重组人肝再生增强因子对大鼠实验性肝纤维化的保护作用

初步研究表明，从哺乳动物幼仔肝、胚胎肝组织提取的肝细胞生长因子（ＨＧＦ）、肝刺激物（ＨＳＳ）有抗慢性肝损伤的作用。我们以四氯化碳（ＣＣｌ４）中毒性大鼠肝纤维化为模型，研究了重组人肝再生增强因子（ｈＡＬＲ）的抗慢性肝损伤作用，结果表明，重组ｈＡＬＲ有明...     

肝再生增强因子重组质粒对肝纤维化大鼠的实验治疗作用

目的研究肝再生增强因子真核表达质粒对免疫性肝纤维化大鼠的治疗作用并探讨其分子机制.方法制作猪血清诱导的免疫性肝纤维化大鼠模型,将成模大鼠随机分成模型组、秋水仙碱治疗组(Col)、ALR治疗1组(ALR1)、ALR治疗2组(ALR2),分别给予生理盐水、秋水仙碱、pcDNA3-ALR重组质粒治疗.用药4周后处死大鼠,留取血标本和组织标本,免疫组织化学测定Ⅰ、Ⅲ型胶原、TIMP-1和ALR在肝组织的表达,RT-PCR测定TIMP-1 mRNA的表达.结果两个ALR治疗组的肝纤维化分级明显改善.免疫组化结果显示,Ⅰ、Ⅲ型胶原和TIMP-1在肝组织的表达在两个ALR治疗组明显低于模型组,而ALR的表达要明显强于模型组.TIMP-1 mRNA在两个ALR治疗组肝组织中的表达明显低于模型组.结论ALR重组质粒对免疫性肝纤维化大鼠有改善作用,并可能通过抑制TIMP-1活性表达而促进肝细胞外基质降解.     

肝再生增强因子研究进展

本文对有关肝再生增强因子的研究进行综述,为今后进一步将肝再生增强因子研制成为一种治疗肝病有效的靶点药物提供理论依据.     

肝再生增强因子重组质粒在大鼠肝组织中的表达

肝再生增强因子(augmenter of liver regeneration,ALR)是一种具有热稳定性的肝细胞增殖刺激因子,无论内源性还是外源性的ALR都对肝细胞增殖有促进作用[1].     

人肝再生增强因子基因序列的优化、重组表达及功能研究

目的:体外重组表达人肝再生增强因子(augmenter of liver regeneration,ALR)并进行功能研究.方法:全基因合成ALR序列并插入原核表达载体pET28a ,转化入BL21菌内进行诱导表达,表达产物经过纯化后利用MTT法观察表达产物对人肝细胞的刺激增殖活性;利用小鼠急性四氯化碳损伤模型观察表达产物的肝功能保护作用.结果:酶切鉴定及测序结果提示表达产物正确;纯化后表达产物具有明确的促进肝细胞增殖作用,并在中、低剂量具有降低小鼠急性化学性损伤后转氨酶水平的作用.结论:重组表达的ALR结构正确,具有促进肝细胞再生的作用.     

肝再生增强因子的研究进展

肝再生增强因子是近年来发现的一种能够通过免疫调控、信号转导及影响线粒体功能等方式特异性刺激肝细胞增殖、促进肝脏再生的细胞因子,且其基因家族成员广泛存在于从低级到高级的真核细胞中。最近研究发现,其具有保护肝细胞、减轻毒物引起的肝脏损伤的作用。其机制可能与保护线粒体、抑制线粒体膜通透性转换孔开放有关。目前对其生物学性状、功能以及相关作用机制都有较深入的认识。     

重组人肝再生增强因子对肝纤维化大鼠金属蛋白酶组织抑制因子-1基因表达的影响

目的　了解重组人肝再生增强因子 (hALR)对实验性肝纤维化大鼠肝组织金属蛋白酶组织抑制因子 1(TIMP1)基因表达的影响。方法　我们建立了四氯化碳中毒性及人血白蛋白免疫损伤性两种大鼠肝纤维化模型 ,在造模的同时给予不同剂量的hALR。在不同的时间点留取大鼠肝组织标本 ,提取总RNA ,用逆转录聚合酶链反应 (RT PCR)测定TIMP1的基因表达水平。结果　在两种模型中大鼠肝组织TIMP1的基因表达水平在模型形成过程中逐渐升高 ;低剂量hALR组大鼠肝组织TIMP1的基因表达水平与模型组及阴性对照组差异无显著意义 ;高剂量hALR组大鼠肝组织TIMP1的基因表达水平 (四氯化碳模型第 2、4、6、8周分别为 0 6 3± 0 10、1 18± 0 2 0、1 89± 0 30、2 6 3± 0 33;人血白蛋白模型尾静脉攻击中、攻击后分别为 2 33± 0 36、4 0 2± 0 5 3)均明显低于模型组 (四氯化碳模型第 2、4、6、8周分别为 0 99± 0 14、2 0 3± 0 30、2 99± 0 4 3、4 13± 0 4 4 ;人血白蛋白模型尾静脉攻击中、攻击后分别为 4 13± 0 6 0、5 99± 0 83)及阴性对照组。结论　大剂量hALR可能有抑制实验性肝纤维化大鼠肝组织TIMP1基因表达的作用     

人肝再生增强因子DNA免疫的实验研究

目的:构建人肝再生增强因子()真核表达质粒,免疫家兔,获得抗多抗血清。hALRhALR方法:将已构建的人肝再生增强因子()重组质粒,经扩增,亚克隆入真核表达质粒,构建重hALR PET11-hALRPCR pcDNA3.1 pcDNA3.1-hALR组质粒。中量制备重组质粒及对照质粒,以只免疫家兔,取血并分离血清,进行蛋白质pcDNA3.1-hALR pcDNA3.11.08mg/印迹分析。Western blot结果:构建了真核表达质粒,此重组质粒诱发了家兔抗抗体的产生。pcDNA3.1-hALRhALR结论:说明构建的重组质粒在体内有表达能力,为进一步研究的生物学活性及某些疾病的治疗奠定了基础。 hALR     

抗人肝再生增强因子单克隆抗体对人肝癌细胞株HepG2增殖活性的影响

目的:检测人肝癌细胞株HepG2细胞有无人肝再生增强因子(hALR)的表达,利用hALR特异性的单克隆抗体(anti-hALR McAb)结合hALR,观察其阻断hALR的作用后,对人肝癌细胞株HepG2细胞的增殖活性的影响.方法:用免疫细胞化学以及RT-PCR的方法检测HepG2细胞hALR蛋白及mRNA的表达;用3H-TdR掺入法检测hALR特异性单克隆抗体中和hALR后HepG2细胞的增殖情况.结果:①HepG2细胞有hALR的表达.②抗hALR单克隆抗体特异性地阻断hALR的作用后可部分抑制肿瘤细胞自主性生长.结论:抗hALR单克隆抗体能部分抑制肿瘤细胞自主性生长;hALR通过自分泌方式参与了肝癌细胞的自主性生长.     

不同剂量不同载体不同途径的肝再生增强因子重组质粒抗大鼠肝纤维化疗效比较

目的 筛选肝再生增强因子重组质粒基因治疗时较优的载体、途径和剂量及三者的最佳组合.方法 制备肝纤维化大鼠模型,L9(33)正交设计分组,用3种不同的载体(裸基因、脂质体、多聚物)携带不同量(50、100、200μg/kg)的肝再生增强因子重组质粒,采用3种给药途径(肌肉注射、静脉注射、腹腔注射)对模型大鼠进行干预,通过肝组织病理学、肝纤4项等指标来判断疗效并进行对照.结果剂量因素:200μg/kg组纤维化半定量计分和肝纤4项综合得分明显低于50μg/kg组和100μg/kg组,但50μg/kg组和100μg/kg组的结果无显著性差异.载体因素:裸基因组、脂质体组和多聚赖氨酸组3组之间的纤维化半定量计分均无显著性差异.脂质体组和多聚赖氨酸组的肝纤4项综合得分均明显低于裸基因组.途径因素:肌肉注射组、静脉注射组和腹腔注射组3组之间的纤维化半定量计分均无显著性差异.腹腔注射组的肝纤4项综合得分明显高于肌肉注射组和静脉注射组.结论 200μg/kg的肝再生增强因子重组质粒的抗大鼠免疫性肝纤维化的疗效优于100μg/kg和50μg/kg;由脂质体携带DNA和由多聚物携带DNA的疗效明显优于裸DNA.肌肉注射和静脉注射的疗效明显优于腹腔注射.由脂质体或多聚物携带、静脉或肌肉注射200μg/kg的肝再生增强因子重组质粒,能取得较好的抗大鼠免疫性肝纤维化的疗效.     

人肝再生增强因子融合蛋白表达载体的构建

目的 :克隆人肝再生增强因子的cDNA并构建谷胱甘肽巯基转移酶 -人肝再生增强因子 (GST -hALR)融合蛋白表达载体。方法 :根据人肝再生增强因子核苷酸序列 ,从人胎肝cDNA文库中扩增到hALRcDNA ,亚克隆于pUC18载体 ,核苷酸序列测定证实为hALR ;将hALRcDNA亚克隆于 pGEX - 4T质粒 ,转化大肠杆菌JM10 9,筛选阳性克隆酶切鉴定。结果 :重组阳性克隆经酶切鉴定证实重组片段已正确插入相应酶切位点 ,片段与PCR扩增片段大小相同 ,碱基序列正确。结论 :GST -hALR融合蛋白表达载体的成功构建 ,为获得较大量基因工程hALR产品用于重症肝炎治疗打下基础     

大鼠肝再生增强因子的基因克隆

目的 克隆大鼠肝再生增强因子基因编码序列,并在原核细胞表达。方法 按文献报道大鼠肝再生增强因子核苷酸序列合成引物,从2周龄大鼠肝组织提取RNA,利用RT－PCR扩增大鼠肝再生增强因子基因编码区;将PCR扩增片段亚克隆到pBV221质粒,构建原核表达重组载体,导入到大肠杆菌后热诱导表达目的蛋白。结果 从大鼠肝脏的RNA中扩增到长约400bp的肝再生增强因子cDNA编码区基因,序列分析表明与文献报道一致;重组克隆经热诱导表达出分子量约15kD大小的蛋白质,与预期值一致。结论 从2周龄大鼠肝组织中成功克隆肝再生增强因子基因,并获得了原核细胞高效表达。     

重组肝再生增强因子、苦参素和丹参对肝脏星形细胞株IG12的作用

目的通过观察重组肝再生增强因子(rALR)、苦参素和丹参对大鼠肝脏星形细胞(HSC)株IG12增殖及细胞外基质合成的影响,以研究其抗肝纤维化的疗效.方法利用DNA重组、转导、诱导及纯化等一系列方法制备肝再生增强因子重组蛋白,利用胶原酶灌注及密度梯度离心法分离肝星形细胞,用有限稀释法建立大鼠HSC株IG12;于体外观察rALR、苦参素和丹参作用于IG12后IG12酸性磷酸酶活力及细胞外基质合成的改变. 结果rALR、苦参素和丹参均可显著抑制IG12的增殖,并选择性地抑制其细胞外基质的合成. 结论rALR、苦参素和丹参均具有抗肝纤维化的作用;IG12对于抗肝纤维化药物的筛选具有很大的价值.     

重组肝再生增强因子、苦参素和丹参对肝脏星形细胞株IG12的作用

目的 通过观察重组肝再生增强因子(rALR)、苦参素和丹参对大鼠肝脏星形细胞(HSC)株IGl2增殖及细胞外基质合成的影响，以研究其抗肝纤维化的疗效。方法 利用DNA重组、转导、诱导及纯化等一系列方法制备肝再生增强因子重组蛋白，利用胶原酶灌注及密度梯度离心法分离肝星形细胞，用有限稀释法建立大鼠HSC株IG12；于体外观察rALR、苦参素和丹参作用于IG12后IGl2酸性磷酸酶活力及细胞外基质合成的改变。结果 rALR、苦参素和丹参均可显著抑制IGl2的增殖，并选择性地抑制其细胞外基质的合成。结论 rALR、苦参素和丹参均具有抗肝纤维化的作用；IG12对于抗肝纤维化药物的筛选具有很大的价值。     

人肝再生增强因子CXXC结构域与生物学活性的关系

目的：初步探讨人肝再生增强因子蛋白 (human augmenter of liver regeneration protein, hALRp) CXXC结构域与生物学活性的关系。方法：根据酶催化反应中巯基浓度的变化,测定目的蛋白巯基氧化酶活性;采用GST-pulldown方法测定目的蛋白与GST-Na⁺,K⁺-ATPase融和蛋白体外相互作用;用MTT法检测目的蛋白促进成人肝细胞HL-7702增殖情况;探讨hALR与hALR-C65A(hALRp的CXXC结构域突变)蛋白活性差异。结果： 在巯基氧化酶活性实验中,酶活性以转换数 (TN) 表示,hALR组TN=1.25±0.21,而hALR-C65A组TN=0,与 hALR组比较差异有显著性 (P<0.05)。但hALR-C65A与GST-Na⁺,K⁺-ATPase融和 蛋白体外相互作用和促进肝细胞增殖活性与hALRp比较无明显变化。 结论：hALRp的CXXC结构在巯基氧化 酶活性方面有重要作用,但该结构改变并不影响hALRp与Na⁺,K⁺-ATPase的相互作用和促进肝细胞增殖活性。     

新型重组人肿瘤坏死因子引起小鼠肝损伤

目的 :研究新型重组人肿瘤坏死因子 (rhTNF NC)引起小鼠肝损伤的作用。方法 :给小鼠尾静脉注射rhTNF NC ,检测血清丙氨酸氨基转移酶 (ALT)和天门冬氨酸氨基转移酶 (AST)活性、肝脏指数 ,并用硫代巴比妥酸(TBA)测定肝组织中丙二醛 (MDA)含量 ,同时测定超氧化物歧化酶 (SOD)及谷胱甘肽过氧化物酶 (GSH Px)活性。结果 :给小鼠尾静脉注射rhTNF NC 8h后 ,血清ALT、AST活性显著升高 (P <0 0 1) ,肝脏指数和MDA含量也明显增加(P <0 0 5 ) ,而SOD活性下降 (P <0 0 5 ) ,但GSH Px活性未见明显改变 (P >0 0 5 )。结论 :rhTNF NC可引起小鼠脂质过氧化性肝损伤。     

RT-PCR一步法克隆人肝再生增强因子基因

目的 采用RT－PCR一步法，克隆人肝再生增强因子（hALR）编码序列。方法 按文献报道人肝再生增强因子核苷酸序列合成引物，提取人胎肝组织总RNA，利用一步RT－PCR法扩增人肝再生增强因子编码区基因；将PCR扩增片断克隆到pBV221质粒，构建原核表达载体。结果 获得长约400bp的hALPcDNA编码区基因，序列分析表明与文献报道一致。结论 通过RT－PCR一步法成功克隆人肝再生增强因子基因，为制备人ALR基因工程产品及研究其多种生物学作用奠定了基础。