面向工业化的裂殖壶菌DHA油脂提取方法研究

研究液氮法、均质法、微波法、酶法等9种细胞破碎方法对裂殖壶菌单细胞油脂提取的影响,分别考察了各种细胞破碎方法提取得到的单细胞油脂含量、DHA含量、油脂中的脂肪酸分布以及耗时、耗能等情况,结果表明酶法和酸热法效果最好,其中酶法由于投入低、能耗少、操作简单等优点更具工业化潜力。将酶法与传统的均质法进一步放大对比,验证了酶法的优良性能。     

裂殖壶菌发酵生产DHA研究进展

DHA是一种重要的多不饱和脂肪酸,裂殖壶菌(Schizochytrium)因富含DHA成为当前国内外研究热点。本文介绍了Schizochytrium及其合成DHA的代谢机理,并对国内外Schizochytrium发酵生产DHA的水平、发酵底物、发酵工艺进行综述。基于目前发酵状况,提出了DHA发酵过程中存在的问题,并指出选育高产稳定菌株、对合成DHA代谢途径及关键酶进行研究、改进合适的生物反应器并进一步应用数学工具优化发酵工艺是今后的研究重点。      

维生素对裂殖壶菌发酵产DHA的影响

采用单因素研究了VB1,VB3,VB6,VB12,生物素5种B族维生素对裂殖壶菌Schizochytriumsp.JN-168发酵产DHA的影响。实验表明:适量地添加5种维生素中的任一种均可提高DHA的产量,5种维生素的最适的质量浓度分别为0.1,0.005,0.005,0.3,0.05 mg/L,在各自最适的质量浓度下,VB12对DHA产量的提高效果最好,VB6和VB3次之,生物素和VB1最差。将5种维生素以最适的质量浓度同时添加到发酵培养基中可以大幅度提高DHA产量,与对照相比提高了53.8%,亦远高于添加单一维生素的效果。     

EMS-ARTP复合诱变选育高产DHA裂殖壶菌

为确定一种高效、稳定的选育高产DHA裂殖壶菌菌株的方法,将出发菌株Schizochytrium sp.31进行甲基磺酸乙酯(EMS)诱变和常压室温等离子体(ARTP)复合诱变,并将复合诱变方法与2种单因子诱变方法进行诱变效率、诱变后高产株发酵特性及遗传稳定性比较。结果显示,该复合诱变正突变率达到32.2%,远高于2种单因子诱变方法;复合诱变选育得到高产DHA裂殖壶菌菌株,其DHA生产能力和DHA含量分别达到7.2g/L和43.2%,比出发菌株分别高35.6%和19.2%;经过5代培养,其发酵指标稳定,遗传稳定性优于单因子诱变获得的菌株。该复合诱变方法是选育高产DHA裂殖壶菌菌株的有效手段,也为其它产多不饱和脂肪酸菌株的选育提供了参考。     

裂殖壶菌发酵产DHA油脂的生产工艺优化

采用磷酸香草醛法实时监测裂殖壶菌发酵产DHA油脂的积累情况,对裂殖壶菌的基础发酵工艺进行了优化。得到裂殖壶菌生长和油脂积累的最佳培养基配方为:葡萄糖30 g/L,玉米浆粉6 g/L,蛋白胨4 g/L,硝酸钠3.6~3.9 g/L,海水晶15 g/L;在50 L的发酵罐中采用后期流加一定量的葡萄糖提高碳氮比来提高油脂积累外,通过流加3.0 g/L的大豆油来刺激菌体生长,最终经过72 h的流加培养,菌体湿重达到200 g/L,总油脂含量达到60%以上,油脂脂肪酸组成中的DHA含量占22%左右。     

裂殖壶菌的双碳源发酵生产二十二碳六烯酸控制策略

研究了葡萄糖、甘油双碳源发酵对裂殖壶菌发酵二十二碳六烯酸(docosahexaenoic acid, DHA)的影响。首先以葡萄糖和甘油为单一碳源,发现以葡萄糖为碳源,菌体增殖速度和底物消耗速度都明显高于以甘油为碳源,以甘油为碳源细胞油脂中DHA的比例显著高于葡萄糖。为了发挥2种碳源各自优势,对葡萄糖和甘油双碳源发酵进行研究,结果显示2种碳源混合或葡萄糖耗尽后补加甘油结果都不如单一碳源好。但若先用葡萄糖为碳源进行培养,当发酵液中的葡萄糖质量浓度降至10～5 g/L时补加甘油既可以缩短发酵周期,又提高了油脂中的DHA比例。采用初始葡萄糖质量浓度为20 g/L,过程补加100 g/L甘油的发酵控制策略,5 L罐发酵,发酵周期可缩短至56 h,细胞油脂中DHA比例最高可达45.50%,充分发挥了2种碳源的优势。该研究得到了一种裂殖壶菌生产DHA葡萄糖、甘油分段发酵控制策略,大幅提高菌体细胞油脂中DHA的比例,同时有效缩短了发酵周期,具有非常好的工业应用价值。     

裂殖壶菌不同破壁方法的研究

裂殖壶菌细胞结构紧密,对其进行破壁是二十二碳六烯酸(DHA)高强度发酵的重点工序。以裂殖壶菌为实验菌种,比较了水洗法、膜过滤法、高压均质法、酶解法和膜过滤高压均质法5种破壁方法,观察了每种方法破壁前后细胞形态特征,同时测定细胞破壁率、发酵液含油量、DHA产量和DHA含量。结果表明:膜过滤高压均质法效果最为理想,破壁率达到100%;膜过滤高压均质法的含油量、DHA产量、DHA含量均为最高,分别达到16.98 g/L、7.08 g/L、41.71%;从生产的连续性和有效性来讲,膜过滤高压均质法是最佳的破壁方法。     

裂殖壶菌产DHA发酵培养基的优化

从成本控制和发酵罐扩大培养监测控制方面考虑,优化了裂殖壶菌（Schizochytrium sp.FJU-512）产DHA发酵培养基。利用单因素实验和正交实验优化了发酵培养基碳氮源组分,均匀设计实验优化了无机盐组分。最佳产DHA发酵配方为葡萄糖120g/L,酵母浸膏5g/L,谷氨酸钠20g/L,硫酸铵0.25g/L,海水晶25g/L,KH2PO44.0g/L,Mg SO4·7H2O0.5g/L,Ca CO35.0g/L,Na2SO43.0g/L,Fe SO4·7H2O 20mg/L,维生素B10.005g/L,维生素B120.005g/L。优化后,裂殖壶菌DHA产量到达13.83g/L,提高了22%,且培养基成本降低40%左右。      

裂殖壶菌产DHA发酵培养基的优化

从成本控制和发酵罐扩大培养监测控制方面考虑,优化了裂殖壶菌(Schizochytrium sp.FJU-512)产DHA发酵培养基。利用单因素实验和正交实验优化了发酵培养基碳氮源组分,均匀设计实验优化了无机盐组分。最佳产DHA发酵配方为葡萄糖120g/L,酵母浸膏5g/L,谷氨酸钠20g/L,硫酸铵0.25g/L,海水晶25g/L,KH2PO44.0g/L,Mg SO4·7H2O0.5g/L,Ca CO35.0g/L,Na2SO43.0g/L,Fe SO4·7H2O 20mg/L,维生素B10.005g/L,维生素B120.005g/L。优化后,裂殖壶菌DHA产量到达13.83g/L,提高了22%,且培养基成本降低40%左右。     

裂殖壶菌诱变株高产DHA机理的转录组学分析

利用RNA-seq技术对裂殖壶菌SR21的原始菌株和ARTP诱变所获取的DHA高产菌株NA2进行转录组分析。对基因进行功能注释和代谢通路的分类,寻找差异表达基因,并将这些基因归类到相关的代谢途径中,揭示诱变菌NA2中DHA产量提高的分子机理。结果表明:与原始菌株比较,诱变菌NA2中有314个基因上调,3个基因下调;上调的基因主要参与氨基酸代谢和能量代谢,为多不饱和脂肪酸的积累供应更多的乙酰辅酶A(乙酰-CoA)和还原型辅酶Ⅱ(NADPH)。利用荧光定量PCR验证基因的差异表达情况,结果与转录组分析一致。     

高产DHA裂壶藻突变株的选育

利用60Co-γ射线辐照诱变裂壶藻（Schizochytrium limacinum）ATCC20888,以平板生长情况、生物量、含油率和二十二碳六稀酸（DHA）产量为综合指标,最终选育出一株高产突变株,命名为1.6-7-1,其摇瓶发酵生物量为47.37 g/L,油脂含量为31.41%,DHA产量为5.65 g/L,且DHA产量较出发菌株提高了约40%,经连续5代发酵培养,其遗传性能稳定。     

高产DHA裂壶藻突变株发酵条件的优化

为了进一步提高裂壶藻突变株的DHA产量,以经过⁶⁰Co-γ射线辐照诱变后所得高产DHA裂壶藻突变株1.6-7-1为研究对象,通过Plackett-Burman实验、最陡爬坡实验和响应面实验对其发酵培养基进行优化,同时通过发酵罐发酵培养研究不同溶氧水平对突变株代谢的影响。结果表明：葡萄糖、C₅H₈NNaO₄和NaCl添加量对该突变株产DHA具有显著影响,其最佳添加量分别为葡萄糖125.46 g/L、C₅H₈NNaO₄ 12.44 g/L、NaCl 4 g/L,在此条件下该突变株DHA产量达6.01 g/L,相较于原始菌株提升了49.88%;在高溶氧水平下,突变株生物量高但油脂产量和DHA产量较低,可能是因为细胞优先用营养物质进行自身的生长繁殖,而过低的溶氧水平会抑制能量代谢,减慢细胞繁殖速度。综上,优化发酵条件可以提高突变株DHA产量。     

几丁质脱乙酰酶高产菌株的选育及其发酵特性研究

以一株海洋丝状真菌（Penicillium janthinellum）UV-0S为出发菌株,通过多级紫外线诱变育种后获得几丁质脱乙酰酶（CDA） 高产突变株UV-3S,并对该菌株产CDA的发酵特性及其细胞壁几丁质的脱乙酰度（DD）进行研究。 结果表明,突变株UV-3S的胞外 CDA酶活力为11.05 U/mL,是出发菌株UV-0S的2.1倍。 该菌株产胞外CDA的最适初始pH值为9.0,最适无机盐为NaH2PO（4 11 mmol/L）, 胶体几丁质最适添加量为0.5%。 在此最佳发酵条件下,突变株UV-3S的CDA酶活力最高,为11.83 U/mL,说明CDA是一种诱导酶。 细 胞壁几丁质的脱乙酰度随真菌生长而增加,且在发酵96 h后脱乙酰度达到最高（90.52%）。     

多杀菌素高产菌株快速筛选方法的研究

研究利用多杀菌素对蚊子幼虫致死率与其浓度的相关性,以蚊子幼虫为靶标动物建立基于活体筛选的多杀菌素高产菌株高通量快速筛选模型.通过比较蚊子幼虫的致死率筛选获得多杀菌素产量较高的菌株.结果显示:2龄埃及伊蚊幼虫具有高的敏感性和精确性,生测曲线拟合获得的毒力回归方程标准误差(SE)较小,最适宜作为供试虫源用于快速初筛模型.方法能显著提高多杀菌素高产菌株的筛选效率.     

豆瓣发酵瓣子中淀粉酶高产菌株的筛选及其酶活力的测定

以郫县豆瓣不同时期发酵瓣子为原料筛选淀粉酶高产菌株,利用淀粉酶水解圈作为筛选模型,通过筛选培养及酶活力的测定,得到产淀粉酶活力相对较高的菌株DD23,为80.24 IU/mL。通过菌落形态观察、生理生化鉴定和16S rDNA序列分析,确定DD23为蜡样芽胞杆菌（Bacillus cereus）。     

利用伯克霍尔德氏菌脂肪酶富集裂壶藻油脂中的二十二碳六烯酸

目的：研究伯克霍尔德氏菌胞外脂肪酶对裂壶藻油脂中二十二碳六烯酸（docosahexaenoic acid,DHA）的富集作用。方法：用三丁酸甘油酯平板筛选法,筛选产脂肪酶的细菌;以对硝基苯月桂酸酯为底物,对筛选得到的伯克霍尔德氏菌脂肪酶的酶学性质进行研究;用该脂肪酶水解裂壶藻油脂,通过气相色谱法测定酶解后水相和有机相的脂肪酸组成来研究其对裂壶藻油脂DHA的富集作用。结果：从广州的泥土样品中分离获得一株高产胞外脂肪酶的伯克霍尔德氏菌,在产酶培养基中30 ℃、200 r/min的条件下培养40 h后,脂肪酶酶活力达到最大值70 U/mL。脂肪酶粗酶液酶活性的最适温度为45 ℃,最适pH值为8.5。该菌的脂肪酶对裂壶藻油脂中的DHA有一定的富集作用,能够使油脂中DHA占总脂肪酸的质量分数从最初的30%升高到40%。结论：筛选得到一株能够产生选择性富集DHA的脂肪酶的细菌,拓宽了可用于多不饱和脂肪酸分离纯化的脂肪酶的范围。     

清香型白酒大曲中高产四甲基吡嗪菌株的筛选、鉴定及发酵培养基优化

为通过生物法改善并提高清香型白酒酿造中功能性成分四甲基吡嗪的含量,该研究采用传统分离方法从清香型白酒大曲中分离纯化芽孢杆菌（Bacillus sp.）,通过气相色谱（GC）法筛选高产四甲基吡嗪的菌株,通过形态观察及分子生物学技术对其进行菌种鉴定,并对其产四甲基吡嗪发酵培养基配方进行研究。结果表明,共分离得到31株芽孢杆菌,从中筛选得到7株产四甲基吡嗪的芽孢杆菌,其中菌株q94的四甲基吡嗪产量最高,为（0.36±0.01）g/L,其被鉴定为枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）。菌株q94产四甲基吡嗪的最优培养基组成为：蔗糖80 g/L,蛋白胨10 g/L、酵母浸粉20 g/L、磷酸氢二铵30 g/L、磷酸二氢钾15 g/L,在此优化条件下,菌株q94的四甲基吡嗪产量可达（3.32±0.18）g/L。     

复合诱变选育新霉素高产菌株的研究

为了获得优良的新霉素高产菌株,以弗氏链霉菌（Streptomyces fradiae）AS4．576为出发菌株,经4次紫外线诱变,紫外线-LiCl处理,随机挑选平板菌落214株,初筛得到13株抑菌圈较出发菌株〉90％的菌株,经复筛获得1株效价提高178倍的菌株UV40s-9（2）,再经微波复合诱变,以链霉素作为筛选因子得到菌株WB40s-6,其效价较UV40s-9（2）菌株提高了15．2％。     

大方臭豆腐中高产纳豆激酶菌株的分离鉴定

该实验对从大方臭豆腐中分离纯化得到的8株产纳豆激酶菌株进行了研究,通过纤维蛋白平板法对其产纳豆激酶能力的测试,筛选出一株酶活力达到5 435.39 IU/g的高产纳豆激酶菌株GUYR02。对该菌株的菌株形态、生理生化特征、16S rDNA序列分析以及系统发育树分析,鉴定菌株GUYR02为解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）。