HBV C区基因克隆和PCR条件优化

目的 建立PCR优化条件和方法,探讨HBV C区基因在乙型肝炎PCR检测中的应用价值,为荧光定量PCR检测HBV摸索条件.方法 将HBV基因组导入DH5α大肠杆菌,SDS碱裂解法小量提取大肠杆菌阳性构建质粒DNA,设计合适引物对HBV C区基因进行PCR扩增,对PCR条件中的退火温度、Mg2＋浓度进行了优化,并比较三种不同Taq DNA聚合酶的灵敏度.结果 转化的大肠杆菌质粒DNA最佳退火温度为58℃,最佳Mg2＋浓度为1.5mM,同时确定天源公司的Biostar Taq DNA聚合酶灵敏度最高,扩增到10-6.结论 确立了HBV C区PCR的优化条件,将为后期进行荧光定量PCR检测HBV感染奠定基础以及为探索更有效的检测方法提供实验依据.     

不同混合方法比较聚合酶链反应(PCR)效果的研究

目的比较不同方法下的聚合酶链反应对PCR扩增的影响。方法对124例晚期乳腺癌外周血标本的CyclinD1基因进行PCR扩增。在加入DNA模板前分别用离心法和微型旋涡混合器振荡法混合PCR反应液,分装各管后加DNA模板进行扩增、电泳。结果用微型离心机离心PCR反应液后仍扩增不出或极少能扩出PCR产物,其阳性率为11.3%,且易污染;而用微型旋涡混合器振荡法混合PCR反应液后,PCR产物扩增良好(阳性率达99.2%),且不易污染。结论微型旋涡振荡法混合PCR反应液法能在减少污染的同时大大提高PCR阳性率,是一种切实可行的基因扩增方法。     

天麻ITS序列的聚合酶链反应扩增

目的:为天麻核糖体DNA中的内转录间隔区(internal transcribed spacer ,ITS)序列分析提供可靠、特异的聚合酶链反应(PCR)条件.方法:选择ITS序列通用引物对天麻ITS序列进行PCR扩增,对一系列PCR条件参数进行摸索,同时对PCR产物进行纯化后直接测序.结果:天麻ITS序列PCR扩增产物约为750 bp,不同来源样本存在有一定的差异.经测序后与Genebank中相关序列比对,天麻ITS序列总长度为598 bp,其中ITS1为235 bp,ITS2为209 bp,5.8S为154 bp,G C(%)为52%.结论:扩增天麻ITS序列的PCR反应条件可以得到可靠、特异的结果.     

用Nested聚合酶链反应检测嗜肺军团菌的实验研究

用Nested聚合酶链反应(Nested PCR)法检测嗜肺军团菌种。Nested PCR法所用的两对寡核苷酸引物按编码24kDa嗜肺军团菌表面抗原的基团片段序列设计的。用此两对引物对实验的军团菌种和非军团菌种细菌DNA进行扩增，只有嗜肺军团菌种DNA披扩增，而其他军团菌种和非军团菌属细菌没有被扩增。第1步和第2步PCR分别检测到最小量为10pg和10fg的靶DNA。对不同量的嗜肺军团菌配制成的痰标本进行检测，能检测到0．1cfu／ml的嗜肺军团菌，只需12h。这些结果显示Nested PCR法检测嗜肺军团菌特异性强，敏感性高。此方法为从临床标本和环境材料中早期、快速检测到嗜肺军团菌提供了有救的工具。     

红鲫Sox基因的聚合酶链反应扩增

目的 克隆雌雄红鲫Sox基因.方法 采用聚合酶链反应以特异扩增人SRY基因HMG-box保守区的一对引物以及扩增雌雄红鲫Sox基因(SRY-box gene).结果 雌雄红鲫个体均扩增出与人SRY基因大小相同的片断,大小约为220 bp.结论 红鲫Sox基因大小约为220 bp,且雌雄个体间无性别特异性.     

浙江西南野生金银花种质资源的特性研究

目的 研究浙江西南地区野生金银花种质资源的形态性状、有效成分及遗传特性,为金银花种质资源的开发利用及遗传育种提供依据。方法 采用形态性状调查、HPLC检测及ITS序列分析揭示野生金银花种质的特性。结果 浙江西南地区的6个野生金银花种质在形态性状上差异较小,通过ITS序列分析表明它们之间亲缘关系非常相近,能够与忍冬属其他植物明显区分。6个野生种质与栽培品种之间形态差异和有效成分量差异较大,其中有性状优良的野生种质,如产自浙江省景宁县（ZJJN1）与浙江省青田县（ZJQT）的样品,其绿原酸量分别为1.94%和2.42%,达到《中国药典》2010年版标准。结论 研究野生金银花种质的优良特性,对浙江西南地区野生金银花资源的开发及优良栽培品种的选育具有重要的现实意义。     

PCR-RFLP检测Apo CⅢ基因T-455C多态性的反应条件优化

目的：探讨聚合酶链反应-限制性片段长度多态性（PCR—RFLP）反应体系中各种成分的优化,建立检测载脂蛋白CⅢ（ApoCⅢ）T-455C多态性的方法。方法：采用PCR—RFLP检测ApoCⅢ基因T-455C多态性,同时通过对参与反应体系的成分,在一定范围内设置不同的浓度或参数组,进行正交试验和单因素逐项试验,观测各成分在不同条件下对结果的影响。结果：ApoCⅢ基因检测到3种基因型。PCR反应体系中不同模板含量、引物浓度、TaqDNA聚合酶用量、dNTP浓度、Mg^2＋浓度、退火温度和酶切体系中PCR产物量、内切酶量、酶切时间等对反应结果均有不同程度的影响。结论：该研究建立的PCR—RFLP体系检测Apo CⅢ基因T-455C多态性技术,是一种高效快速、简单敏感、准确可靠的分析方法,适合常规实验室开展。     

基于ITS序列对独活17个种的分子鉴定

目的 通过对17个种共26个独活样本的ITS序列分析,为国内中药市场上的常见独活的分子鉴定提供依据,并探索其科学分类标准。方法 对26个样本的ITS进行PCR扩增和测序。通过MEGA 5.0软件比较各序列间的差异性,计算K2P遗传距离;采用邻接法构建NJ系统树并应用Network 4.2.0.1软件进行中间连接网法分析构建单倍型网状图。结果 NJ系统树和单倍型网状图显示,26个样本聚集为5大类群,综合分析后将17种独活归为4大类;重齿毛当归Angelica pubescens的ITS序列具有特征碱基片段,可明显区别于其他样本;除牛尾独活类中3个样本不能通过ITS序列鉴定到种以外,其他样本均可以通过ITS序列鉴定到种。结论 ITS序列可为药用独活的鉴定和分类提供有力证据,四带芹类可以作为独活的首选替补品,牛尾独活类其次,九眼独活为最后之选。     

6种成药中原料药材金银花的分子鉴别研究

目的：研究位点特异性PCR方法在中成药鉴定方面的应用。方法：本实验选用6种含有金银花原料药材的中成药为研究对象,采用改良CTAB法提取其总DNA,并使用DNA纯化试剂盒进行纯化;通过聚合酶链式反应（polymerase chain reaction,PCR）对trnL-trnF叶绿体序列进行扩增,将扩增产物进行不同浓度稀释;以稀释后样品作为模板,分别选择金银花特异性鉴别引物进行扩增,并将扩增后的产物进行测序。所得序列校正、比对后,进行Blast N比对分析。结果：连翘败毒丸、梔子金花丸、牛黄清宫丸、金噪散结丸、健脑补肾丸、金噪开音丸6种中成药中均含有原料药材金银花。结论：采用位点特异PCR方法鉴定中成药中原料药材具有一定的可行性。     

聚合酶链反应检测实验动物弓形虫核酸的研究

建立弓形虫动物模型，常规方法提取肝、脾、肾、肺等组织DNA，应用聚合酶链反应（PCR）扩增，产物经电泳检测显示199bp的弓形虫特异带谱。并以γ－32p标记克隆的弓形虫特异DNA片段为探针，对扩增产物行Southern印迹分析，结果上述4种标本均出现阳性杂交带，进一步证实扩增条带是弓形虫特异DNA顺序。同时用酶标法检测显示鼠血清弓形虫抗体IgG；阳性。组织病理学检查结果，肝组织损伤较严重，肝细胞肿大，肝窦消失，脾、肾、肺组织可见轻微的病理改变。另外本文介绍一种简单PCR方法[1]，取鼠尾静脉血2μl直接进行扩增，结果与酚-氯仿法提取的DNA扩增结果一致。     

忍冬藤与其伪品金银忍冬藤、连翘茎的鉴别研究

目的:对忍冬藤与其伪品金银忍冬藤、连翘茎进行比较和鉴别。方法:按生药学常规方法对忍冬藤、金银忍冬藤及连翘茎在基源、性状、显微方面进行比较和鉴别。结果:忍冬藤、金银忍冬藤及连翘茎在基源、性状及显微特征方面均存在一定差异。结论:性状鉴别和显微鉴别方法简便、可靠,为保证忍冬藤药材质量提供了有效的鉴别方法。     

金银花的文献出处及相关药用名称药用部位考证

现今临床所用金银花,单指植物忍冬的花,而非茎、叶、藤枝或全草.早期的“忍冬”、“忍冬藤”等名称,并非专指忍冬花部,少数早期文献如《新修本草》等虽有关于植物忍冬花部的简要记述,但主要是作为植物辨识特征对开花时间和花朵形状进行的描述,并未提及花部入药,且无“金银花”之名,不能作为现今中药金银花的原始出处.首次出现“金银花”药名的文献应为宋《苏沈良方》,首次记载单以忍冬之花入药的文献为宋《外科精要》.第九版《中药学》教材、《中华本草》等认为中药金银花出自《新修本草》或《履巉岩本草》的结论,与文献记载不符,应予更正.     

金银花中绿原酸和木犀草苷的薄层色谱鉴别方法研究

目的 建立金银花中绿原酸和木犀草苷的薄层色谱鉴别方法.方法 参照〈中国药典〉2010年版一部附录Ⅵ B试验TLC法,分别考察供试品样品的制备,展开剂的选择,以及显色方法.结果 以水为溶剂热回流提取制备试验样品,以乙酸乙酯-丙酮-甲酸-水（7∶3∶1∶1.2）为展开剂,分别喷以5%的三氯化铝乙醇溶液,至紫外光灯（365 nm）下观察鉴定木犀草苷.喷以1%三氯化铁试液与1%铁氰化钾试液（1∶1）混合溶液的上清液,显色鉴定绿原酸.结论 所建立的方法简便可行,重现性好,可用于金银花中绿原酸和木犀草苷的鉴定.     

8个不同种质忍冬叶中绿原酸含量测定

目的:以绿原酸的含量为指标,评价不同种质忍冬叶的质量,为忍冬种质的划分和忍冬叶的开发应用提供理论依据。方法:采用高效液相色谱法。结果:8个种质忍冬叶绿原酸含量为0.79%~2.43%。结论:不同种质忍冬叶中绿原酸含量存在差异。其中含量达到《中国药典》中金银花标准的有24,32,34三个种质,含量在1%以上的有19,21,27,36四个种质,种质17叶片中绿原酸含量最低。     

大孔吸附树脂分离纯化金银花中总有机酸的研究

目的研究大孔吸附树脂富集、纯化金银花中总有机酸的工艺条件参数。方法以静态饱和吸附量、静态洗脱率为考察指标,比较了6种大孔吸附树脂分离、纯化金银花总有机酸的工艺。以总有机酸收率和质量分数为指标,对最佳树脂吸附工艺条件进行了筛选。结果在考察的6种树脂中,HPD100型树脂具有最佳的吸附及洗脱参数。结论本实验所筛选出的HPD100型树脂综合性能较好,适于金银花总有机酸的分离纯化。     

不同树龄忍冬的生长与药材质量关系研究

目的 研究忍冬个体生长与药材质量的关系。方法 调查忍冬不同树龄的形态指标，分析花蕾中绿原酸的含量的变化动态。结果 金银花药材的质量与其忍冬树龄关系密切。不同树龄忍冬，萌发新枝能力与花蕾生长不同，其质量差异较大。综合产量和绿原酸含量的因素，金银花药材以忍冬树龄9～15年较好。结论 保证金银花优质、高产的关键技术是：随树龄增长，适时调整密度，在GAP基地建设中，对不同树龄植株要分类管理。本研究对人工栽培多年生药材的研究与管理具有指导意义。     

mRNA差异显示技术筛选何首乌中二苯乙烯苷合成相关基因

【目的】筛选和克隆何首乌中二苯乙烯苷代谢相关酶基因。【方法】采用mRNA差异显示技术,对何首乌中二苯乙烯苷含量差异悬殊的不同组织(根、茎、叶)进行差异表达基因的筛选,将得到的差异基因连接pMD19-T载体进行测序后,通过数据库比对预测其基因功能。【结果】发现差异片段51条,选取其中9条进行半定量PCR验证,获得3条阳性差异片段。其中1条阳性片段为何首乌茎和叶特异表达,与甘氨酸脱氢酶高度同源,另外2条阳性片段为何首乌块根特异表达,分别与烯酰辅酶A水合酶、氨基肽酶N高度同源。【结论】通过mRNA差异显示技术得到的3个同源序列可为进一步研究何首乌中二苯乙烯苷生物合成途径提供帮助。     

忍冬藤的化学成分研究

目的为寻找忍冬藤生物活性成分,对其进行了系统的化学分离。方法采用溶剂萃取、色谱分离手段进行分离纯化,根据波谱数据进行了化合物结构鉴定。结果 3个化合物分别鉴定为木犀草素(Ⅰ)、马钱素(Ⅱ)、r-1-(4-羟基-3-甲氧基苯基)-反-2,顺-3-二羟甲基-7,8-二羟基-6-甲氧基-1,2,3,4-四氢萘(Ⅲ)。结论化合物Ⅲ为一新化合物,命名为忍冬醇(japenol)。