TGF-β1和IGF-1共同转染大鼠BMSCs向软骨细胞分化的实验研究

目的 探讨应用TGF-β1和IGF-1基因转染大鼠BMSCs后,目的基因分泌情况及向软骨细胞的分化效果,为构建新型的组织工程软骨种子细胞提供思路. 方法 6周龄健康雄性Wistar大鼠2只,体重约150 g.扩增、提取质粒pcDNA3.1-IGF-1、pcDNA3.1-TGF-β1,酶切、电泳鉴定并测序.采用密度梯度离心法和贴壁分离法,分离、纯化Wistar大鼠BMSCs,倒置相差显微镜观察原代和传代BMSCs形态学改变,免疫荧光法检测细胞表面标志.将TGF-β1和IGF-1基因单独或共转染第3代BMSCs,按转染情况分为5组未转染组(A组)、转染空载体组(B组)、转染TGF-β1组(C组)、转染IGF-1组(D组)、TGF-β1与IGF-1共转染组(E组).对转染后细胞进行筛选,MTT法测定筛选后细胞的增殖活性,RT-PCR和Western blot法检测筛选后细胞的表达. 结果 电泳显示IGF-1和TGF-β1两目的基因条带,基因测序与Gene-Bank cDNA序列相符.大鼠BMSCs原代细胞接种24 h后可见少量贴壁突起细胞,4、5 d开始形成典型的BMSCs簇状增生,9、10 d细胞生长即可达80%～90%融合;传代后细胞形态较均一.免疫荧光法检测BMSCs的CD29、CD44呈阳性反应,CD34、CD45呈阴性反应.转染24 h后有少量细胞死亡,筛选3周后细胞克隆形成,至第4周细胞可传代,多数细胞变成多边形,部分细胞边界不清,呈圆形,核偏位,核周颗粒明显.MTT法测定A、B、C、D、E组细胞在490 nm波长处的吸光度(A)值,分别为0.432±0.038、0.428±0.041、0.664±0.086、0.655 ±0.045和0.833 ±0.103.A、B组与C、D、E组间差异均有统计学意义(P＜0.01),但A、B组以及C、D、E组间差异无统计学意义(P＞0.05).RT-PCR和Westernblot检测目的基因和蛋白的表达量,TGF-β1表达以C组最多,分别为0.925 ±0.0220、124.341 7 ±2.982 0,E组次之,分别为0.771 7±0.012 0、101.766 7±1.241 0(P＜0.01);IGF-1表达以E组最多,分别为1.0200±0.026 0、128.171 7±9.152 0,D组次之,分别为0.465 0 ±0.042 0、111.045 0 ±6.248 0(P＜0.01);Ⅱ型胶原表达以E组最多,分别为0.980 0 ±0.034 0、120.355 0 ±12.550 0,C组次之,分别为0.720 0 ±0.026 0、72.246 7 ±7.364 0(P＜0.01). 结论 通过TGF-β1和IGF-1基因共同转染BMSCs修复软骨缺损是一个较有前景的发展方向,对组织工程软骨应用于临床具有重要意义.     

单纯骨软骨镶嵌成形术与联合组织工程方法治疗急性骨软骨缺损的对比研究

目的 对比研究单纯骨软骨镶嵌成形术与联合组织工程方法 及联合未转染基因的BMSCs-藻酸钙修复急性骨软骨缺损的效果. 方法 对携带hTGF-β,的重组腺病毒转染BMSCs(hTGF-β转染组)、采用携带Lac-Z报告基因的重组腺病毒(Adv-βgal)转染BMSCs(Adv-βgal转染组)及未转染BMSCs(未转染空白对照组)进行Westernblot检测hTGF-β1、Col Ⅱ及Aggrecan表达.将雄性6月龄崇明山羊18只,体重22～25 kg,随机分为A、B、C组(n=6).取B、C组自体骨髓进行BMSCs分离、培养,传至第3代.B组细胞行hTGF-β,重组腺病毒转染.3组动物于双后肢股骨内髁负重区采用骨钻制各直径5 mm、长3 mm的缺损,A组采用自体骨软骨柱修复:B组修复材料同A组,并同时将5 mL转染hTGF-β1的BMSCs藻酸钠混合液注入空隙,加入CaCl2产生凝胶;C组:修复方法 同B组,采用未转染hTGF-β1的自体BMSCs藻酸钠混合液.术后观察山羊一般情况,于术后12周及24周取材,行大体及组织学观察,并参照O'Driscoll,Keeley and Salter组织形态学评分标准进行评分;术后24周行免疫组织化学及透射电镜观察. 结果 转染后5 d,hTGF-β1转染组细胞hTGF-β1、Col Ⅱ及Aggrecan表达均显著强于Adv-βgal转染组及未转染空白对照组.术后动物均存活至实验完成,伤口Ⅰ期愈合.大体观察B组修复组织边界模糊,移植修复区域表面光滑;A、C组软骨间空隙有裂隙存在.组织学观察A组软骨间空隙区纤维软骨样组织修复、纤维组织填充或相邻软骨增生;B组修复软骨细胞排列规律,交界区整合良好;C组软骨间的空隙区见纤维软骨样组织,存在裂隙.各时间点B组组织学评分均高于A、C组,C组高于A组,差异均有统计学意义(P<0.05);B组12周与24周差异有统计学意义(P<0.05).术后24周免疫组织化学示B组软骨间修复组织染色以软骨细胞和陷窝周围明显,A、C组呈淡染.透射电镜观察示B组修复组织可见典犁软骨细胞,A、C组见平行或交错排列的胶原纤维束. 结论 骨软骨镶嵌成形术联合组织工程方法 可解决单纯骨软骨镶嵌成形术残留缺损愈合不良及软骨间整合不良的问题.     

TGF-β3和BMP-7腺病毒共转染兔骨髓间充质干细胞向类髓核细胞分化的研究

【摘要】 目的：探讨利用转基因技术构建的转化生长因子β3（transforming growth factor beta 3,TGF-β3）和骨形态发生蛋白7（bone morphogenetic protein 7,BMP-7）重组腺病毒转染兔骨髓间充质干细胞（bone marrow mesenchyme stem cells,BMSCs）,诱导其向类髓核细胞分化的可行性。方法：将培养获得的BMSCs分成5组,A：空白对照组,B：免疫荧光对照组,C：TGF-β3单独转染组,D：BMP-7单独转染组,E：TGF-β3+BMP-7共转染组。利用转基因技术构建的TGF-β3和BMP-7重组腺病毒对BMSCs进行转染,荧光显微镜观察其转染效率,培养14d后,再以Western-Blot方法检测A、C、D、E组细胞TGF-β3和BMP-7蛋白分泌情况,以Realtime PCR方法检测各组蛋白聚糖（ACAN）、Ⅰ型胶原（Collagen Ⅰ）、Ⅱ型胶原（Collagen Ⅱ）、Ⅹ型胶原（Collagen Ⅹ）、SOX9基因表达水平,明确腺病毒转染后兔骨髓间充质干细胞的分化情况。结果：以TGF-β3和BMP-7重组腺病毒转染兔BMSCs后常规DMEM培养基培养14d,细胞形态出现明显变化,圆形及椭圆形细胞明显增多。Western blot方法检测,共转染组TGF-β3和BMP-7蛋白表达水平明显增高。培养14d时,Realtime PCR检测ACAN、Collagen Ⅰ、Collagen Ⅱ、SOX9基因的表达水平转染组（C、D、E组）较对照组（A、B组）明显升高（P<0.05）,其中Collagen Ⅰ和SOX9表达单独转染组（C、D组）与共转染组（E组）比较差异无显著性（P>0.05）,Collagen Ⅱ表达共转染组较单独转染组明显增高（P<0.05）。TGF-β3单独转染组和共转染组的Collagen Ⅹ基因表达较BMP-7单独转染组和对照组明显降低（P<0.05）。结论：转基因技术重组TGF-β3和BMP-7腺病毒可成功转染兔BMSCs,获得TGF-β3和BMP-7蛋白的表达。TGF-β3和BMP-7腺病毒共转染兔BMSCs后,可有效诱导兔BMSCs向类髓核细胞方向分化。     

不同时期bFGF或副甲状腺激素相关肽对TGF-β1诱导的兔BMSCs向软骨细胞分化的影响

目的探讨bFGF和副甲状腺激素相关肽(parathyroid hormone-related protein,PTHrP)对TGF-β1诱导兔BMSCs向软骨细胞分化的影响。方法 2月龄健康日本大耳白兔3只,雌雄不限,体重1.6～2.1 kg;取兔胫骨骨髓分离培养BMSCs。取第3代细胞行团块状立体培养,并按照不同诱导条件分为TGF-β1组(A组)、TGF-β1/bFGF组(B组)、TGF-β1/21 d bFGF组(C组)、TGF-β1/PTHrP组(D组)、TGF-β1/21d PTHrP组(E组)。于团块状立体培养开始时,各组均加入10 ng/mL TGF-β1;B、D组同时加入10 ng/mL bFGF或10 ng/mL PTHrP;C、E组于培养21 d时对应加入10 ng/mLbFGF或10 ng/mL PTHrP。培养后1、2、3、4、5、6周检测各组BMSCs向软骨细胞分化的标志性基因Ⅰ型胶原(collagentypeⅠ,ColⅠ)、ColⅡ、ColⅩ和基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinases,MMP)13的表达,1、2、3、4、6周检测ALP活性,6周时行1,9二甲基亚甲蓝(1,9-dimethylmethylene blue,DMMB)染色观察细胞外基质分泌情况。结果 RT-PCR检测示,3周后C、E组ColⅠ基因表达呈显著下降趋势,4、5周时A组显著高于C、E组(P<0.05),3～6周A组显著高于B、D组(P<0.05);B、C组3、4周时及D、E组3周时比较,差异有统计学意义(P<0.05)。C、E组3周后ColⅡ、ColⅩ基因表达均逐渐下降,4～6周时显著低于A组(P<0.05);B、D组各时间点两基因表达均未见显著升高,与A组比较差异均有统计学意义(P<0.05)。A组各时间点MMP-13均未见明显表达,3周时B组与A、C组比较差异有统计学意义(P<0.05),D组显著高于A、E组(P<0.05)。随着时间延长A组ALP活性逐渐升高,4周后C、E组显著下降,均低于A组(P<0.05);B、C组间及D、E组间比较,仅在2、3周时差异有统计学意义(P<0.05)。DMMB染色显示6周时A组软骨陷窝明显,其余各组软骨陷窝明显较少。结论 bFGF和PHTrP能通过改变软骨细胞外基质的合成和分解,抑制TGF-β1诱导的兔BMSCs向软骨细胞分化。这种抑制作用不仅通过抑制ColⅩ基因表达而实现,可能还通过抑制其他软骨分化相关蛋白实现。     

联合转染人VEGF165和ANG-1双基因对大鼠骨髓基质干细胞成骨分化的影响

[目的]研究联合转染入血管内皮细胞生长因子165(VEGF165)和血管紧张素-1(ANG-1)双基因对大鼠骨髓基质干细胞(BMSCs)成骨分化潜能的影响.[方法]将本室构建的编码人VEGF165和ANG-1双基因腺病毒质粒pAd-VIA在QBI-293A细胞内进行包装和扩增,获得腺病毒载体pAd-VIA,将其体外转染大鼠BMSCs,应用诱导培养液定向诱导向成骨细胞分化.实验分为4组:A.腺病毒载体pAd-VIA转染BMSCs并诱导组;B.BMSCs诱导组;C.腺病毒载体pAd-VIA转染BMSCs组;D.单纯BMSCs组.通过碱性磷酸酶(ALP)染色和活性的测定、Ⅰ型胶原免疫荧光染色、茜素红染色来评价联合转染双基因对BMSCs成骨分化潜能的影响.[结果]重组腺病毒质粒pAdVIA在QBI-293A细胞内成功包装和扩增,有大量的绿色荧光蛋白表达,体外转染大鼠BMSCs后,A、B组的ALP染色、Ⅰ型胶原免疫荧光染色、茜素红染色为阳性,而C组和D组为阴性.ALP活性表达具有时间相关性,3 d开始表达,7 d到达高峰,在7、14 d,A、B组与C、D组之间ALP表达均具有统计学差异(P＜0.01),A组和B组之间,在各个时间点均无统计学差异(P＞0.05).[结论]腺病毒载体pAd-VIA转染大鼠BMSCs后,未明显影响其体外成骨分化潜能.     

含RGD肽基因导入系统介导TGFβ1基因转染骨髓基质干细胞的瞬时表达与稳定表达

目的评价含RGD肽基因导入系统K16GRGDSPC(简记作K16-RGD)作为新型基因转染载体的可行性,并探讨转化生长因子β1(TGFβ1)基因转染骨髓基质干细胞(BMSCs)的表达能力。方法固相合成法合成K16-RGD。以6μgK16-RGD:2μgpcDNA3-TGFβ1(pTGFβ1)比例转染第三代兔BMSCs,转染72h后通过免疫组织化学染色和图像分析检测TGFβ1的瞬时表达水平;G418筛选2周形成阳性克隆,扩大培养后同法检测TGF-β1的稳定表达水平。通过酶联免疫吸附(ELISA)试剂盒检测TGF-β1的表达分析转染的量效关系和时效关系。结果瞬时转染组免疫组化部分细胞呈强阳性,稳定转染组几乎全部细胞呈强阳性并且持续表达4周以上。图像分析显示瞬时转染组和稳定转染组TGF-β1的表达均比对照组显著增强(P<0·01),且稳定表达组明显高于瞬时表达组(P<0·05)。ELISA法检测量效关系显示,转染体系中K16-RGD(μg)∶pTGFβ1(μg)为3∶1时TGFβ1有最高的表达效率;时效关系显示,稳定转染组TGFβ1的表达比瞬时表达组高(P<0·05)。结论含RGD肽基因导入系统K16-RGD作为基因转染载体是可行的,TGFβ1基因转染BMSCs可有效表达TGFβ1,为下一步利用K16-RGD作为载体构建载TGFβ1基因骨基质材料进行骨缺损修复研究奠定了基础。     

转染核心结合因子a1基因的人骨髓基质干细胞异位成骨的研究

目的观察核心结合因子a1（Cbfa1）基因转染的人骨髓基质干细胞（hBMSCs）复合生物衍生骨支架异位成骨的效果。方法雌性BALB／C裸鼠18只，随机分为三组：转染Cbfa1基因的hBMSCs复合支架组（A组）、未转染细胞复合支架组（B组）和单纯支架组（C组），每组6只。分别将各组人工骨植入裸鼠背部皮下，于术后4、8周行组织学、免疫组织化学和荧光原位杂交等检测。结果Cbfa1基因转染后，可诱导BMSCs骨钙素、Ⅰ型胶原呈阳性表达。体内植入后，A组成骨速度及成骨质量均明显优于其他组；植入细胞及宿主间质细胞呈骨钙素、骨形态发生蛋白-2呈阳性表达；4周时，Y染色体阳性细胞数明显高于B组。结论Cbfa1基因转染BMSCs，能够诱导其向成骨细胞分化、上调骨形态发生蛋白．2基因的表达，并提高移植细胞的生存率，明显促进异位成骨能力。     

自体骨髓间充质干细胞和软骨细胞共培养复合同种异体完全脱蛋白骨修复关节软骨全层缺损的研究

[目的]探讨自体骨髓间充质干细胞(bone m arrow-derived m esenchym al stem cells,BMSCs)与软骨细胞共培养复合同种异体完全脱蛋白骨(fu lly deprote in ized bone,FDB)修复关节软骨缺损的可行性,评价修复效果,为优化种子细胞源提供依据。[方法]取浓度为3×106/m l的第二代BMSCs和软骨细胞,按2:1比例混匀共培养作为种子细胞。FDB与共培养细胞复合接种植入修复缺损为实验A组、单纯FDB为对照B组和不处理为空白对照C组,移植8、16周后经人体观察、组织学评分和免疫组化染色评价缺损的修复。[结果]共培养的软骨细胞基质合成丰富,细胞增殖快。A组缺损修复组织呈软骨样,表面光滑平坦,与周围软骨整合的软骨细胞更为成熟。B组和C组的修复组织呈纤维组织和无修复。组织学评分表明A组优于B、C 2对照组,差异具有统计学意义(P<0.01),B组与C组差异无统计学意义(P>0.05)。免疫组化染色显示A组修复组织的细胞为透明软骨样细胞,柱状排列,Ⅱ型胶原染色阳性,与周围软骨及软骨下骨整合良好。[结论]自体BMSCs与软骨细胞共培养作为种子细胞,BMSCs能增强软骨细胞的增殖,促进软骨细胞基质合成,缩短软骨细胞培养时间和减少传代次数,节省大量的软骨细胞,与FDB复合后能有效修复关节软骨缺损。     

双基因pCDNA 3.1-NGF-IRES-BMP2真核质粒转染大鼠BMSCs诱导成骨的研究

[目的]研究双基因NGF与BMP2转染大鼠BMSCs并诱导BMSCs成骨分化后表达情况。[方法]将第三代大鼠BMSCs,分为五组,单基因pCDNA3.1-NGF转染组(A组),单基因pCDNA3.1-BMP2转染组(B组),双基因pCDNA3.1-NGF-IRES-BMP2转染组(C组),空质粒对照组(D组)、阴性对照组(E组)。运用Lipofectamine2000介导将各组基因转染BMSCs,Western-blot检测目的基因蛋白表达情况,免疫组织化学染色检测I型胶原蛋白表达含量并测定灰度值。ALP试剂盒检测ALP表达含量,茜素红染色测定转染后各组钙结节并计数。[结果]各组基因转染BMSCs后,Western-blot、I型胶原免疫组化染色、ALP试剂盒检测、茜素红染色钙结节及统计学分析均提示双基因转染组的目的蛋白表达量、I型胶原蛋白表达量、ALP表达量、钙结节形成数目均高于单基因转染组、空质粒组及阴性对照组。[结论]转染双基因pCDNA3.1-NGF-IRES-BMP2组BMSCs可同时表达两种目的蛋白,能诱导BMSCs向成骨细胞分化,NGF的加入能够增强BMP2的成骨作用。     

核心结合因子a1基因转染的骨髓基质干细胞复合生物衍生骨支架诱导异位成骨的研究

目的 观察核心结合因子a1（Cbfal）基因转染的人骨髓基质干细胞（hBMSCs）复合生物衍生骨支架异位成骨的效果。方法 雌性BALB／C裸鼠18只，随机分为3组：转染Cbfal基因的hBMSCs复合支架（A）、未转染细胞复合支架（B）和单纯支架组（C），每组6只。分别将各组人工骨植入裸鼠背部皮下，于术后4、8周行组织学、免疫组织化学和荧光原位杂交等检测。结果 Cbfal基因转染后，可诱导BMSCs骨钙素、Ⅰ型胶原呈阳性表达。体内植入后，A组成骨速度及成骨质量均明显优于其他组；植入细胞及宿主间质细胞呈骨钙素、骨形态发生蛋白2阳性表达；4周时，Y染色体阳性细胞数明显高于B组。结论 Cbfal基因转染BMSCs，能够诱导其向成骨细胞分化、上调骨形态发生蛋白2基因表达并提高移植细胞的生存率，明显促进异位成骨能力。     

透明质酸水凝胶包封对携带BMP-2基因的腺病毒转染骨髓间充质干细胞增殖活性及其表达的影响

目的:探讨携带骨形态发生蛋白2(bone morphogenetic protein 2,BMP-2)基因的腺病毒转染骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)后应用透明质酸水凝胶(hyaluronic acid hydrogel,HAH)包封对BMSCs增殖能力及其表达目标蛋白BMP-2的影响。方法:体外分离、提取、鉴定BMSCs,并将提前构建好的Ad-BMP-2转染BMSCs并使用HAH进行包封,激光共聚焦显微镜下观察Ad-BMP-2转染的BMSCs在HAH包封下的三维形态。实验分为4组(各组培养条件无差异):A组(未转染BMP-2的BMSCs);B组(HAH+未转染BMP-2的BMSCs);C组(转染BMP-2的BMSCs);D组(HAH+转染BMP-2的BMSCs)。分别一周内不同时相点(1d、2d、3d……7d)使用CCK-8法检测各组OD值来评价细胞增殖活性;ELISA法检测各组BMP-2的量(pg/ml)来评价目标蛋白的表达状况。结果 :激光共聚焦显微镜三维重建可观察到BMSCs可在HAH中任意平面铺展,有充足的生长空间。BMSCs的增殖活性检测显示,随着培养时间延长,细胞增殖活性逐渐增强,A组、C组4d后的OD值较1d时明显增大(P0.05);B组和D组5d后的OD值较1d时明显增大(P0.05);至7d时,A组OD值为1.283±0.061,B组为1.844±0.075;C组为1.570±0.099;D组为1.976±0.142,包封HAH的B、D组OD值均优于没有包封HAH的A、C组(P0.05)。BMP-2的表达在A、B组较弱,不同时间点间无显著性差异(P0.05);C、D组的BMP-2表达各时间点均明显高于A、B组(P0.05);从4d时起,C、D两组的BMP-2表达显著增加(与1d时比较P0.05),且D组明显优于C组,差异有显著性(P0.05)。结论 :三维环境下(即包封HAH后),Ad-BMP-2转染的BMSCs不仅有较强的增殖活性;而且对BMP-2的表达具有一定的促进作用。     

动物源性骨软骨支架修复兔膝关节复合缺损

目的探讨软骨细胞-动物源性骨软骨支架复合体修复兔膝关节骨软骨复合缺损的可行性和影响因素。方法将改良贴壁离心法获取的骨髓间充质干细胞（bone marrowm esenchymal stem cells,BMSCs）/诱导分化的软骨细胞共培养后与经深低温冷冻、脱脂、脱钙、真空冷冻干燥和辐照消毒的动物源性骨软骨支架复合,构建共培养细胞＋软骨-骨一体化复合支架。27只新西兰大白兔随机分为实验组（A组）、对照组（B组）和空白组（C组）,每组9只。于兔股骨髁间窝处钻一深6mm的骨软骨复合缺损,A组植入共培养细胞＋骨软骨复合支架,B组植入骨软骨复合支架,C组不植入任何支架材料和细胞,分别于术后4周、8周和12周取材,行大体观察、苏木精—伊红染色和甲苯胺蓝染色,并对各标本的软骨切片进行组织学评分。结果随着时间的延长,A组大体观察见复合缺损区已完全修复,局部无凹陷,新生组织和周围组织融合;B组新生组织仍不能完全填充缺损;C组缺损区仍明显。苏木精—伊红染色和甲苯胺蓝染色见A组软骨缺损区由新生的透明软骨样组织修复,细胞呈柱状排列,极性好,软骨陷窝明显,骨缺损区由骨样组织修复,新生软骨和软骨下骨以及宿主骨界面耦合良好;B组新生软骨细胞无软骨陷窝,排列混乱,各界面藕合欠理想;C组可见陈旧性肉芽组织生长并突出于缺损区表面。甲苯胺蓝染色阳性率和组织学评分结果表明,A组与B、C两组之间的差异具有统计学意义（P〈0.05）。结论 BMSCs/诱导分化的软骨细胞共培养细胞复合动物源性骨软骨支架对兔膝关节软骨和软骨下骨的复合缺损具有修复作用。     

异体软骨细胞诱导骨髓基质细胞成软骨分化的量效关系

目的 探讨利用异体软骨细胞作为诱导因素,与骨髓基质细胞(BMSCs)共培养体外构建软骨复合物的可行性,以及两种细胞混合比例与构建软骨质量的量效关系.方法 体外分别培养扩增BMSCs与异体软骨细胞,软骨细胞与BMSCs的混合比例分别为1:9(A组)、2:8(B组)、3:7(C组)、100%软骨细胞(D组)、100%BMSCs(E组),以5.0×107/ml的细胞终浓度接种于聚羟基乙酸 (PGA)材料支架上培养,各组标本均于体外培养6周后取材,通过大体观察、糖胺聚糖(GAG)含量测定、组织学以及免疫组织化学等方法检测组织工程化软骨形成的情况.结果 各组细胞均与材料黏附良好,C、D两组标本基本保持原有的大小和形状,外观洁白、光滑类似软骨组织;组织学显示两组均有连续的软骨陷窝样结构形成,免疫组织化学显示有大量Ⅱ型胶原沉积.定量结果显示,C组的GAG含量达到D组的70%以上.其他各组培养物体积明显缩小,组织学及免疫组织化学显示软骨样组织形成不佳.结论 异体软骨细胞与BMSC共培养可以构建出较好的软骨组织,表明软骨细胞对BMSCs发挥诱导作用,但是软骨细胞必须达到一定的数量要求.     

猪TGF-β1基因重组慢病毒载体的构建及其在BMSCs中的表达

目的构建猪TGF-β1重组慢病毒表达载体,并转染BMSCs,为构建组织工程骨软骨提供TGF-β1修饰的BMSCs,作为持续、高效的种子细胞。方法将已获取的目的基因TGF-β1cDNA包装至慢病毒载体中,通过PCR及基因测序对阳性克隆进行鉴定,并测定病毒滴度。取2月龄巴马香猪(体重约15 kg)骨髓制备BMSCs,取第2～3代用于实验。用TGF-β1重组慢病毒载体以感染复数(multiplicity of infection,MOI)为10、50、70、100、150分别转染BMSCs,通过激光共聚焦显微镜观察,并以Western blot检测不同MOI值的转染效果,确定最佳MOI值。用TGF-β1重组慢病毒载体以最佳MOI值感染BMSCs作为实验组,以空载体转染的BMSCs(空载体组)及未转染的BMSCs(空白组)作为对照,通过RT-PCR、免疫细胞化学染色、ELISA等方法检测TGF-β1基因及蛋白在BMSCs中的表达情况,并检测Ⅱ型胶原表达情况。结果经PCR及基因测序鉴定TGF-β1重组慢病毒表达载体构建成功,并成功转染BMSCs,激光共聚焦显微镜下可观察到强绿色荧光;Western blot示MOI为70时转染效果最佳;RT-PCR示实验组TGF-β1基因的表达量明显高于空载体组及空白组,差异有统计学意义(P<0.05);免疫细胞化学染色示实验组TGF-β1蛋白及Ⅱ型胶原呈阳性表达,而空载体组及空白组呈弱阳性或阴性表达;ELISA示实验组TGF-β1蛋白至转染后21 d仍有较高表达。结论 TGF-β1重组慢病毒表达载体可成功转染BMSCs,TGF-β1蛋白可长期、稳定表达,促使BMSCs向成软骨细胞方向分化。     

重组pcDNA3.1-hBMP-7真核表达载体的构建及转染兔骨髓基质干细胞的实验研究

[目的]构建人骨形态发生蛋白-7（human bone morphogenetic protein-7，hBMP-7）基因真核表达载体，评价其转染兔骨髓基质干细胞（bone marrow stromal cells，BMSCs）的诱导成骨能力。[方法]从人类胎盘组织中克隆出hBMP-7基因，与真核表达载体pcDNA3．1连接，成功构建了重组pcDNA3．1-hBMP-7真核表达载体；从兔骨髓中分离培养BMSCs，分为3组：ApcDNA3，1-hBMP-7转染组；B空载体pcDNA3．1转染组；C未转染组。使用RT-PCR、免疫组织化学等方法检测hBMP-7在BMSCs中的表达。检测各组细胞碱性磷酸酶，胶原，骨钙蛋白合成情况。[结果]RT．PCR、免疫组织化学检测显示经hBMP-7转染的BMSCs中有BMP-7表达。经hBMP-7转染BMSCs的碱性磷酸酶于转染后第2d显著增高，到第8d达到最高；经hBMP-7转染的BMSCs合成胶原、骨钙蛋白能力也显著提高，与转染空载体、未转染的BMSCs相比有显著性差异（P〈0.05）。[结论]成功构建了pcDNA3，1-hBMP-7真核表达载体；外源的hBMP-7基因可在兔BMSCs中充分、高效的表达，并且这种外源性hBMP-7基因具备了促进兔骨髓基质干细胞向成骨细胞转化的能力，这为hBMP-7的基因治疗提供了坚实的理论基础。     

载基因仿生基质材料调控骨髓基质干细胞成骨定向分化

目的 探讨载基因仿生基质材料能否调控骨髓基质于细胞（BMSCs）向成骨细胞定向分化。方法 将非病毒载体K16GRGDSPC共价接枝于新型骨基质材料聚丙交酯／乙交酯／天冬氨酸／聚乙二醇（PICA-[ASP-PEG]）构建非病毒基因转染体系。该体系与转化生长因子（TGF）-β1基因复合制备成载基因仿生基质材料pcDNA3-TGF-β1／K16GRGDSPc／PLGA-[ASP-PEG]，并将兔BMSCs与其复合培养，以pcDNA3／K16GRGDSPC／PLGA-[ASP-PEG]作为对照。通过逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）、Western blot和酶联免疫吸附测定（ELISA）检测TGF-β1基因的表达；应用碱性磷酸酶（ALP）试剂盒检测BMSCs的ALP活性，并通过RT-FCR检测细胞ALP、骨钙素（OCN）、骨桥蛋白（GPN）和Ⅰ型胶原的表达，通过免疫荧光染色检测核心结合因子a1（Cbfal）表达，观察BMSCs向成骨细胞方向分化的情况。结果 XFS图谱证实K16GRGDSPC被成功地接枝到PLGA-[ASP—PEG]表面。载基因仿生基质材料复合BMSCs培养结果表明，TGF-β1基因被成功地导入细胞内并表达，而且其成骨标志物（ALP、OCN、CPN、Ⅰ型胶原和Cfbal）的表达均显著高于对照组（P〈0．05）。结论 这种载基因基质材料既可以作为骨组织工程支架材料，又可介导外源TGF—β1基因转染BMSCs并定向调控BMSCs成骨分化。     

慢病毒介导TGF-β1基因诱导大鼠骨髓间充质干细胞成软骨细胞分化

[目的]探讨慢病毒介导转化生长因子β1(tansforming growth factor bata 1,TGF-β1)基因转染大鼠骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)诱导成软骨细胞分化的作用。[方法]密度梯度离心法分离培养BMSCs,探索病毒感染最佳条件,取第3代细胞,分为实验组和对照组,通过慢病毒载体将外源性TGF-β1基因转染入细胞,观察绿色荧光表达情况,Real-time PCR法和western blot法检测TGF-β1基因的mRNA和蛋白表达情况,7、14 d时行Ⅱ型胶原免疫细胞化学染色、甲苯胺蓝染色和Real-time PCR检测Ⅱ型胶原及聚集蛋白聚糖的表达。[结果]TGF-β1基因转染BMSCs后能够稳定表达。转染7、14 d时,实验组免疫细胞化学染色、甲苯胺蓝染色均为阳性。转染7、14 d时,实验组II型胶原mRNA均显著高于对照组(P<0.01)。转染7 d时,实验组聚集蛋白聚糖mRNA变化不明显,而14 d时显著高于对照组(P<0.01)。[结论]慢病毒介导的TGF-β1基因可成功转染大鼠BMSCs,并诱导其向软骨细胞分化。在此过程中软骨特异性标志Ⅱ型胶原和聚集蛋白聚糖的mRNA表达具有时间差异性。     

缺氧状态对骨形态发生蛋白-2诱导分化体外复合富血小板血浆凝胶的骨髓间充质干细胞的影响

目的研究缺氧状态对骨形态发生蛋白-2(BMP-2)诱导分化体外复合富血小板血浆(PRP)凝胶的骨髓间充质干细胞(BMSCs)的影响。方法取第三代培养的BMSCs细胞与PRP凝胶相混合,通过构建细胞缺氧模型,根据培养条件的不同确定实验分组:常氧BMSCs+PRP组(A组)、常氧BMP-2+BMSCs+PRP组(B组)、低氧BMSCs+PRP组(C组)、低氧BMP-2+BMSCs+PRP组(D组)。反转录-聚合酶链反应法(RT-PCR)及Western-blotting检测各组成软骨及成骨基因的表达。结果 RT-PCR检测表明C组和D组的Ⅱ型胶原、蛋白聚糖和低氧诱导因子-1α(HIF-1α)表达均较A组和B组明显升高;Ⅰ型胶原和碱性磷酸酶(ALP)在B组的表达最高;A组与B组runt相关转录因子2(Runx2)的表达较C组和D组明显升高。Western-blotting检测结果表明B组和D组的Ⅱ型胶原表达较A组和C组明显升高;C组与D组的HIF-1α表达较A组与B组显著升高;D组的SOX-9表达较其余3组显著升高。所有结果差异均有统计学意义(P0.05)。结论低氧条件能显著促进BMP-2对BMSCs的成软骨诱导分化,同时抑制BMSCs的成骨分化。HIF-1α可能是这一过程的重要调节因子,其可能通过调节SOX-9的表达来发挥促BMSCs成软骨细胞分化的作用。     

CS/PVA凝胶负载Ad-hTGF-β1转染的BMSCs移植修复兔关节软骨缺损

目的 探讨温敏型CS/PVA凝胶负载Ad-hTGF-β1转染的骨髓间充质干细胞(BMSCs)移植修复兔关节软骨缺损的实验效果.方法 体外分离培养兔BMSCs,在Ad-hTGF-β1转染1周后,用细胞免疫化学方法检测hTGF-β1在细胞内的表达.用24只成年新西兰大白兔制造关节软骨缺损模型,双侧后肢均用于实验,动物模型随机分为4组,各组动物6只.A组:凝胶复合转染BMSCs修复组;B组:凝胶复合未转染BMSCs修复组;C组:凝胶修复组;D组:空白对照组.在术后16周时处死动物取材,通过大体标本和组织学染色观察评价各组修复效果,按照改良Pinoda法评分,对各组修复效果进行统计学分析.结果 免疫组化证实体外培养的BMSCs在Ad-hTGF-β1转染后表达hTGF-β1蛋白,阳性率为85.4%.术后16周取材见凝胶复合转染细胞组关节软骨缺损部位为软骨样组织填充,组织学观察见再生的软骨组织细胞排列及细胞密度与正常软骨相似,Ⅱ型胶原免疫组化阳性,Pineda评分同其它各组相比差异有统计学意义(P＜0.05).结论 CS/PVA凝胶作为一种温敏型可注射支架材料,其负载hTGF-β1转染的BMSCs移植可用于兔关节软骨缺损修复.

Abstract：

Objective To investigate the experiment effects of rabbit joint articular cartilage defects repaired by thermosensitive CS/PVA composite hydrogel engineered hTGF-β1 transfected bone marrow mesenchymal stem cells. Methods Bone marrow mesenchymal stem cells were isolated and cultured in vitro. The positive rate of transfection was defected by cell immunohistochemistry methods after Ad-hTGF-β1 transfected for 1 week. Twenty-four adult New Zealand white rabbits with full articular cartilage defects were randomly divided into 4 groups, each group had 6 animals, both hind limbs were used in the experiment. Group A: hydrogel combined with transfected cells; Group B: hydrogel combined with untransfected cells; Group C: hydrogel group; Group D: blank control group. Specimens and histological observation were used to evaluate the repair effect after 16 weeks according to Pineda's score. Results The positive rate of hTGF-β1 expression in BMSCs was about 85.4% after transfection. After 16 weeks the defects of group A were repaired by cartilage-like tissue, the cell arrangement and densities of regenerated cartilage were similar to normal cartilage, type Ⅱ collagen immunohistochemistry were positive. There was a significant difference in Pineda's score compaired with other groups (P ＜ 0.05). Conclusion Rabbit articiular cartilage defects could be repaired by CS/PVA hydrogel engineered hTGF-β1-transfected bone marrow mesenchymal stem cells.