人巨细胞病毒gH蛋白表达及其单克隆抗体的制备

人巨细胞病毒(HCMV)是全球范围内普遍感染的一种疱疹病毒,也是引起胎儿先天性畸形和器官移植受者死亡最常见的病原体。有研究表明,gH蛋白是HCMV主要的中和性抗原,特异性抗gH抗体具有中和HCMV及阻断病毒在细胞间传播的潜力。本研究以含人巨细胞病毒临床株Toledo全基因组的细菌人工染色体(BAC)为模板,扩增去除信号肽和跨膜区的gH基因片段,并将其插入表达载体构建pET32a'-gH重组表达质粒,将序列鉴定正确的重组质粒转化进入表达菌株TransB,诱导重组蛋白表达。用纯化的重组gH蛋白免疫8周龄BALB/c雄鼠,经杂交瘤技术获得5株稳定分泌抗gH单克隆抗体的细胞株,分别命名为8A9、8B4、8C4、8D9、8D12。所获5株单克隆抗体对gH蛋白均具有良好的反应性,其中8A9、8B4、8D9和8D12具有一定的病毒捕获能力,且8D9和8D12的捕获能力较强。本研究获得了具有自主知识产权的抗gH单克隆抗体,抗体具有良好的病毒捕获能力。在此基础上,我们将进一步鉴定其是否为中和抗体,为今后开发治疗HCMV感染的中和抗体奠定基础。     

单克隆抗体酶联免疫吸附法检测尿标本中人巨细胞病毒抗原

本文运用抗人巨细胞病毒(HCMV)包膜20KD或/和130KD结构蛋白的单克隆抗体分别建立了4类酶联免疫吸附试验(ELISA)夹心法,共对44人份临床尿标本进行HCMV抗原检测。方法的敏感度可高达10.3—32.8ng HCMV抗原/ml尿,与尿标本中的HSV-Ⅰ、HSV-Ⅱ和EBV抗原无交叉反应,重复性良好,与病毒分离比较,敏感性和特异性在71—83％和88—100％之间;与核酸杂交比较,敏感性和特异性也可分别高达60—100％和83.3—100％。混合使用多种单克隆抗体作为包被抗体会得到较好的技术参数。上述结果提示运用单克隆抗体ELISA将有助于一般临床实验室对HCMV感染的快速诊断。     

猪细小病毒单克隆抗体的制备和鉴定

目的制备猪细小病毒（PPV）杂交瘤细胞株,并对其分泌的PPV单克隆抗体进行鉴定。方法按常规方法制备并获得2株杂交瘤细胞。用染色体分析对杂交瘤细胞进行鉴定,用间接ELISA、免疫过氧化物酶单层试验（IPMA）和间接免疫荧光试验（IFA）对其分泌的单克隆抗体进行效价测定、亚型鉴定和特异性鉴定。结果得到2株分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株2H9、1F9,染色体数目介于90～110之间。细胞上清效价均达1∶1×104,腹水效价均达1∶1×107,其亚型分别为IgG1、IgM,均为kappa链。2H9、1F9单抗与猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）、猪瘟病毒（CSFV）、猪伪狂犬病毒（PRV）、猪圆环病毒I型（PCV-1）、猪圆环病毒Ⅱ型（PCV-2）、乙脑病毒（JEV）等均无交叉反应。IPMA和IFA检测结果显示2H9、1F9单抗均能与接种于PK-15细胞的PPV发生特异性反应。结论成功制备了2株抗PPV杂交瘤细胞株,证实其产生的单克隆抗体具有良好的特异性和敏感性。     

人巨细胞病毒包膜糖蛋白B主要中和表位单克隆抗体的制备

人巨细胞病毒(Human Cytomegalovirus,HCMV)分布广泛,能够引发多种疾病,人群感染率极高,严重威胁到人类健康。现根据标准毒AD169基因序列,人工合成包膜糖蛋白B(glycoprotein B,g B)AD13区段的主要中和抗原表位AD-1、AD-2、AD-3,并将其与表达载体pET-32a连接,构建重组表达质粒;用IPTG诱导表达重组蛋白,采用Western-blot进行特异性鉴定;将纯化后的重组蛋白免疫BALB/c小鼠,取免疫小鼠脾细胞和SP2/0细胞融合,然后筛选制备AD13单克隆抗体(monoclonal antibody,m Ab)。12%SDS-PAGE电泳鉴定表明重组蛋白表达成功,其相对分子质量约为35 kD;Western-blot和间接ELISA结果说明,重组AD13蛋白作为抗原具有良好的免疫反应性;克隆化后筛选到5个AD13单克隆抗体细胞株,经间接ELISA鉴定,与AD13抗原有良好的特异性反应。上述研究为研发HCMV快速诊断试剂盒提供了原料,也为研究HCMV亚单位疫苗提供了相关的基础。     

酶标记抗人IgA单克隆抗体及其在Epstein-Barr病毒免疫酶技术中的应用

继成功地建立了4株分泌高效价抗人IgA McAb杂交瘤细胞株后,我们将制备出的McAb用于改进鼻咽癌早期诊断中的IgA/VCA和IgA/EA免疫酶技术,并探索了高效价抗人IgA McAb的纯化、辣根过氧化物酶(HRP)标记及有效保存的方法,结果令人满意。 采用饱和硫酸铵沉淀法及Sephadex A-50吸附法对来自细胞培养上清液和腹水的     

巨细胞病毒的免疫学研究进展

巨细胞病毒（ＣＭＶ）感染可引起机体的免疫功能降低，特别是细胞免疫。本文综述了ＣＭＶ对胸腺发育，对脾细胞、单核巨噬细胞、ＮＫ细胞、ＣＴＬ细胞的免疫调节、效应功能的影响。     

人巨细胞病毒小鼠模型的建立

采用HCMV-AD_(169)株实验感染昆明系和BALB/C系小鼠,攻毒后感染急性期BALB/C系小鼠的死亡率(28.57％)高于昆明系小鼠(5.26％)。两种不同品系小鼠的临床症状和HCMV导致的病理损害脑钙化无明显差异。昆明小鼠的发病率(94.74％)高于BALB/C小鼠。     

巨细胞病毒冻干保存

The preservation of cytomegalovirus (CMV) by lyophilization was first developed in China. In 4 to 10 days the typical CPE was up to + in the HEL cell line which was inoculated only 0.2 ml suspension of lyophilized strain AD169 or CMV isolated from milk breast. After preserved for 1 year the lyophilized cytomegalovirus strain still contained 1.5-2.0 lgTCID50/0.1 ml in titer of viral infection. The lyophilized strains have been used in the preparation of diagnostic antigen of cytomegalovirus in our department, also the strains were supplied to the whole country.     

小鼠脑潜伏巨细胞病毒激活模型的建立

目的:我们建立了小鼠脑潜伏巨细胞病毒激活模型,来实现小鼠脑内潜伏的巨细胞病毒(MCMV)的激活,并对潜伏MCMV激活时程进行分析,确定MCMV即刻早期蛋白基因1(ie1)基因转录,完成对ie1基因转录和活病毒产生量时程动力学的分析,以及为进一步阐明原始MCMV在脑中潜伏的细胞类型提供模型。方法:采用出生后两天的BALB/c幼鼠,经右侧耳和眼连线为底边的正三角形的中心将Smith Strain MCMV 500 PFU/5μL注射进入右侧脑室,培养至16周。之后,将脂多糖(LPS)依15μg/kg体重(接近致死量)分别经腹腔和侧脑室内注射,对照组注射生理盐水。于注射后的1日,2日,5日,7日,14日和21日分别在LPS组和对照组中选取5只小鼠取脑。应用反转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)和高敏感性病毒空斑实验(结合病毒空斑实验和RT-PCR)测定MCMV即刻早期蛋白1(IE1)mRNA的表达以及活病毒产生定量分析。结果:LPS组中,可于14日和21日的脑内检测到IE1 mRNA的转录,敏感性病毒空斑实验只在14日和21日出现细胞病毒效应(CPE),病毒量约为4.29×104 PFU/μL和5.20×105PFU/μL,相应对应MEF细胞匀浆物的RT-PCR结果检测到7,14,21日有IE1 mRNA转录。结论:该实验成功建立了小鼠脑潜伏巨细胞病毒激活的模型,并证实和分析了即刻早期蛋白基因ie1在潜伏MCMV激活过程中的表达和时程。该模型的建立将为进一步阐明MCMV在脑中潜伏细胞类型以及MCMV在急性感染、潜伏和重激活过程中对中枢神经细胞的影响提供研究平台,并为人巨细胞病毒(HCMV)的临床研究提供实验依据。     

大蒜中抗人巨细胞病毒成份的筛选

临床试用大蒜制剂预防和治疗人巨细胞病毒感染取得了明显效果。在此基础上我们应用细胞病变(CPE)抑制试验和空斑抑制试验,对大蒜中的抗人巨细胞病毒成份进行了初步筛选和比较,证实新鲜大蒜中存在多种抗该病毒的有效成份,其中至少包括大蒜新素(二丙烯三硫)和Ajoene类似物。     

人巨细胞病毒的分子生态学

近来我们不只一次的讨论过分子生态学,特别是病毒的分子生态学问题,并提出了病毒性疾病的发生,主要是由于有关的分子生态失调的论点。但都未涉及病毒微生态学或病毒分子生态学的基本含义。这里,有必要对之加以明确,然后才对人巨细胞病毒的分子生态学     

EB、巨细胞病毒

<正>现在一般用测定血清抗体价的方法诊断EB病毒和巨细胞病毒(CMV)感染症,在诊断CMV时同时由尿分离病毒(接种于人胎肺细胞,由细胞病变判断)。在感染初期,IgM抗体的出现具有特异诊断价值,但在初期感染之后便100%的呈现潜伏状。由于免疫抑制等宿主方面的原因常见病毒的再活动化。90%以上的日本人感染该二病毒,由健康人的唾液分离出EBV、尿液分离出CMV也不罕见。在AIDS(艾兹病)、器官移植等高度免疫抑制时,常常出现伴随EBV、CMV活动化的重笃感染。DNA诊断的优点是迅速和判断客观,最近建立了多聚酶链反应法(PCR),使大幅增加检测敏感度成为可能。但是对于EBV、CMV这样的在健康人就存在的病原体,既使检测敏感度增加到能检出微量病毒DNA的程度,也很难判定是否果真是病原体。本文介绍DNA诊断的现状及未来。各种检测方法的实例描述于CMV项。     

人类巨细胞病毒与人类肿瘤

人类巨细胞病毒（ＨＣＭＶ）感染能导致多种细胞生物学特性的改变,通过分子病毒学及分子生物学方法在数种人类恶性肿瘤组织中检出ＨＣＭＶＤＮＡ和（或）基因产物。ＨＣＭＶ基因产物可通过激活细胞内多种因子基因,刺激原癌基因表达,抑制抗癌基因产物功能等多种途径干扰细胞生长,分化的调控机制,诱导细胞发生恶性变,ＨＣＭＶ持续感染可以增加受感染细胞恶性特征的表达,大量实验结果证实了ＨＣＭＶ的致癌潜能,揭示了ＨＣＭＶ在     

TT病毒重组蛋白单克隆抗体的制备

采用杂交瘤技术,获得了4株稳定分泌抗TTV重组蛋白的单克隆抗体杂交瘤细胞株,1株属IgG2bλ链、1株属IgG1κ链、2株属IgG2aκ链。4株杂交瘤细胞培养上清液效价为1：80-1：1280,腹水效价为1：32万-1：160万。     

荧光定量PCR检测人巨细胞病毒的方法学建立

目的建立人巨细胞病毒（HCMV）的TaqMan MGB探针荧光定量PCR（FQ—PCR）检测方法。方法选取HCMV MIE exon4为PCR扩增靶序列,经TA克隆构建重组质粒作为定量标准品,经FQ—PCR反应条件的优化及方法学评价,再将其应用于临床检测。结果FQ—PCR最适循环参数为：95℃ 5 min;95℃ 20 s,60℃ 60 s（40 cycles）,20μl最适反应体系为：2．0mmol／L Mg^2＋、0．5μmol／L引物、1．5μmol／L探针、200μmol／L dNTP、2110×buffer、1．0 U Taq酶、2．0μl DNA模板。检测批内CV（变异系数）值为1．32％,批间CV值为1．96％;特异性较好;线性范围为10^2-10^8copies／μl。结论成功地建立了检测HCMV的FQ—PCR法,完全适用于临床检测。