~3 d,Fe~(2+)平均氧化速率为0.22 g/(L·h),通过低温等离子体诱变得到突变型菌株,在诱变时间5 min,放电间距4 mm的条件下,生长周期较原始菌株缩短12 h,Fe~(2+)平均氧化速率提高45.5%,正突变率达24.2%,脱硫率较原始菌株提高了27.9%。     

生物质对红球菌属菌株lawq生长和脱硫酶活力的影响

红球菌属菌株lawq是专一性脱硫菌,其脱硫酶系由dszA、dszB和dszC组成,其中关键酶是dszC。文章以脱硫活力作为产脱硫酶系的基准,研究了基本营养物质C、N和S对发酵产酶的影响,实验结果发现最佳的碳源、氮源和硫源分别为甘油、氯化铵和二苯并噻吩(DBT),甘油和氯化铵适宜质量浓度为2 g/L,DBT适宜浓度为0.2 mmol/L;还研究了生物质对菌体生长和脱硫酶活力的影响,实验结果发现,添加VB类物质对菌体的生长和酶活力有不同程度的提高。     

低温等离子体诱变选育高效脱硫菌的研究

采用低温等离子体对从延安黄陵某煤矿坑水中分离得到的氧化亚铁硫杆菌进行诱变育种,考察诱变时间和放电间距对诱变效果的影响,在最佳诱变条件下考察了突变菌株的脱硫性能。结果表明,原始菌株的生长周期2³ d,Fe3 d,Fe⁽²⁺⁾平均氧化速率为0.22 g/(L·h),通过低温等离子体诱变得到突变型菌株,在诱变时间5 min,放电间距4 mm的条件下,生长周期较原始菌株缩短12 h,Fe(2+)平均氧化速率为0.22 g/(L·h),通过低温等离子体诱变得到突变型菌株,在诱变时间5 min,放电间距4 mm的条件下,生长周期较原始菌株缩短12 h,Fe⁽²⁺⁾平均氧化速率提高45.5%,正突变率达24.2%,脱硫率较原始菌株提高了27.9%。     

红串红球菌脱硫酶的活性调节

研究了分别以葡萄糖或乙醇为唯一碳源对红串红球菌脱硫活性的效应．结果表明乙醇作为碳源可以促进红串红球菌3种脱硫基因的表达和脱硫酸的生产,并可促进辅酶FMNH2的生物合成,进而提高红串红球菌脱硫酸（dszC,A）的活性．     

原生质体复合诱变选育刺芹侧耳木质素降解酶高产菌株

通过对刺芹侧耳(Pleurotus eryngiiGIM5.280)原生质体开展复合诱变及传代培养,以期得到遗传稳定的木质素降解酶高产菌株。结果表明,通过25s紫外诱变刺芹侧耳原生质体,正突变率达16%。对紫外诱变正突变株进行60Coγ二次复合诱变再生,获得五株正突变突出菌株。经过摇瓶发酵实验,发现这五株菌株产木质素降解酶能力较出发菌株明显提高。同时开展高产菌株的传代培养,检验其传代稳定性。连续传代四代测试结果表明,007号和167号菌株遗传的稳定性表现突出,发酵液中木质素降解酶产量稳定。尤其是007号菌株产酶可达到110U·mL-1,比出发菌株的酶活表达量提高54.3%。复合诱变能明显提高刺芹侧耳产木质素降解酶能力。     

紫外-亚硝基胍复合诱变筛选高产淀粉酶菌株

目的经紫外-亚硝基胍(NTG)复合诱变选育高产淀粉酶菌株。方法以蜡状芽孢杆菌SWWL06(Bacillus cereusSWWL06)为出发菌株,分别经紫外、亚硝基胍(NTG)诱变原始菌株,获得最佳诱变条件;经紫外-NTG复合诱变,所得突变菌株以透明圈与菌落直径比值大小进行初筛,再经摇瓶培养进行复筛,得高产淀粉酶突变株;连续传代,检测其遗传稳定性。结果确定紫外波长254 nm,照射时间120 s,垂直照射距离20 cm为最佳紫外诱变条件;NTG浓度为0.5 mg/ml,诱变时间40 min为最佳NTG诱变条件;紫外-NTG复合诱变筛选出9株突变株,其中UV-NTG-3酶活力为3.515 U/ml,增幅最高,较原始菌株SWWL06提高3.59倍;将UV-NTG-3连续传代10次,酶活性仍可达到第一代的97%。结论已成功选育出1株高产淀粉酶菌株UV-NTG-3。     

CO2激光辐照诱变选育纳豆芽孢杆菌高抗菌活性菌株

应用红外CO2激光辐照纳豆芽孢杆菌bacillus subtilis natto S252,经分析测定,结果得到一高抗菌活性突变株F604,对指示菌金黄色葡萄球菌及大肠杆菌试验,发现抗菌活性比出发菌株分别提高1.26和1.43倍（抑菌圈直径）;同时证实F604具有高抗菌活性的继代稳定性,说明CO2激光辐照在菌株诱变方面卓有成效。     

植酸酶的激光诱变改性与分离纯化

植酸酶产生菌———黑曲霉(Aspergillus niger)可在不同的辐照条件下进行激光诱变,确定了适宜的诱变条件,即输出波长为1.06μm的Nd:YAG高重复率声光调Q激光,辐照频率4 kHz,功率10 W,水平照射2~2.5m in,并建立了变异菌株基因库。通过高通量筛选,从中筛选到一株酶学性质比较符合工业生产要求的变异菌株phy226,pH=2~3的第二酶活峰提高了40%,酶活温度稳定在30~60℃。发酵液经盐析、透析、凝胶层析和离子交换层析等分离纯化过程,最终纯化倍数达7.8,收率为25.2%。     

β-1,4-葡聚糖内切酶的定向进化

根据阳性转化子在IPTG诱导下可以在LB-CMC平板上产生水解圈的原理,在初筛和摇瓶复筛的基础上,采用易错PCR法对β-1,4-葡聚糖内切酶基因进行定向进化,从阳性转化子中筛选酶活提高的突变菌株.突变酶活性是野生酶的1.32倍,催化效率约为野生酶的1.26倍.基因测序结果表明,突变酶基因DNA序列中有3个碱基发生了突变...     

烟曲霉Aspergillus Fumigatus 3-甾酮-Δ~1-脱氢酶基因的克隆、异源表达和活性鉴定

微生物转化在甾体药物合成中起着不可替代的作用,其中C1,2位脱氢是最为重要的反应类型。以烟曲霉（A.fumigatus）为出发菌株,运用同源序列比对从烟曲霉酸基因簇中钓取出kstDF序列。该基因与玫瑰色热微菌（Ther-momicrobium roseum）DSM 5159的kstD一致性为51%。构建pET28a（＋）-kstDF表达载体,转化大肠杆菌（Escherichiacoli）BL21（λDE3）,获得高表达重组子菌株。经IPTG诱导、SDS-PAGE电泳分析,发现高温（37℃）有利于KstDF蛋白表达,低温（20℃）有利于酶活的保持。该重组菌显示出良好的甾体转化能力,在12 h内完全转化13.3 mg.L-1雄甾-4-烯-3,17-二酮,为构建高效转化3-酮基-4-烯类固醇的基因工程菌奠定了基础。     

N^＋离子注入诱变筛选胸腺嘧啶缺陷型大肠杆菌

利用N＋离子注入诱变大肠杆菌,经甲氧苄啶的选择性筛选,得到胸腺嘧啶营养缺陷型菌株。通过重组DNA技术将该突变株胸苷酸合成酶（TS）基因连接到载体pMD-18T质粒上,经测序发现TS基因第173个碱基由AT→CG,其相应的氨基酸由谷氨酸（E58）突变为丙氨酸（A58）。该突变株的获得为后续研究嘧啶核苷酸的代谢奠定了基础。     

谷氨酰胺转胺酶基因的结构分析及定点突变

根据分离得到的吸水链霉菌的谷氨酰胺转胺酶基因,预测其三维结构,确定其酶活中心,并构建定点突变体。用PCR扩增谷氨酰胺转胺酶基因,通过SWISS-MODEL在线预测三维结构,找到酶活中心,确定突变位点,将361位的组氨酸(CAC)突变成赖氨酸(AAA),将突变后的基因片段连接到pET-22b(+)上得到重组质粒pET-22b(+)-MTG,并转入大肠杆菌BL21(DE3)中进行表达。结果显示,通过对比已有的三维结构模型,找到了酶活中心,并通过重叠延伸PCR(SOE-PCR)技术成功构建了突变体。     

β-葡萄糖苷酶高产菌株的筛选及其基因的克隆与表达

利用栀子苷培养基从滨海新区盐碱地土样中筛选得到一株高产β-葡萄糖苷酶菌株,酶活力达到14.82U·mL-1,经16SrDNA鉴定,命名为短小芽孢杆菌B-4。克隆获得B-4β-葡萄糖苷酶基因,测序结果表明,其大小为1437bp,与GenBank中短小芽孢杆菌SAFR-032β-葡萄糖苷酶基因YP_001488769.1序列比对,核苷酸序列同源性达97%,氨基酸序列同源性达99%。进一步利用表达载体pET-22b（＋）,实现β-葡萄糖苷酶基因bglB在大肠杆菌BL21（DE3）中的高效表达,酶活力达46.85U·mL-1。     

压裂液增稠剂降解菌的诱变育种研究

以降解压裂液增稠剂并产β-甘露聚糖酶的Bacillus subtilis K为出发菌株,采用紫外线和甲基磺酸乙酯诱变提高酶的活性。结果表明紫外线照射时间选为30~40s,诱变后酶活提高了13.97%;1%的甲基磺酸乙酯诱变10min,酶活提高了3.97%,紫外线诱变效果好于甲基磺酸乙酯。     

紫色杆菌素合成工程菌太空诱变效应及其高产菌株的筛选

利用太空搭载("神舟七号"航天飞船)对合成紫色杆菌素的弗氏柠檬酸杆菌(Citrobacter freundii)基因工程菌株进行了太空诱变,平板和液体发酵筛选实验表明太空诱变后菌株突变率达到70%左右,其中正向突变率7.3%,负向突变率为61.2%。筛选到一株紫色杆菌素高产突变菌株M_(S4),该菌株在摇瓶水平上,以0.45%(体积分数)的甘油为碳源,于20℃发酵32 h,紫色杆菌素浓度达到2.16 g·L~(-1),较出发菌株提高约143.8%。遗传稳定性、HPLC和DNA序列分析结果表明太空搭载突变菌株有很高的遗传稳定性,产生的紫色杆菌素比例比出发菌株有明显提高,但是紫色杆菌素生物合成基因簇序列没有发生突变,表明太空搭载有可能对菌株的基因调控网络产生了影响。     

有效增强重组腈代谢酶系表达活性的策略

讨论并提出了有效增强重组腈代谢酶系表达活性的多种策略。根据所选用的载体和宿主的不同表达特性,同时克隆目的基因上、下游的正向调控序列可直接增强酶表达水平;强化翻译后的修饰,可有效提高活性;除了常用的大肠杆菌克隆表达体系外,开发新型宿主-载体系统可为重组酶的活性表达提供新的途径;随着生物信息学技术的迅速发展,利用已知三维结构的蛋白对目标酶进行突变位点设计及结构与功能预测,将有望加快腈代谢酶系的定点突变研究进程。     

角质酶产生菌Thermobifida fusca WSH03-11诱变及高产突变株发酵条件优化

以Thermobifida fusca WSH03-11为出发菌株,经硫酸二乙酯诱变,获得一株遗传稳定性好的高产角质酶的突变菌株(酶活由2.3 U/mL提高为8.9 U/mL)。确定了以乙酸钠为碳源,并在2.5 L发酵罐中研究了不同pH值对突变株角质酶分批发酵的影响。根据不同pH值下发酵过程中细胞比生长速率及产物比生长速率的变化,确定了分阶段控制pH值的策略,即在发酵前20 h控制pH值7.3、20 h后控制pH值7.6,这种条件下角质酶活达到19.8 U/mL,比采用单一pH值7.0、7.3、7.6、7.9下的最大值分别提高了125%,64%,37%,47%。     

诱变选育木聚糖酶高产菌及其发酵条件优化

采用微波辐照对木聚糖酶产生菌疏棉状嗜热霉菌(Thermomyces lanuginosus)CICC 2691进行诱变选育,考察不同微波功率和辐照时间对菌株致死率和正突变率的影响,得到最佳的诱变条件:微波辐照功率为500 W,辐照时间为60 s。在最佳诱变条件下得到一株高产木聚糖酶且能稳定遗传的菌株W5-133,其所产木聚糖酶酶活较出发菌株提高了66.8%。以菌株W5-133为研究对象,经单因素试验和响应面分析法对其发酵产酶条件进行了优化,得到最优发酵产酶条件:葡萄糖质量浓度为2.35g/L,发酵温度为56.0℃,发酵时间为99.5h,初始p H值为5.8,该条件下的木聚糖酶酶活为186.81 U/mL,比优化前提高了24.4%。     

黑曲霉诱变产酶活性与稻壳中木聚糖定向酶解的研究

采用紫外线照射诱变黑曲霉,筛选出低纤维素酶活的木聚糖酶高产菌株,研究了最优诱变条件,分析了诱变后黑曲霉产木聚糖酶的活性,测定了木聚糖酶对温度和pH值的稳定性。并初步探讨了木聚糖浓度、加酶量对酶解的影响。结果表明,最优诱变条件为:紫外照射功率40 W、照射距离28 cm、诱变时间2.5 min;黑曲霉产木聚糖酶的最适温度为50℃、最适pH值为4.2。木聚糖浓度对木聚糖的酶解没有影响,加酶量对木聚糖的酶解有一定影响;在木聚糖浓度为30 g.L-1、加酶量为2%~5%时,酶解效果较好。