人甲状腺刺激激素受体cDNA的克隆及真核表达载体的构建

目的克隆人甲状腺刺激激素受体(hTSHR)基因cDNA并构建其真核表达载体。方法以人甲状腺组织cDNA为模板,聚合酶链反应(PCR)扩增hTSHR基因编码区的全部序列,克隆入pGEM-T载体中,经限制性内切酶、DNA序列分析鉴定目的基因后,定向亚克隆到真核细胞表达载体pcDNA3.1中,并进行双酶切鉴定。结果PCR扩增的特异性片段长度为2 337 bp,以此构建的pGEM-T-hTSHR克隆载体,经限制性内切酶酶切及DNA序列分析证实载体中带有hTSHR基因编码区的目的片段,重组质粒pcDNA3.1-hTSHR经KpnⅠ和XbaⅠ双酶切后显示5 1000 bp和2 300 bp左右的2个条带,DNA序列分析显示与GenBank中的hTSHR基因cDNA序列一致,证明hTSHR基因已成功克隆入真核细胞表达载体pcDNA3.1中。结论成功构建了野生型pcDNA3.1-hTSHR重组真核表达载体。     

人MCHR2真核表达载体的构建及稳定转染CHO细胞系的建立

目的 构建人MCHR2真核表达载体,转染CHO细胞,建立稳定转染的CHO细胞系.方法 采用PCR方法,以人胎脑cDNA文库为模板扩增人MCHR2基因的全长cDNA编码区序列,利用DNA重组技术将其定向插入到真核表达载体pcDNA3.1( ),经酶切和测序鉴定后,用脂质体转染法转染CHO细胞,通过G418筛选,建立稳定转染的CHO细胞系,用RT-PCR、Western blot及免疫荧光法检测MCHR2的表达.结果 成功构建了pcDNA3.1( )/MCHR2真核表达载体,并建立了稳定转染的CHO细胞系,成功地表达目的基因.结论 真核表达载体成功构建和稳定转染CHO细胞系的建立为进一步研究MCHR2的功能奠定良好的实验基础.     

人同源盒基因NKX3.1cDNA真核表达载体的构建及表达

目的：构建人同源盒基因NKX3.1 cDNA真核表达载体,研究其在前列腺癌细胞PC 3、LNCaP中的表达情况。方法：以人前列腺癌细胞LNCaP细胞中的总RNA为模板,RT PCR扩增NKX3.1基因全长编码片段,T/A克隆至pCR2.1载体中。经酶切、测序鉴定后,将NKX3.1cDNA重组到真核表达载体pcDNA3.1（+）中。将pcDNA3.1 NKX3.1表达载体瞬时转染前列腺癌细胞PC 3和LNCaP 细胞,RT PCR和Western blot法检测NKX3.1cDNA在转录水平和蛋白水平的表达。结果：人同源盒基因NKX3.1 cDNA真核表达载体pcDNA3.1 NKX3.1经酶切及测序鉴定正确。 pcDNA3.1 NKX3.1转染PC 3和LNCaP细胞后,经RT PCR和Western blot证明在mRNA和蛋白水平均能有效表达NKX3.1。结论：成功构建了真核表达载体pcDNA3.1 NKX3.1, 转染前列腺癌细胞PC 3和LNCaP后能有效表达。     

rAQP4-M1真核表达载体的构建及在CHO细胞中的表达

目的 构建rAQP4-M1基因真核表达载体,建立稳定转染AQP4-M1的CHO细胞系.方法 应用RT-PCR从大鼠脑组织中扩增rAQP4-M1,并将PCR产物双酶切后插入到pcDNA3.1(+)真核表达载体中,经过菌落PCR、双酶切及测序验证的pcDNA3.1(+)/rAQP4-M1质粒通过脂质体转染CHO细胞.G418筛选建立稳定转染rAQP4-M1的CHO细胞系.采用细胞免疫荧光和免疫印迹技术检测rAQP4-M1在该细胞系中的表达.结果 成功构建了pcDNA3.1(+)/rAQP4-M1表达质粒,建立了稳定转染的CHO细胞系.免疫荧光检测结果显示,rAQP4-M1在CHO细胞膜上稳定表达;免疫印迹检测可见34×103处的阳性条带,表明rAQP4-M1在该细胞系中成功表达.蓝绿温和胶电泳技术证实了rAQP4-M23而不是rAQP4-M1参与了正交排列颗粒(orthogonal arrays of particles,OAPs)的形成.结论 rAQP4-M1在CHO细胞系中稳定表达成功,rAQP4-M1未参与OAPs的形成.     

人Flt3配体基因的克隆及其在CHO细胞中的表达

目的 克隆人Flt3配体(Flt3 LIg and,FL),并在CHO细胞中进行表达.方法 从健康人外周血中提取总RNA,通过RT-PCR技术,扩增Flt3配体胞外区cDNA功能性片段,经DNA测序证实后,将得到的片段基因插入pcDNA3.0表达载体,构建了pcDNA3.0-FL真核表达载体;将重组质粒pcDNA3.0-FL转染CHO细胞,经G418筛选出阳性细胞克隆,扩大培养,提取细胞总蛋白,用SDS-PAGE分离并Western blotting检测到在相对分子质量约24 000处有一显色条带.结果 FL胞外区cDNA被正确克隆到真核表达载体pcDNA3.0中并在CHO细胞中成功表达.结论 成功构建了真核表达载体pcDNA3.0-FL并在CHO细胞中成功表达,为FL的相关研究和应用开发奠定了基础.     

鼠血管抑素Angiostating真核表达载体的构建及在人胃癌细胞中的表达

目的：构建鼠源性血管抑素agniostatin cDNA真核表达载体,转梁人胃癌细胞株SCG7901,检测蛋白表达,方法：采用定向克隆构建鼠源性血管抑素angiostatin cDNA真核表达载体pcDNA3.1( )-angiostatin,酶切鉴定和测序,彩用脂质体基因转染人胃癌细胞株SCG7901,G418抗性筛选,Western blot检测血管抑素的表达,结果：酶切鉴定和测序证明成功构建了基因序列正确的血管抑素直核表达载体,经G418筛选和Western blot检测得到表达血管抑素的细胞株,结论：真核表达载体pcDNA3.1( )-angilstatin转导的人胃癌细胞肥够表达血管抑素蛋白,在胃癌的血管抑制基因治疗中有潜在临床应用价值。     

带c-Myc标签的Mdfic基因真核表达载体构建及其在成肌细胞中的表达

目的 构建新型转录因子Mdfic和c-Myc标签融合表达的真核表达载体pcDNA3.1-Mdfic-Myc,实现其在成肌细胞C2C12中的表达.方法 PCR方法扩增Mdfic的开放阅读框,酶切后的PCR扩增产物和退火后的人工合成的c-Myc标签共同克隆至pcDNA3.1(+)真核表达载体中,构建pcDNA3.1-Mdfic-Myc融合表达质粒.重组质粒经过PCR、双酶切和测序鉴定后,脂质体法转染C2C12细胞.RT-PCR和Western blotting方法检测转染后细胞中Mdfic-Myc的表达.结果 成功构建了peDNA-Mdfic-Myc真核表达质粒;RT-PCR和Western blotting结果表明,Mdfic-Myc融合蛋白在成肌细胞C2C12中获得高效表达.结论 pcDNA3.1-Mdfic-Myc融合表达质粒的成功构建及其在成肌细胞中的表达为进一步体外研究Mdfic蛋白单独的功能及其与其他分子间功能性相互作用奠定了基础.     

ret基因真核表达载体的构建及其瞬时表达

目的:构建ret基因真核表达载体pcDNA3.0-RET,为制作转基因动物提供实验基础.方法:利用HandⅢ及NotⅠ限制性核酸内切酶,消化pSK-RET及pcDNA3.0空质粒,获得目的基因及相应载体;通过T4连接酶重组DNA;通过氨苄青霉素(Amp)抗性、酶切鉴定及DNA序列分析,确定阳性克隆.通过脂质体包裹转染NIH3T3细胞,采用Western blot方法检测载体的瞬时表达状况.结果:Amp抗性筛选阳性;酶切片段电泳分析在5 400 bp及3 300 bp处有明显条带;DNA序列分析提示重组基因与实际序列一致;Western blot结果显示175 000处有明显条带.结论:ret基因真核表达载体pcDNA3.0-RET构建成功,并可瞬时表达.     

小鼠真核表达质粒pcDNA3.1(+)-FGFR1的构建及表达

目的:通过基因重组技术构建真核表达质粒pcDNA3.1(+)-FGFR1,并检测其在CHO细胞中的表达。方法:通过PCR扩增FGFR1的全段基因cDNA,应用基因工程技术将扩增的基因片段插入pcDNA3.1(+)真核表达质粒,经限制内切酶酶切分析及测序鉴定正确后,用脂质体包裹转染CHO细胞,Western blot检测FGFR1目的蛋白的表达。结果:经酶切和测序鉴定证实本实验构建的重组表达质粒正确,该质粒在体外转染CHO细胞后可表达FGFR1目的蛋白。结论:成功构建的pcDNA3.1(+)-FGFR1重组质粒能在体外表达FGFR1目的蛋白。     

HL7702-HBX与HepG2-HBX细胞株的建立及鉴定

目的建立稳定、高效的HBx蛋白体外表达细胞株。以便进一步研究HBX基因和HBx蛋白的致癌作用及机理。方法建立HBX真核表达载体pcDNA3．1-HBX,通过脂质体介导将pcDNA3．1-HBX转染到人正常肝细胞株HL7702及人肝肿瘤细胞株HepG2中。结果RT-PCR、蛋白质印迹及免疫荧光的实验结果显示,HBX基因在人正常肝细胞株HL7702及人肝肿瘤细胞株HepG2中得到了表达。结论成功构建了表达HBx蛋白的HL7702-HBX与HepG2-HBX细胞株,为进一步研究HBX基因和HBx蛋白的致癌作用及机制奠定了实验基础。     

Rap2c基因真核表达质粒的构建与表达

目的：为了探讨Rap2c基因与肺癌发生的关系,克隆人Ras家族小G蛋白Rap2c的cDNA,构建其真核表达质粒并在人肺癌细胞株A549和H1299中表达。方法人骨肉瘤细胞株U2OS提取细胞总RNA,经逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）逆转录成cDNA,PCR扩增Rap2c,酶切后插入pcDNA3．1（＋）构建真核表达质粒 pcD-NA3．1（＋）-Rap2c,采用酶切及测序鉴定。重组质粒转染A 549和H 1299细胞,Western blot 检测其目的基因表达。结果双酶切及测序结果显示重组质粒pcDNA3．1（＋）-Rap2c成功构建,Werstern blot 检测到 A549和H 1299细胞有相应蛋白表达。结论成功构建人Rap2c基因真核表达质粒,为后续研究奠定了基础。     

人pcDNA3.1-TPX2真核表达载体的构建与表达

目的:构建TPX2的真核表达载体pcDNA3.1-TPX2,并观察其在食管癌EC9706细胞中的表达。方法:在pQE-70-TPX2原核表达载体基础上,根据GenBank上提供的TPX2基因序列及测序结果,采用Primer Premier 5.0软件设计扩增TPX2基因编码区的引物序列,经HindⅢ和BamHⅠ双酶切,与真核表达载体pcDNA3.1连接后转化感受态大肠杆菌JM109,并进行酶切分析和序列测定。将构建的质粒pcDNA3.1-TPX2体外转染EC9706细胞,进行稳定筛选。用Western blot鉴定基因的表达。结果:DNA测序和BLAST比对表明克隆的人TPX2基因序列正确,进一步酶切分析显示,成功构建了真核表达载体pcDNA3.1-TPX2,并在EC9706细胞中获得稳定表达。结论:TPX2基因真核表达载体的成功构建为后续研究TPX2基因在肿瘤细胞中的功能奠定了基础。     

登革2型病毒NGC株NS1基因部分序列pcDNA3.1载体的构建

目的：克隆登革2型病毒NGC株NS1基因部分序列,构建NS1基因部分序列的真核表达载体。方法：用PCR技术扩增登革2型病毒NGC株NS1基因部分序列,并定向克隆入pcDNA3.1（＋）的kpnⅠ、xhoⅠ位点,构建真核重组载体pcDNA3.1（＋）-NS1,转化EcoliDH5a。阳性重组质粒用PCR、酶切及序列测定等方法鉴定。电穿孔法将真核重组载体转染COS-7细胞,RT-PCR鉴定其表达情况。结果：阳性质粒经kpnⅠ及xhoⅠ双酶切及PCR获得了1个核苷酸长度为413 bp的基因,序列测定证实与NGC株NS1基因部分基因序列有99%同源,重组真核质粒转染COS-7细胞经RT-PCR鉴定证实有表达。结论：成功构建了含有登革2型病毒NGC株NS1基因部分序列基因的真核重组载体pcDNA3.1（＋）-NS1。     

小鼠CD25分子胞外段的真核表达载体的构建

目的构建小鼠CD25分子胞外段的真核表达载体,并在CHO细胞中进行表达。方法从前期构建的原核表达载体PET-32a-CD25胞外段上酶切下CD25胞外段;将其亚克隆入真核表达载体peDNA3．1,并进行酶切及测序鉴定;用Lipofeetamine2000将pcDNA3．1-CD25胞外段转染中国仓鼠卵巢细胞（Chinese Hamster Ovary,crio）进行表达,并用ELISA法对表达产物进行测定。结果酶切、测序验证成功构建真核表达载体pcDNA3．1-CD25e,并在CHO细胞中有效表达CD25e蛋白。结论成功构建小鼠CD25胞外段的真核表达载体,可在CH10细胞中表达,并具有良好的免疫反应性,为后续实验提供了前期基础。     

血管内皮细胞生长因子在哺乳动物细胞的表达

目的：本实验试图构建具有生物学活性的ＶＥＧＦ真核表达载体,为ＶＥＧＦ基因治疗提供载体。方法：将已获得的ｈＶＥＧＦ１６５ ｃＤＮＡ克隆到ＧＳＴ融合表达载体,构建原核表达质粒,转染大肠杆菌ＤＨ５α,ＩＰＴＧ诱导表达,Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ鉴定表达产物。在此基础上构建真核表达载体ｐｃＤＮＡ３ ／ｈＶＥＧＦ１６５,脂质体介导转染ＣＨＯ－Ｋ１细胞,Ｇ－４１８筛选,Ｎｏｒｔｈｅｒｎ ｂｌｏｔ,Ｗｅｓｔ－ｅｒｎ ｂｌｏｔ分别检测其在细胞内的转录和表达情况,３Ｈ－ＴｄＲ掺入法检测表达蛋白的活性。结果：实验组的Ｎｏｒｔｈｅｒｎ ｂｌｏｔ和Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ出现特异性条带,而对照组在相应部位未出现条带。实验组的大鼠心肌血管内皮细胞３Ｈ－ＴｄＲ掺入率明显高于对照组（Ｐ＜ ０．００１）。结论：本实验所构建的ＶＥＧＦ真核表达质粒能够在真核细胞内获得表达,其表达产物具有血管内皮细胞增殖刺激活性。     

哺乳动物细胞CDK3系列表达载体的构建与表达

目的：构建一系列细胞周期蛋白依赖激酶3（CDK3）在哺乳动物细胞的表达载体,并在真核细胞NIH3T3中进行初步表达。方法：从食管癌细胞中提取总RNA,RT-PCR扩增CDK3编码区,然后将PCR产物克隆到T载体;扩增后的CDK3片段分别亚克隆入pcDNA3-4、pNTAP和pEGFP等4种哺乳动物表达载体;将获得的表达载体转染小鼠成纤维细胞NIH3T3,并用蛋白免疫印迹法进行初步的CDK3表达分析。结果：PCR扩增获得约900 bp目的片段,经T载体克隆和DNA序列分析显示重组片段是人CDK3基因序列,全长915 bp;CDK3目的片段分别亚克隆入pcDNA3-4、pNTAP和pEGFP载体,获得相应表达载体;运用构建的表达载体,可以在真核细胞中表达出CDK3蛋白。结论：成功构建了CDK3系列哺乳动物细胞表达载体,并在NIH3T3中得到表达。     

重组人半乳糖苷结合凝集素-9质粒的构建及表达

目的构建人半乳糖苷结合凝集素-9(Galectin-9)的真核表达质粒pGalectin-9,并检测其表达。方法通过DNA重组技术和PCR方法从人外周血单个核细胞克隆Galectin-9基因,插入真核表达质粒pcDNA3.1(+)中,通过PCR、酶切及测序鉴定重组载体的正确性;采用脂质体转染技术将重组质粒pGalectin-9瞬时转染中国仓鼠卵巢(Chinesehamster ovary,CHO)细胞,通过Western blot、RT-PCR和间接免疫荧光方法检测Galectin-9的表达。结果 DNA测序和酶切鉴定证明Galectin-9基因正确克隆至pcDNA3.1(+)的多克隆位点;以重组质粒pGalectin-9瞬时转染CHO细胞,通过Western blot、RT-PCR和间接免疫荧光方法,在分子和细胞水平证实Galectin-9的表达。结论成功构建pGa-lectin-9的重组质粒,并证实其在CHO细胞中可以成功表达。