干细胞诱导分化为视网膜色素上皮细胞的途径探讨

近年来,干细胞在眼科领域的研究及应用受到高度关注,胚胎干细胞(ES)、成体干细胞能够被定向诱导分化成视网膜色素上皮细胞,由此可获得转分化的大量的视网膜色素上皮细胞源,通过体内干细胞及视网膜色素上皮细胞移植有望应用于各种视网膜退行性疾病的细胞替代治疗。本文就各种干细胞诱导分化为视网膜色素上皮细胞的途径及应用进行探讨。     

胚胎干细胞诱导分化视网膜细胞的方法新进展

视网膜变性疾病是引起视力丧失的重要原因,由于这类眼病的病因不明确、发病机制复杂,目前尚无有效的治疗方法.近年来,干细胞研究领域取得了突破性进展,干细胞具有分化为机体所有细胞的潜能,可以利用胚胎干细胞(ESCs)分化出各种视网膜细胞,这为视网膜变性疾病的治疗带来了新的曙光.ESCs治疗视网膜变性疾病至关重要的一步是将ESCs分化为视网膜光感受器细胞和视网膜色素上皮(RPE)样细胞.本文对自发诱导培养法、共培养法、细胞因子诱导法、单层贴壁诱导培养法和3D诱导培养法等ESCs分化为视网膜光感受器细胞和RPE细胞方法的最新进展进行综述.     

视网膜色素上皮细胞的诱导分化及其移植治疗方法的研究进展

视网膜色素上皮(retinal pigment epithelium,RPE)的病变可以导致多种视网膜疾病,目前缺乏有效的治疗手段.人类多能干细胞具有多向分化潜能,为此类疾病的细胞治疗提供了理想来源.本文将近年来胚胎干细胞和诱导多能干细胞体外定向分化为RPE细胞及移植治疗年龄相关性黄斑变性等视网膜疾病的研究进行了综述.     

视网膜色素上皮细胞的诱导分化及其移植治疗方法的研究进展

视网膜色素上皮(retinal pigment epithelium,RPE)的病变可以导致多种视网膜疾病,目前缺乏有效的治疗手段.人类多能干细胞具有多向分化潜能,为此类疾病的细胞治疗提供了理想来源.本文将近年来胚胎干细胞和诱导多能干细胞体外定向分化为RPE细胞及移植治疗年龄相关性黄斑变性等视网膜疾病的研究进行了综述.     

胚胎干细胞向角膜上皮细胞诱导分化的研究进展

胚胎干细胞（ESCs）是一种具有多向分化潜能的细胞,在一定条件诱导下能分化为骨细胞、软骨细胞、肌细胞、血管内皮细胞和神经细胞,在眼表的修复和重建方面具有广阔的应用前景.目前,大量研究已证实,ESCs可以被定向诱导分化为角膜上皮样细胞,并且对眼表损伤的修复也有重要作用.ESCs作为组织工程角膜的种子细胞仍存在一些问题需要解决,如定向分化机制不明确、细胞大量扩增可能存在致瘤问题等.就ESCs向角膜上皮细胞分化的研究进展进行综述.     

小分子化合物在干细胞诱导分化为视网膜色素上皮细胞中的应用

视网膜色素上皮细胞的变性、坏死将导致患者的视力丧失。由于视网膜色素上皮细胞不能再生,移植健康的视网膜色素上皮细胞已成为视网膜变性性疾病最具有前景的治疗策略。随着化学、分子生物学和再生医学的发展,人们发现越来越多的小分子化合物通过调控某些特定的信号通路,能够操纵干细胞的分化方向。本文主要对小分子化合物在体外诱导干细胞定向分化为视网膜色素上皮细胞的应用作一综述。     

视网膜色素上皮细胞诱导骨髓间充质干细胞分化为神经样细胞

目的:检测视网膜色素上皮细胞对骨髓间充质干细胞分化的调节作用。方法:体外培养人骨髓间充质干细胞(BMSC)和视网膜色素上皮(RPE)细胞。RPE细胞采用紫外线照射处理,而后与CFSE标记的BMSC共培养14d。并在共培养体系中加入牛眼视网膜提取物(BRE)以研究视网膜成分对此分化过程的影响。采用NSE,Nestin和GFAP抗体标记检测BMSC分化前后的表达特征。结果:BMSC在与RPE细胞共培养后,能够分化成为神经样细胞,并表达神经性细胞的特异性标记NSE,Nestin和GFAP。BRE能够显著促进共培养体系中BMSC向神经样细胞的分化。结论:RPE和BRE能够诱导BMSC分化为神经样细胞。     

视网膜色素上皮细胞诱导骨髓间充质干细胞分化为神经样细胞

目的：检测视网膜色素上皮细胞对骨髓间充质干细胞分化的调节作用。方法：体外培养人骨髓间充质干细胞（BMSC）和视网膜色素上皮（RPE）细胞。RPE细胞采用紫外线照射处理,而后与CFSE标记的BMSC共培养14d。并在共培养体系中加入牛眼视网膜提取物（BRE）以研究视网膜成分对此分化过程的影响。采用NSE,Nestin和GFAP抗体标记检测BMSC分化前后的表达特征。结果：BMSC在与RPE细胞共培养后,能够分化成为神经样细胞,并表达神经性细胞的特异性标记NSE．Nestin和GFAP。BRE能够显著促进共培养体系中BMSC向神经样细胞的分化。结论：RPE和BRE能够诱导BMSC分化为神经样细胞。     

体外培养人胚胎来源视网膜干细胞的诱导分化

目的 探讨培养的人胚胎来源视网膜干细胞向视网膜终末细胞分化的可能性。方法 来自16～20周人胚胎的视网膜干细胞进行无血清体外培养,并分别进行有血清条件下体外诱导和用含视网膜色素上皮的眼杯模拟体内条件诱导的观察,采用免疫荧光法检测干细胞和视网膜终末细胞表面抗原的表达,采用实时荧光定量PCR法检测诱导前后细胞nestin基因在mRNA水平的表达差异。结果 从人胚胎视网膜神经感觉层分离出的视网膜干细胞,在体外诱导的条件下,可表达视网膜终末细胞标记PKCα、GFAP、Thy1,少数细胞表达nestin和MAP2;在模拟体内环境诱导后,则不仅表达上述细胞标记,而且rhodopsin和syntaxin表达阳性。实时荧光定量PcR法检测显示：诱导后细胞nestin基因表达量较诱导前细胞明显降低。结论 RPE可以促进体外培养的视网膜干细胞向视杆细胞和无长突细胞分化。(中华眼科杂志,2004,40：448-452)     

一例视网膜色素变性患者接受胚胎视网膜色素上皮细胞移植后的视力变化

目的：报告常染色体显性遗传的视网膜色素变性患者，经过片状的胚胎神经视网膜连同色素上皮细胞移植后，主观和客观的视力改善。     

胚胎千细胞诱导分化为视网膜祖细胞的体外研究

目的 探讨小鼠胚胎干细胞(mouse embryonic stem cell,mESC)诱导为视网膜祖细(retinal progenitor cells,RPC)的体外培养方法,为致盲性视网膜变性疾病的治疗提供种子细胞.方法 用细胞免疫荧光染色法和流式细胞术对mESC进行mESC标记物阶段特异性胚胎抗原1、细胞增殖核抗原Ki67、细胞周期和碱性磷酸酶进行鉴定后,在无血清条件下悬浮培养形成拟胚体(embryoid bodies,EB)并添加抑制因子1、左右决定因子A和γ-促分泌酶抑制剂等诱导分化为RPC,并对其分化的细胞进行标记物兔来源配对盒基因6(paired box6,Pax6)、兔来源性别决定区Y框蛋白(Sox2)和鼠来源转录因子同源异型框蛋白(orthodentical homeobox2,Otx2)的检测以及增殖能力和细胞周期的检测.结果 mESC标记物碱性磷酸酶阳性表达,特异性胚胎抗原1阳性率为(80.66±0.64)％,Ki67和细胞周期检测显示有较高增殖能力.定向诱导分化后,RPC标记物Pax6、Sox2和Otx2阳性率分别为(50.87±2.97)％、(49.10±2.60)％和(32.01±3.87)％,Ki67和细胞周期检测均显示诱导后的RPC具有一定的增殖能力.结论 在特定的细胞因子作用下,mESC可以诱导分化为RPC.     

苯丙氨酸促进人胚胎干细胞向视网膜色素上皮细胞高效分化的研究

目的 观察苯丙氨酸对胚胎干细胞(ESC)向视网膜色素上皮(RPE)细胞定向分化诱导效率的影响.方法 H1人ESC(hESC)分为对照组和实验组,以mTeSR培养基常规培养.细胞克隆过度融合后对照组以撤除碱性成纤维细胞生长因子、含10％ knockout血清替代物的培养基诱导hESC自主分化至第7周.实验组从第3周开始在诱导培养基中添加0.2 mmol/L苯丙氨酸培养至第7周.观察两组细胞形态学变化;实时荧光定量聚合酶链反应(RT-PCR)检测人类配对盒基因6(Pax6)、小眼球相关转录因子(MITF)、RPE65、酪氨酸酶(tyrosinase)、Wnt配体(Wnt3a)、淋巴样增强因子-1(Lef1)、转录因子7(Tcf7)基因mRNA的表达;蛋白免疫印迹法(Western blot)检测MITF、RPE65蛋白的表达;流式细胞技术(FCM)检测RPE65阳性细胞比例.Sprague Dawley大鼠12只,随机分为对照组和治疗组;单眼内路法视网膜下腔注射,对照组注射2 μl 1倍磷酸盐缓冲液,治疗组注射2 μl纯化的hESC-RPE.治疗后6周行视网膜电图(ERG)检查,观察暗适应3.0 a-b波振幅.结果 诱导分化第7周,实验组出现大量肉眼可见的色素团块,明显多于对照组.色素化区域内可见多边形蜂窝状排列的单层细胞,胞质充满色素颗粒.RT-PCR检测结果显示,实验组Pax6、MITF、RPE65、tyrosinase(t=39.44、26.14、31.28、77.24)、Wnt3a、Lef1、Tcf7(t=46.11、27.69、17.42)mRNA表达量高于对照组,差异有统计学意义(P＜0.01).Western blot检测结果显示,实验组MITF、RPE65蛋白表达量高于对照组.FCM检测结果显示,实验组、对照组RPE65阳性比例分为(18.91±1.76)％、(0.88±0.09)％;实验组RPE65阳性比较明显高于对照组,差异有统计学意义(P＜0.01).ERG检查结果显示,治疗组大鼠暗适应3.0 a-b波振幅较对照组显著提高,差异有统计学意义(t=7.543,P＜0.01).结论 苯丙氨酸显著提高hESC向RPE定向诱导效率.hESC诱导来源的RPE细胞视网膜下移植能改善视网膜变性模型动物视功能.     

Electrical estimulation of retinal pigment epithelial cells

We investigated and characterized the effect of externally applied electric fields (EF) on retinal pigment epithelial (RPE) cells by exposing primary cultures of human RPE cells (hRPE) and those from the ARPE19 immortalized cell line to various strengths of EF (EF-treated cells) or to no EF (control cells) under different conditions including presence or absence of serum and gelatin and following wounding. We evaluated changes in RPE cell behavior in response to EF by using a computer based image capture and analysis system (Metamorph). We found that RPE cells responded to externally applied EFs by preferential orientation perpendicular to the EF vector, directed migration towards the anode, and faster translocation rate than control, untreated cells. These responses were voltage-dependent. Responses were observed even at low voltages, of 50-300 mV. Furthermore, the migration of hRPE cell sheets generated by wounding of confluent monolayers of cells at early and late confluence could be manipulated by the application of EF, with directed migration towards the anode observed at both sides of the wounded hRPE. In conclusion, RPE cell behaviour can be controlled by an externally applied EF. The potential for externally applied EF to be used as a therapeutic strategy in the management of selected retinal diseases warrants further investigation.     

Differentiation of human bone marrow-derived mesenchymal stem cells into neural-like cells by co-culture with retinal pigmented epithelial cells

AIM: To detect the differentiation effects of retinal cells or extracts on bone marrow-derived mesenchymal stem cells (BMSC). · METHODS: Human fetal BMSC were previously labelled by carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE), and co-cultured with retinal pigment epithelial (RPE) cells which were pre-treated with ultraviolet irradiation at a ratio of 1:1 to induce the differentiation of BMSC for up to 14 days. In some assays, a retinal extract of bovine retinal extract (BRE) was added to detect the potential effects of retinal component on the differentiation of BMSC. In addition, Neuron-specific enolase (NSE), Nestin and Glial fibrillary acidic protein (GFAP) immunostaining were performed to determine the characteristics of BMSC. · RESULTS: The results indicated that by co-cultured with RPE cells, fetal BMSC were differentiated into neural-like cells expressing special neuronal markers Nestin, GFAP and NSE. And the expression of these markers was obviously increased by BRE. · CONCLUSION: Retina derived cells and extracts can induce the differentiation of BMSC into neural-like cells.     

视网膜色素上皮细胞在增生性玻璃体视网膜病变中的作用

增生性玻璃体视网膜病变(proliferative vitreoretinopathy,PVR)是在炎症和免疫功能细胞及多种活化因子对眼内细胞修复反应的调控过程中,由于过度促进细胞增殖、移行以及由细胞介导的胶原收缩而形成的。参与PVR的细胞目前已知的有5种,其中视网膜色素上皮(retinal pigment epithelium,RPE)细胞是最主要的,本文将影响RPE细胞功能的各种影响因素及PVR的治疗进展作一综述。     

人胚胎干细胞来源的视网膜色素上皮细胞超微结构观察方法的优化

背景 视网膜色素上皮(RPE)细胞的正常超微结构是其执行正常生理功能的解剖基础,目前用透射电子显微镜(TEM)检测RPE细胞的超微结构时常用细胞沉淀法,但经过胰蛋白酶消化的细胞会破坏原有的细胞生长状态,无法真实地反映出体外培养的RPE细胞的超微结构. 目的 探索一种能够简单、真实地反映体外培养的入胚胎干细胞(hESC)来源的RPE细胞超微结构的方法. 方法 将hESC经自然分化法诱导为hESC来源的RPE(hESC-RPE)细胞,采用免疫荧光法检测hESC-RPE细胞特异性蛋白小眼畸形相关转录因子(MITF)和人类配对盒基因6(PAX6)的表达.将hESC-RPE细胞种植于Transwell小室上进行培养,待细胞形成细胞片后通过TEM进行超微结构的观察,并与细胞沉淀法制备的hESC-RPE细胞标本的超微结构和90日龄Long Evans大鼠体内RPE细胞的超微结构进行比较. 结果 hESC-RPE细胞MITF和PAX6表达阳性.TEM下可见大鼠体内RPE细胞正常的超微结构,包括顶端微绒毛、极性分布的RPE细胞色素颗粒和细胞核、细胞基底膜和细胞间紧密连接.细胞片法TEM下可见Transwell小室上细胞片中hESC-RPE细胞形成了类似于大鼠体内RPE细胞的超微结构,但细胞顶端微绒毛较短,而细胞沉淀法观察到hESC-RPE细胞的细胞质中散在分布的色素颗粒、非极性的细胞核和少量的微绒毛.结论 TEM观察细胞超微结构时细胞片法不经过细胞的消化过程,保留了hESC-RPE细胞的正常结构,能简单、真实地反映体外培养RPE细胞的超微结构.