胚胎干细胞诱导生成的胰岛素分泌细胞的超微结构研究

我们对体外诱导生成的胰岛素分泌细胞的超微结构进行了研究,并将其与在体胰岛素分泌细胞的结构加以比较,以期为诱导生成胰岛素分泌细胞的成功提供证据。     

人脂肪间充质干细胞体外诱导为肝脏样细胞的试验研究

目的 探讨人脂肪间充质干细胞体外分离、培养、鉴定及向肝脏样细胞分化的方法.方法 采用胶原酶Ⅰ消化离心法获得人脂肪间充质干细胞(human adipose-derived mesenchymal stem cells,hADSCs),原代培养并采用流式细胞仪检测干细胞相关表面抗原白细胞分化抗原13(Cluster differentiation13,CD13)、CD73、CD34、CD45和人类白细胞DR抗原(human leukocyte antigen DR,HLA-DR)的表达,采用诱导培养基将hADSCs向成脂及成骨方向诱导.采用两阶段细胞因子诱导法诱导hADSCs,并观察其形态变化;采用实时聚合酶链式反应(real-time polymerase chain reaction,RT-PCR)法及细胞免疫组化法检测肝细胞相关基因甲胎蛋白(alpha fetoprotein,AFP)、细胞角蛋白18抗体(cytokeratin18,CK18)、细胞角蛋白19抗体(cytokeratin19,CK19)等在肝脏样细胞中的表达;采用糖元染色法(Periodic acid-Schiff stain,PAS)检测肝脏样细胞糖原合成情况.结果 用消化离心法获取的hADSCs大小均匀,呈梭形的成纤维细胞样,体外能长期培养存活,并保持不分化状态;流式细胞仪检测显示hADSCs高表达CD13、CD73,低表达CD34、CD45及HLA-DR;hADSCs体外可被诱导成脂肪细胞及成骨细胞.hADSCs经成肝诱导后,细胞形态由梭形变为多角形的肝脏样细胞,这些肝脏样细胞高表达血清白蛋白(serum albumin,ALB)、AFP、CY3P4等基因,并表达肝细胞相关性蛋白HepPa r-1、AFP、CK18、CK19.PAS染色显示肝脏样细胞胞质呈红色表现.结论 利用消化离心法在体外成功构建了人原代脂肪干细胞系,可长期存活,反复传代,经诱导后可转化为有功能的肝脏样细胞,为脂肪间充质干细胞作为生物人工肝及肝组织工程的种子细胞提供理论依据.     

体外诱导骨髓间充质干细胞分化为胰岛素分泌细胞的方法学研究进展

骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)由于取材容易,增殖能力强,具有多向分化潜能,且免疫原性弱,移植后无致瘤性,有望成为体外诱导分化成胰岛细胞的首选种子细胞,为细胞移植治疗糖尿病提供较好的干细胞来源.近年来,国内外对于体外诱导BMSCs分化为胰岛素分泌细胞(insulin-producing cells,IPCs)治疗糖尿病的研究已取得一定进展.许多研究者尝试利用各种不同的方法,使BMSCs定向分化为IPCs.目前,体外诱导BMSCs分化为IPCs趋于寻找快速、高效的方法以获取足够量的胰岛素.本文就体外诱导BMSCs分化为IPCs的方法学研究进展作一综述.     

脂肪分泌物对脂肪间充质干细胞的诱导研究

目的研究脂肪分泌物对脂肪间充质干细胞(ADSCs)的诱导作用,探讨脂肪再生机制。方法利用组织块贴壁法和细胞流式技术分离、鉴定ADSCs,收集含有脂肪分泌物的培养基(CM)作为条件培养基并用来诱导ADSCs(CM诱导组),化学培养基诱导组作为阳性对照组,用普通培养基组作为空白对照组,通过细胞形态学观察脂滴的形成和Real-time PCR技术在基因水平上对其可靠性进行体外验证。用可溶性明胶海绵作为ADSCs的支架来研究脂肪分泌物在体内对ADSCs的诱导作用,并作HE切片观察。结果流式细胞术证实所培养的细胞为ADSCs。在体外实验中,CM诱导4d时,CM诱导组中的ADSCs胞浆内出现了明显的脂滴,Real-time PCR显示,与空白对照组比较,相关的成脂基因mRNA表达量也明显增加(P<0.05);体内实验HE染色结果可以观察到CM诱导组中有明显的血管化生成。结论脂肪组织分泌物中可能含有能诱导ADSCs分化形成成熟脂肪细胞以及血管化的目标因子。     

人脂肪基质细胞向胰岛素分泌细胞的分化诱导

目的:体外分离培养人脂肪来源基质细胞（hADSCs）,并定向诱导hADSCs向胰岛样细胞分化,探讨hADSCs分化为胰岛素分泌细胞的潜能。方法:从脂肪抽吸物中分离hADSCs,利用碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、上皮细胞生长因子(EGF)、尼克酰胺和exendin-4等因子诱导hADSCs向胰岛样细胞分化。采用RT-PCR检测诱导前后胰岛素、胰十二指肠同源性盒因子(Pdx-1)、葡萄糖转运因子2(Glut-2)和胰高血糖素(glucagon)基因的表达;双硫腙染色鉴定胰岛样细胞团;免疫荧光染色检测诱导后细胞胰岛素和Pdx-1的表达;ELISA检测诱导后细胞在低糖和高糖环境中胰岛素的分泌量。结果:诱导7 d左右细胞由长梭形逐渐变成多边形,并且细胞开始呈岛状聚集,21 d左右形成胰岛样细胞团。双硫腙染色阳性;RT-PCR显示,诱导后细胞表达胰岛素、Pdx-1、Glut-2和glucagon基因;免疫细胞化学显示,诱导后细胞表达胰岛素和Pdx-1;葡萄糖刺激实验显示胰岛素的释放,并且随着葡萄糖浓度增加胰岛素的释放量也增加。结论:体外hADSCs具有分化为胰岛素分泌细胞的潜能,为将来应用于临床移植治疗糖尿病奠定了基础。     

人骨髓间充质干细胞诱导分化为汗腺细胞的实验研究

目的：研究人骨髓间充质干细胞（hMSCs）在体外诱导分化为人汗腺细胞（hSGCs）。方法：体外分别分离培养hMSCs和hSGCs,原代培养hSGCs融合后,收集细胞,制备汗腺细胞匀浆,用含10%汗腺细胞匀浆的汗腺培养基来诱导培养hMSCs。1周后,检测诱导培养的hMSCs的抗原表达。结果：培养的hSGCs表达CK19和CEA;hMSCs表达CD44、105,不表达CK19、CD34和CEA。诱导培养1周,免疫细胞化学染色示诱导培养组少量细胞表达CEA和CK19,而对照组未见CEA和CK19阳性细胞;流式细胞仪检测CEA在诱导培养组的阳性表达率约为（6.2±1.2）%,对照组（0.9%±0.0）%（P〈0.05）。结论：在无完整汗腺细胞存在的情况下,hMSCs在体外也可诱导分化为hSGCs。     

诱导的人骨髓间充质干细胞在裸鼠体内生成软骨的实验研究

目的 探讨利用组织工程方法，将人骨髓间充质干细胞(MSCs)在体外诱导、培养后，再造软骨组织的可能性。方法 从胸外科手术所获得的肋骨骨髓腔中分离得到人MSCs，经无血清培养基诱导培养为软骨细胞，接种于支架材料上，埋植于裸鼠体内。6周后取材进行大体及组织学观察。结果 大体观察见裸鼠皮下形成包块，触之有韧性；组织学观察可见有大量软骨细胞成堆形成。但尚有部分未降解的支架材料残留。结论 人MSCs在体外经定向诱导后成为软骨细胞，与支架材料复合物可在裸鼠体内形成软骨组织；人MSCs可能成为组织工程软骨的“种子细胞”。     

诱导的人骨髓间充质干细胞在裸鼠体内生成软骨的实验研究

目的探讨利用组织工程方法,将人骨髓间充质干细胞(MSCs)在体外诱导、培养后,再造软骨组织的可能性。方法从胸外科手术所获得的肋骨骨髓腔中分离得到人MSCs,经无血清培养基诱导培养为软骨细胞,接种于支架材料上,埋植于裸鼠体内,6周后取材进行大体及组织学观察。结果大体观察见裸鼠皮下形成包块,触之有韧性;组织学观察可见有大量软骨细胞成堆形成,但尚有部分未降解的支架材料残留。结论人MSCs在体外经定向诱导后成为软骨细胞,与支架材料复合物可在裸鼠体内形成软骨组织;人MSCs可能成为组织工程软骨的“种子细胞”。     

体外分步诱导人母体来源胎盘间充质细胞分化为胰岛素分泌细胞

目的 建立体外诱导人母体来源胎盘间充质细胞分化为胰岛素分泌细胞的分步诱导分化体系.方法 分离纯化人母体来源胎盘间充质细胞,体外扩增后进行分步诱导分化,收获的胰岛素分泌细胞分别行免疫细胞化学和ELISA检测,并通过葡萄糖刺激的胰岛素释放试验(GSIS)评价其体外功能.结果 分离纯化的人母体来源胎盘间充质细胞经培养及六步诱导分化后最终可形成胰岛素分泌细胞.免疫细胞化学检测诱导后细胞GLP-1、PDX-1和C-Peptide染色为阳性,ELISA结果显示该诱导细胞培养上清中胰岛素有较高的表达.诱导后的胰岛素分泌细胞在低糖和高糖刺激下的胰岛素释放量分别为(20.42±1.58)μIU/mL和(65.1±7.43)μI-U/mL(P ＜0.01).结论 通过建立体外人母体来源胎盘间充质细胞分化为胰岛素分泌细胞的分步诱导分化体系,获得具有一定胰岛素分泌能力的细胞,为胰岛移植的细胞来源提供了更有效的新途径.     

人外周血间充质干细胞向肝样细胞诱导分化的实验研究

目的 探讨人外周血来源间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)的体外分离、培养及诱导分化成有功能肝样细胞的可行性.方法 静脉采集13例成人外周血,分别应用单纯密度梯度离心法及人间充质干细胞富集试剂+密度梯度离心两步法分离MSCs;将得到的MSCs经贴壁纯化扩增,以流式细胞仪检测细胞表面抗原后,经肝细胞生长因子(HGF)、成纤维细胞生长因子-4(FGF-4)及抑瘤素M(OSM)诱导分化成肝样细胞;以RT-PCR、免疫荧光染色及Western blot检测所得细胞中白蛋白(ALB)、甲胎蛋白(AFP)在基因及蛋白水平上的表达情况;电镜检测所得细胞的超微结构.结果 外周血应用单纯密度梯度离心法无法培养得到MSCs.人间充质干细胞富集试剂+密度梯度离心两步法可分离并培养获得梭形细胞,经细胞表面抗原检测证实为MSCs;所得细胞经过纯化扩增和诱导分化后,RT-PCR、免疫荧光及Western blot均证实细胞在基因及蛋白水平上存在ALB和AFP的表达;电镜证实其具有类肝细胞的超微结构.结论 人外周血中存在MSCs并可使用非侵袭性的人间充质干细胞富集试剂+密度梯度离心两步法方法提取分离,所得MSCs具诱导分化成有功能肝样细胞的能力,此方法能够为以后的肝组织工程研究提供种子细胞来源.     

人脂肪间充质干细胞与软骨细胞接触式共培养的实验研究

目的探讨接触式细胞共培养条件下,人软骨细胞对脂肪间充质干细胞的诱导分化效应。方法用4,6-联脒-2-苯基吲哚(PKH26)荧光标记脂肪间充质干细胞,与软骨细胞进行接触式细胞共培养,细胞比例为1:1,单独培养的脂肪间充质干细胞为对照组。共培养2周后,应用流式细胞仪分选荧光标记阳性的脂肪间充质干细胞,提取细胞总RNA,采用Real-Time PCR检测Ⅱ型胶原和蛋白多糖基因的相对表达改变。结果成功分离提取脂肪间充质干细胞;Real-timePCR检测结果显示,共培养组脂肪间充质干细胞Ⅱ型胶原和蛋白多糖基因相对表达较对照组显著增加(P0.05),蛋白多糖上调307倍,Ⅱ型胶原上调584倍。结论与软骨细胞接触式共培养后,人脂肪间充质干细胞能够被诱导分化为软骨细胞。     

人脐带血间充质干细胞诱导肝样细胞研究进展

间充质干细胞是来源于中胚层的具有高度自我更新能力和多向分化潜能的成体干细胞，研究发现人脐带血中含有间充质干细胞，在一定的条件下能向肝细胞定向分化。通过对其减轻肝损害，促进肝细胞再生的研究，给肝病患者的治疗带来新的思路和方法。     

胚胎干细胞诱导分化为胰岛素分泌细胞的实验研究进展

1型和部分2型糖尿病患者必须补充胰岛素 ,但外源性胰岛素注射治疗易产生血糖波动 ,发生低血糖等严重并发症 ,而且依从性差。胰岛细胞移植有望重建内源性胰岛素分泌系统 ,根据机体需要稳定血糖水平 ,具有安全、方便等优点。但目前人类胰岛移植的成功率比较低 ,胰岛细胞来源匮乏和移植免疫排斥两大难题是目前胰岛移植失败的主要原因 [1]。诱导胚胎干细胞向胰岛素分泌细胞分化的实验研究有望为临床移植治疗糖尿病提供崭新的供体细胞获取方法。本文将对此方面进展作一概述。胚胎干细胞是一种从囊胚内层细胞团或胚胎生殖嵴分离出来的全能干细胞 ,…     

人脂肪间充质干细胞体外分化为视网膜细胞观察

目的:研究成人脂肪间充质干细胞(hAD-MSC)体外诱导分化为视网膜色素上皮细胞(RPE)、光感受器细胞和血管内皮细胞的情况.方法:分离、培养和鉴定hAD-MSC,用血管内皮生长因子和成纤维细胞生长因子诱导hAD-MSC向血管内皮细胞分化,并检测血管内皮细胞标志物血管内皮细胞Ⅷ因子(vWF)的表达情况.制备hAD-MSC体外诱导液,用诱导剂和诱导液共同诱导hAD-MSC向视网膜细胞分化,采用免疫荧光法检测hAD-MSC经诱导后表达光感受器细胞标志物视紫红质(Rhodopsin)和RPE细胞标志细胞角蛋白(Pan-CK)的表达情况.结果:免疫荧光法证实,分离培养的hAD-MSC经体外诱导后可表达RPE、光感受器细胞和血管内皮细胞的标志Pan-CK、Rhodopsin和vWF.结论:hAD-MSC经过体外诱导可以向视网膜RPE、光感受器细胞和血管内皮细胞分化.     

人脐带间充质干细胞辅助的异种脂肪移植的实验研究

目的：探讨脐带间充质干细胞在体内辅助游离移植脂肪组织的可行性。方法：组织块法培养人脐带间充质干细胞,与大鼠脂肪混合移植至大鼠背部皮下,对照组未添加细胞单纯脂肪移植。移植后6个月取材,通过组织观察、HE染色及免疫组化进行分析。结果：组织块法可获取脐带间充质干细胞,组织移植6个月后取材,实验组与对照组在体积及重量上差异无统计学意义。 HE染色两组也未见差异,免疫组化可见特异性对抗人GAPDH反应阳性细胞存在。结论：以异种脐带间充质干细胞辅助游离移植脂肪组织与单纯脂肪移植无差异,脐带间充质干细胞辅助游离移植脂肪组织有待进一步研究。     

诱导人骨髓间充质干细胞向软骨细胞分化的实验研究

目的 探讨人骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells，MSCs)向软骨细胞诱导分化的能力。方法 选用不同代次的MSCs，使用条件培养基，观察细胞的形态变化，同时采用细胞化学和免疫组化的方法检测糖胺多糖的分泌和Ⅱ型胶原的表达。结果 MSCs在转化生长因子-β1、维生素C的作用下，7天后可见细胞多变为圆形或随圆形，糖胺多糖和Ⅱ型胶原染色阳性，表现出软骨细胞的分化特点。结论 在一定培养条件下成功诱导人MSCs向软骨细胞分化。MSCs作为骨组织工程学方面的种子细胞具有潜在的应用价值。     

人骨髓间充质干细胞诱导分化为内皮细胞的实验研究

目的探讨将人骨髓间充质干细胞(HBMCs)诱导为内皮细胞(ECs)的可行性。方法将HBMCs分离、培养后,加入诱导因子定向诱导为ECs,并对细胞进行鉴定。结果经鉴定,HBMCs在特定环境下分化为了ECs。结论以HBMCs诱导的ECs作为种子细胞,具有可行性。     

骨髓间充质干细胞旁分泌效应的实验研究

目的 研究~(60)Co γ射线对骨髓间充质干细胞(MSC)旁分泌效应的影响,评价MSC培养上清液对大鼠心肌梗死后心脏形态、结构及功能的影响,并初步探讨其作用机制.方法 MSC行不同剂量~(60)Co γ射线照射,收集各组照射前及照射后第1次换液的培养液,ELISA法检测上清液中血管内皮生长因子(VEGF)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、白细胞介素-1β(IL-1β)的含量.建立大鼠急性心梗模型并行心肌内和体内注射培养上清液或培养基,术后4周检测心脏大小和功能变化、并比较微血管密度的差异.结果 MSC旁分泌能力受射线照射后明显下降,与照射剂量呈正相关.上清液组(B组)较对照组(A组)和培养基组(C组)术后心功能改善、心脏缩小.术后左心室舒张末期内径(LVDd):A组(8.1±1.5)mm、B组(7.0±1.5)mm、C组(7.7±1.1)mm;术后射血分数EF:A组43.8%±8.9%、B组51.5%±7.8%、C组45.6%±8.1%,微血管计数值增加,B组10.8±2.9,C组5.7±0.7,A组6.6±0.6.结论 ~(60)Co γ射线照射会降低MSC的旁分泌能力,MSC的旁分泌效应对改善急性心梗后的心功能起到重要作用,其作用机制很复杂,促新生血管形成是其中重要的环节.     

间充质干细胞旁分泌物质诱导肝星状细胞凋亡的体外研究

目的:研究间充质干细胞(mesenchymal stem cell,MSC)旁分泌物质对活化的肝星状细胞Lx－2的影响及作用机制?方法:应用6孔塑料细胞培养板,每孔使用半透膜,构建Transwell共培养体系;将骨髓来源的间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cell,BM－MSC)和人肝星状细胞系Lx－2分别接种在体系的上下层,并把此组作为实验组,单独培养的Lx－2作为对照组,观察培养液中MSC旁分泌物质对Lx－2的影响?采用流式细胞术及Hoechst33342染色法分别检测Lx－2细胞凋亡的情况,qRT－PCR和Western blot检测Lx－2中解耦联蛋白2(uncoupling protein 2,UCP2)的mRNA和蛋白水平的表达量,荧光探针法检测Lx－2细胞内及线粒体中活性氧(reactive oxygen species,ROS)的荧光强度,采用硫代巴比妥酸(thiobarbituric acid,TBA)法检测细胞丙二醛(malondialdehyde,MDA)的含量?结果:与对照组相比,Hoechst 33342染色后可见部分Lx－2染色质固缩?颗粒状荧光等凋亡细胞典型表现,实验组Lx－2凋亡率是对照组的2.6倍(P < 0.05)?实验组Lx－2中UCP2 mRNA及蛋白表达量显著低于对照组(P < 0.05);实验组Lx－2细胞内和线粒体中ROS水平明显升高?细胞培养上清中MDA为(0.43 ± 0.47) mmol/L,显著高于对照组(0.16 ± 0.43)mmol/L(P < 0.05)?结论:MSC旁分泌物质有诱导Lx－2细胞凋亡的作用;可能与MSC旁分泌物质抑制UCP2的表达,促进细胞内及线粒体ROS过量生成有关?