重组蔗糖异构酶在短短芽孢杆菌中的表达及发酵优化

对重组菌株Brevibacillus choshinensis/pNCMO2-SI摇瓶发酵产蔗糖异构酶进行研究,进一步探讨了3 L发酵罐不同发酵条件对菌体生长及产酶的影响。结果表明,摇瓶发酵后胞外酶活为50 U/mL,最优3 L发酵罐培养条件为:初始碳源为葡萄糖质量浓度10 g/L,初始氮源为多聚蛋白胨、牛肉浸膏质量浓度各15 g/L,发酵温度30℃,溶氧30%,在此条件下得到的最高酶活为275 U/mL。为了探索启动子对蔗糖异构酶表达的影响,分别选取来源于枯草芽孢杆菌的启动子Papr-E,Pnpr-E,Pamy以及来源于巨大芽孢杆菌的启动子Pxyl进行研究。结果表明,使用启动子Papr-E的表达量最高。进一步优化摇瓶发酵条件,重组菌株BCpNapr-SI摇瓶发酵的胞外上清酶活为137 U/mL,在此条件下进行3 L发酵罐发酵,最终发酵上清胞外酶活为485.5 U/mL,是未优化启动子的1.76倍。     

重组普鲁兰酶在枯草芽孢杆菌中的高效表达

普鲁兰酶可特异性地水解支链淀粉得到直链淀粉,因而在淀粉加工过程中具有重要的应用。本研究从Bacillus naganoensis ATCC53909基因组中克隆了普鲁兰酶基因pul,并克隆到大肠杆菌-枯草芽孢杆菌穿梭载体p BE中,构建表达载体p BE-pul。在此基础上,将来源于枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌以及解淀粉芽孢杆菌中的17个高表达基因的启动子分别克隆到表达载体p BE-pul中,并转化至Bacillus subtilis ATCC6051?10,成功构建了十七株含有不同启动子介导普鲁兰酶分泌表达的重组菌株。对重组菌株的分泌表达比较发现,启动子P43和Pspov G介导的普鲁兰酶活性明显优于其他启动子,其中Pspov G介导的普鲁兰酶活性更高。同时,还使用了启动子Pspov G介导N端的108个氨基酸缺失的pul324突变体进行分泌表达。通过对17种启动子的比较和两个普鲁兰酶基因的比较,本研究构建的一株重组菌株的普鲁兰酶的表达更为高效,其活性高达389.85 U/mL,后者显著高于现有的相关报道。     

地衣芽孢杆菌TS-01 胞外多糖功能的研究

对地衣芽孢杆菌TS-01胞外多糖的清除自由基能力、增强免疫活性、抑制致病菌能力等进行了研究,发现50%醇提多糖和70%醇提多糖均对DPPH·自由基有清除作用,且随多糖浓度升高而增强。在适当的添加剂量下,两种胞外多糖对T、B淋巴细胞转化有增强作用。两种胞外多糖对致病菌都不产生抑菌圈,但能够降低致病菌的繁殖速度。     

一株产胞外多糖枯草芽孢杆菌发酵条件的优化

多糖是广泛存在于动物、植物、微生物中的生物高分子聚合物,因其具有多种多样的生物活性及功能,并且安全无毒,近年来成为研究与开发的热点。本文对实验室保藏的一株产胞外多糖枯草芽孢杆菌进行了初步研究。通过单因素试验及正交试验得到枯草芽孢杆菌产胞外多糖(Exopolysaccharide)的最优发酵条件。结果表明:发酵温度为37℃,摇瓶培养转速为160r/min,接种量为3%,发酵时间为36h,在优化后的条件下胞外多糖的产量最大可达到4.135g/L,产量提高了2.87%。     

响应面法优化枯草芽孢杆菌产胞外多糖培养基

从酒药中分离筛选出一株产胞外多糖枯草芽孢杆菌（Bacillussp.）。以胞外多糖的产量为指标,通过响应分析法对细菌胞外多糖产生的发酵培养基进行了初步研究。首先利用单因子实验对培养基中不同成分及添加量进行优化,然后在此基础上利用Box-Behnken中心组合实验设计对影响胞外多糖产量的因素进行优化分析,从而获得最适产胞外多糖的培养基组成。研究结果表明,枯草芽孢杆菌产胞外多糖最佳培养基组成为（g/L）:蔗糖25.449、蛋白胨15.229、柠檬酸三钠2.971、牛肉膏3.0、硫酸镁1.0,在此条件下枯草芽孢杆菌胞外多糖的产量为3.554g/L。      

胶质芽孢杆菌胞外多糖的制备及流变学特性

以实验室保藏的胶质芽孢杆菌SM-01为研究对象,研究了其胞外多糖(EPS)在5 L发酵罐中的发酵过程及制备方法,并对EPS溶液的流变学特性进行了研究,主要分析了质量浓度、剪切速率、剪切时间、温度、pH、无机盐、外加多糖等对其黏度的影响。结果表明,发酵液中EPS的最大产量为23.46 g/L,经离心、醇沉、冷冻干燥后EPS的回收率为76.7%;EPS溶液是典型的非牛顿流体;溶液黏度随着质量浓度的增加而快速增大;25～100℃范围内EPS黏度变化不大;EPS溶液黏度受pH影响较大,其黏度值在pH 7时达到最大,pH>12时溶液成弱凝胶状;加入NaCl、KCl、MgCl2、CaCl2等无机盐后溶液黏度显著下降,Fe3+、Pb2+等高价阳离子使EPS沉淀;EPS与海藻酸钠、黄原胶、瓜尔胶、槐豆胶、阿拉伯胶均有协效性。     

通过串联启动子实现纳豆激酶在枯草芽孢杆菌中的高效表达

本研究通过串联启动子方式实现纳豆激酶在枯草芽孢杆菌WB800中的高效分泌表达。通过对几种现有报道的强启动子的比较并对其进行串联操作,确定生产纳豆激酶的最优启动子及纳豆激酶的最高产量。本研究首先在枯草芽孢杆菌WB800中成功构建五种含不同强启动子的重组质粒p SG101(P_(HpaII)),p SG102(PBcapr E),p SG103(Plux S),p SG104(Pgsi B)和p SG105(Pyxi E),实现纳豆激酶分泌表达,并对其纤溶活性进行测定。结果表明,启动子P_(HpaII)介导的纳豆激酶纤溶活性(110.80 FU/m L)明显优于其他四种启动子。通过对启动子P_(HpaII)进行多次串联,成功构建质粒p SG106(P_(HpaII)-P_(HpaII)),p SG107(P_(HpaII)-P_(HpaII)-P_(HpaII))和p SG108(P_(HpaII)-P_(HpaII)-P_(HpaII)-P_(HpaII))。数据显示,菌株Bacillus subtilis WB800/p SG107(P_(HpaII)-P_(HpaII)-P_(HpaII))纳豆激酶产量最高为213.30 FU/m L,相比单个启动子P_(HpaII),提高了92.51%。通过对五种强启动子的比较以及对其进行串联操作,成功实现纳豆激酶在枯草芽孢杆菌WB800的高效表达,纤溶活性最高为213.30 FU/m L,与现有相关报道相比有明显优势。     

多粘类芽孢杆菌PS04胞外多糖分子结构研究

采用丙烯葡聚糖凝胶S-200 HR对PS04多糖进行过滤层析,得到单一组分峰,且通过凝胶渗透色谱法分析测定,可知该多糖重均分子量为4009ku,峰位分子量为3174ku,分布宽度指数为1.348;结合红外光谱、高效液相色谱及核磁共振分析,确定该多糖由果糖与葡萄糖以7∶1的比例组成,在多糖结构中,果糖残基以呋喃环构型存在,且以β-2,6、β-1,2键连接,因PS04多糖与果聚糖最为接近,可初步判断该多糖是一种果聚糖。      

多粘类芽孢杆菌PS04胞外多糖分子结构研究

采用丙烯葡聚糖凝胶S-200 HR对PS04多糖进行过滤层析,得到单一组分峰,且通过凝胶渗透色谱法分析测定,可知该多糖重均分子量为4009ku,峰位分子量为3174ku,分布宽度指数为1.348;结合红外光谱、高效液相色谱及核磁共振分析,确定该多糖由果糖与葡萄糖以7∶1的比例组成,在多糖结构中,果糖残基以呋喃环构型存在,且以β-2,6、β-1,2键连接,因PS04多糖与果聚糖最为接近,可初步判断该多糖是一种果聚糖。     

枯草芽孢杆菌胞外多糖的快速测定与发酵条件优化

枯草芽孢杆菌B1⑥菌株能产生大量胞外多糖,并且,随着多糖含量的提高,发酵液黏性也随之增加,而测定多糖黏度比测定多糖的含量方法简便、快速,对于生产实践具有一定的指导意义。通过实验,建立了多糖含量与发酵上清液黏度的关系模型,结果显示胞外多糖含量与发酵上清液黏度在一定程度上呈正相关性。应用该模型于胞外多糖发酵条件的优化,筛选出了培养基的最佳碳源、氮源及C/N。经过4因素3水平的正交实验,筛选出的最优发酵方案是:蔗糖3%,硫酸铵1%,(C/N=3/1),Mg-SO4 0.05%,Na2HPO4 0.2%,NaH2PO4 0.1%,CaCl2 0.1%,MnSO4 0￣0.1%,接种量10%￣12%,pH7￣7.5。同时检验了该模型的实用性,测量黏度简单方便,一定程度上可以指导生产实践。     

耐盐芽孢杆菌R1高效壳聚糖酶异源表达及特性分析

采用同源克隆获得耐盐芽孢杆菌壳聚糖酶基因,并异源表达制备重组耐盐芽孢杆菌壳聚糖酶（CsnBh46）,通过表征分析获得重组CsnBh46酶学特性。重组CsnBh46全长278个氨基酸,三维结构显示其分为上下两个半球,包含9个α螺旋和2个β折叠。在7 L发酵罐中,重组工程菌bh-5的最高酶活力和总蛋白质质量浓度分别为6 375 U/mL和4.3 g/L。纯化后的重组CsnBh46最适反应pH和温度分别为6.0和60 ℃,金属离子Mn²⁺、Ca²⁺和Mg²⁺对重组CsnBh46具有激活作用。重组CsnBh46最适底物为脱乙酰度95%胶体壳聚糖。重组CsnBh46能够高效水解胶体壳聚糖并且根据反应时间可以定向制备不同聚合度壳寡糖。本研究为CsnBh46产业化应用奠定基础。     

枯草芽孢杆菌普鲁兰酶基因的分泌表达及其在粉丝制作中的应用

作者旨在研究枯草芽孢杆菌普鲁兰酶的分泌表达及表达产物的应用性能.枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)168菌株的普鲁兰酶编码基因BsP分别在大肠杆菌(Escherichia coli和枯草芽孢杆菌中进行表达,重组酶在两种宿主中均能利用自身结构分泌到细胞外.重组酶分泌到枯草芽孢杆菌细胞外的产物的酶学性质与积...     

调控乙酰CoA合成酶表达促进乙酸利用及GlcNAc合成

N-乙酰氨基葡萄糖(GlcNAc)是一种重要的功能单糖。在利用枯草芽孢杆菌发酵产GlcNAc的过程中,乙酸的积累严重抑制了细胞生长和GlcNAc合成。为了获得高效利用乙酸生产GlcNAc的微生物细胞工厂,作者通过突变乙酰CoA(Ac-CoA)合成酶编码基因acsA 5′UTR区域内全局转录调控因子CodY结合序列,调控acsA转录水平,进一步突变AcsA乙酰化调控位点,解除乙酰化修饰,促进乙酸转化为Ac-CoA,最终乙酸积累量由6.3 g/L减少到3.6 g/L,同时细胞干重(DCW)由2.7 g/L增加到5.3 g/L,GlcNAc产量由1.9 g/L提高到5.0 g/L,为进一步获得高产GlcNAc细胞工厂提供了基础。     

DeoR家族转录因子PsrB调控黏质沙雷氏菌合成灵菌红素

灵菌红素（prodigiosin,PG）,一种由粘质沙雷氏菌产生的次级代谢产物,因其具有抗细菌、抗疟疾、抗肿瘤和免疫抑制等重要功能而备受关注,然而,对黏质沙雷氏菌合成灵菌红素的调控机制的了解依然有限。作者以黏质沙雷氏菌JNB5-1为出发菌株,通过构建Tn5G转座子插入突变文库,发现并解析了DeoR家族转录调控因子BVG90_04085（PsrB）正调控黏质沙雷氏菌合成灵菌红素的分子机制。结果发现,LB培养基中psrB突变株SK8-61和ΔPsrB产灵菌红素能力仅为出发菌株JNB5-1的0.22倍和0.26倍。RT-qPCR分析菌株JNB5-1及ΔPsrB中pig基因簇的表达水平发现,相比于出发菌株JNB5-1,在psrB缺失突变株ΔPsrB中,灵菌红素合成途径关键基因pigABCDEFGHIJKLMN的表达水平下调了5.81~22.93倍。凝胶阻滞EMSA等实验证实转录因子PsrB可直接与pig基因簇启动子区域结合,表明转录因子PsrB正调控黏质沙雷氏菌合成灵菌红素的分子机制可能为：PsrB与灵菌红素合成基因簇启动子区域直接结合,正向调控pig基因簇的转录水平,进而影响黏质沙雷氏菌合成灵菌红素。最后,发酵培养基中psrB过表达菌株JNB5-1/pXW1906可合成8.61 g/L的灵菌红素,为出发菌株JNB5-1（5.53 g/L）的1.56倍。     

一种快速提取三孢布拉霉基因组的方法

三孢布拉霉负菌是一种重要的β-胡萝卜素和番茄红素工业生产菌株,由于其基因组提取耗时费力,转化子筛选困难,基因编辑工作严重受阻。作者比较了煮沸法、添加NaOH煮沸法、复合酶液（2 g/dL溶壁酶+3 g/dL纤维素酶+3 g/dL蜗牛酶）酶解法、复合酶液酶解后煮沸法等4种处理方法的效果,发现NaOH为影响三孢布拉霉基因组释放的关键因素;对NaOH浓度、煮沸时间及基因组源的选择（上清液或处理后的菌苔）进行了优化,当NaOH浓度不低于20 mmol/L时,所处理样品的上清液均可扩增出目的基因,煮沸时间对基因组的释放无影响;不同浓度NaOH处理条件下基因组的稳定性实验表明,在所测时间（最长至108 h）内,基因组质量浓度（150~350 ng/μL）与纯度（OD₂₆₀/OD₂₈₀ 1.8~2.0）均较高,且随时间的延长无明显下降趋势;以快速提取法与常规提取法获得的基因组为模板进行PCR,两种方法扩增结果无明显差异,后续对PCR产物的测序与酶切实验证明了NaOH处理不会对后续实验产生影响;最后,从扩增同一菌株不同基因和不同丝状真菌ITS两个方面确定了基因组快速提取方法具有一定的普适性。     

脲酶基因挖掘及其在枯草芽孢杆菌中的重组表达

氨基甲酸乙酯（ethyl carbamate,简称EC）是一种存在于黄酒中的潜在致癌物,酶法降解EC及其前体物质尿素因此备受关注。该研究通过基因挖掘获得了解淀粉芽孢杆菌IT-45的脲酶（Ba-urease）基因并在食品级系统枯草芽孢杆菌中实现了表达与应用。通过密码子优化、核糖体结合位点优化重构脲酶基因簇后,酶活力从6.85 U/mL提升至9.01 U/mL;通过调整基因ureC的位置,脲酶活力进一步提升至10.15 U/mL。研究发现,重组脲酶的最适反应温度为37 ℃;最适反应pH范围为6.5~7.0,为中性脲酶。摇瓶发酵的最佳培养条件为：TB培养基、接种体积分数5%、诱导温度28 ℃、Ni²⁺添加量4 mmol/L。在最佳发酵条件下,酶活力达到12.5 U/mL,在酶法降解黄酒中的尿素具有应用前景。     

TAT-SOD在长期保藏的重组毕赤酵母中表达的条件优化

TAT-SOD是TAT蛋白转导结构域与SOD的融合蛋白质。作者以2007年构建的产TAT-SOD重组毕赤酵母菌为出发菌株,通过摇瓶实验研究不同温度、初始pH、诱导剂浓度等因素对蛋白质表达的影响。通过比色分析法测定菌体浓度、超氧阴离子自由基清除法测定酶活、SDS-PAGE分析目的蛋白质TAT-SOD的浓度;并采用定量PCR法分析表达菌株的目的基因的mRNA变化规律,从而研究长期保藏重组毕赤酵母菌株表达TAT-SOD的适合性及其条件优化。研究结果表明,摇瓶发酵的最佳条件下（YPDM培养基,体积分数1.0%诱导剂浓度,诱导温度30.0 ℃,初始pH值7.0）,发酵液上清酶活水平为753 U/mL,是未优化初始酶活水平的5.1倍,其中pH值优化使TAT-SOD表达水平提高到原始值的3.4倍。7.0的初始诱导pH值的mRNA水平是对照组pH 4.0的3.5倍。这些结果说明,长期保藏的重组毕赤酵母菌株仍然适合表达TAT-SOD,发酵条件会对毕赤酵母的TAT-SOD表达造成显著影响,影响表达水平的最主要因素是目的蛋白质的mRNA水平变化。     

维氏气单胞菌来源几丁质酶的克隆表达及应用

丰年虾是一种小型甲壳类动物,孵化后的幼虫是水产动物的优质饵料,残留的卵壳则作为废弃物处理.然而丰年虾卵壳含有丰富的蛋白质和几丁质,具有极大的应用潜力.为了从丰年虾卵壳中制备几丁寡糖,选择了水解产物分布宽泛和含有几丁质结合域的维氏气单胞菌来源的几丁质酶ChiB565,将其在毕赤酵母Pichia pastoris中进行重组...     

植物乳杆菌发酵桑葚酵素工艺优化及质量评价

目的:解决新鲜桑葚难以保存的问题,将新鲜桑葚制成桑葚酵素。方法:以新鲜桑葚汁为原料,植物乳杆菌为生产菌种,总酚含量为评价指标,通过单因素试验结合响应面试验优化了植物乳杆菌桑葚酵素的发酵工艺,并对桑葚酵素的理化、微生物及感官质量指标进行评价。结果:优化后发酵工艺条件为发酵时间40 h、发酵温度32℃、接种量25%,所制得的植物乳杆菌桑葚酵素的总酚含量达(43.48±0.67)μg/mL,是未经发酵的桑葚汁的1.62倍,可溶性固体物含量为5.36%,pH值为4.08±0.01,微生物指标满足国家标准;桑葚酵素呈紫红、色泽均匀,具有浓郁的桑葚果香和发酵的香味、无异味,酸味柔和、风味好,有光泽、无杂质及沉淀。结论:经植物乳杆菌发酵制得桑葚酵素的过程有生物活性物质产生,有利于提高桑葚酵素质量。     

米黑根毛霉甘露聚糖酶的定向进化、高效表达与应用

为提高米黑根毛霉甘露聚糖酶（RmMan5A）对魔芋粉的水解效率,利用定向进化技术对该酶进行分子改造,经两轮筛选获得了一个对甘露聚糖酶催化效率显著提升的突变体（RmMan5AM2）。该突变体的最适pH为7.0,最适温度为65 ℃,较野生型甘露聚糖酶提高了10 ℃。该突变体继承了野生型甘露聚糖酶的高比酶活力,对槐豆胶的比酶活力达10 371.4 U/mg。在最适条件下,该突变体对槐豆胶、魔芋粉和瓜尔胶的催化效率分别提高了37.4%、28.9%和34.4%。进一步将该突变体在毕赤酵母中进行高效表达,经过156 h高密度发酵,发酵液胞外酶活力达176 000 U/mL,是目前产甘露聚糖酶的最高水平。利用该突变体水解魔芋粉成功制备魔芋甘露寡糖,产物主要为聚合度2~6的甘露寡糖（相对峰面积>85%）,总得率为88.5%。该突变体具有优良的酶学性质,对魔芋粉的水解效率显著提升,在魔芋甘露寡糖的酶法制备中具有很大的应用潜力。