自噬基因Beclin 1 shRNA表达质粒的构建及其对宫颈癌细胞HeLa生长的作用

目的 构建自噬基因Beclin 1小发夹RNA(short hairpin RNA,shRNA)表达质粒,探讨Beclin 1抑制后对宫颈癌HeLa细胞生长的作用.方法 根据人Beclin 1 mRNA编码序列,设计RNA干扰靶点,构建Beclin 1 shRNA表达质粒,脂质体法转染人宫颈癌HeLa细胞,通过荧光定量PCR(RT-PCR)和Western blot检测其对HeLa细胞自噬基因Beclin 1 mRNA及蛋白表达的影响.MTT法分析其对细胞增殖、流式细胞仪检测其对细胞周期和细胞凋亡的影响.结果 构建的shRNA表达载体可以使HeLa细胞中自噬基因Beclin 1的mRNA及其蛋白含量降低,转染质粒的细胞生长增殖速度加快,凋亡率降低.结论 成功构建了针对自噬基因Beclin 1的shRNA表达载体,通过转染HeLa细胞,可有效抑制细胞中Beclin 1的表达,并促进细胞生长,抑制凋亡.     

RNA干扰靶向抑制PI3Kp85α蛋白对大肠癌细胞侵袭、转移的影响研究

目的分析RNA干扰靶向抑制PI3K p85α表达对大鼠大肠癌细胞的侵袭及转移的影响。方法设计1条阴性载体及4条shRNA干扰载体转染大肠癌细胞,检测shRNA干扰载体对减少PI3K p85α蛋白表达的作用。结果 shRNA/324转染组PI3K p85α蛋白表达量降低幅度最大;转染shRNA/324载体的干扰组LoVo细胞迁移能力显著减弱（P〈0.05）。结论 RNA干扰靶向可有效抑制PI3K p85α表达并降低肿瘤细胞运动迁移能力。     

Ezrin基因shRNA表达载体的构建及鉴定

目的:设计并构建能有效下调Ezrin蛋白表达的短发夹状RNA(Small hairpin RNA,shRNA)表达载体,探讨载体介导的RNA干扰技术用于预防性治疗骨肉瘤肺转移的可行性.方法:依据小干扰RNA(Small interfering RNA,siRNA)靶序列的设计原则,以Ezrin蛋白编码基因Villin2为靶基因,合成两对编码短发卡结构的两条DNA序列,经退火合成DNA双链,再克隆至shRNA表达载体pGenesil-1质粒中,转化后进行酶切鉴定和DNA序列测定.将构建的载体用脂质体介导转染大鼠骨肉瘤UMR106细胞株,采用RT-PCR和Western blot法检测细胞Ezrin蛋白在mRNA和蛋白水平的表达.结果:成功构建2个针对Ezrin蛋白的shRNA表达载体;其转染大鼠骨肉瘤UMR106细胞后,细胞Ezrin蛋白表达在mRNA及蛋白水平上的表达均显著下降.结论:Ezrin蛋白的shRNA表达载体能显著抑制大鼠骨肉瘤UMR106细胞Ezrin蛋白的表达,本研究为预防性治疗骨肉瘤肺转移的实验奠定基础.     

高迁移率族蛋白B1基因沉默抑制子宫内膜癌侵袭与转移的机制

目的：探讨小干扰RNA抑制高迁移率族蛋白B1(high mobility group box-1，HMGB1)表达后对p38MAPK通路的影响，从而了解HMGB1影响子宫内膜癌侵袭与转移的机制。方法：运用RNA干扰技术，设计合成4条HMGB1 shRNA，将HMGB1沉默效果最好的HMGB1 shRNA转染子宫内膜癌HEC-1A细胞，通过RT-PCR和Western 印迹技术检测转染后细胞HMGB1及p38MAPK在基因和蛋白水平的表达情况，MTT实验检测转染后细胞生长活力状态。结果：RT-PCR和Western 印迹结果均证实HMGB1 shRNA载体成功抑制HMGB1和p38MAPK在HEC-1A细胞中mRNA和蛋白的表达(P<0.05)；MTT结果显示HMGB1 shRNA转染后HEC-1A细胞生长明显受抑(P<0.05)。结论：HMGB1表达下调可有效抑制子宫内膜癌细胞HEC-1A的增殖、侵袭和转移，此过程可能通过p38MAPK信号通路进行调节。     

Galectin-3 shRNA载体的构建表达及其对大肠癌细胞lovo增殖率的影响

目的: 构建galectin-3 shRNA真核表达载体,观察该基因的抑制对大肠癌细胞系lovo细胞增殖率的影响. 方法: 以未转染lovo细胞作为阳性对照组,转染空质粒的lovo细胞作为阴性对照组,将针对人galectin-3基因的不同部位设计的长度约140 bp的shRNA,插入到真核表达载体PRNAT-U6.1并转染人大肠癌细胞lovo,双酶切鉴定重组载体,免疫荧光检测转染效果, RT-PCR和Western-Blot检测其对该基因mRNA和蛋白水平的抑制,MTT测定干扰后对lovo细胞增殖率的影响. 结果: 双酶切出一条约120 bp的DNA片断,与插入片断长度相符. PRNAT-U6.1/Galectin-3 shRNA表达载体顺势转染lovo细胞72 h后检测转染效率及Galectin-3在mRNA和蛋白水平的表达情况, 免疫荧光检测转染效率为62%. 转染PRNAT-U6.1/Galectin-3 shRNA的lovo细胞Galectin-3的表达在mRNA和蛋白水平均明显下降,各组间比较F=2.214,148.566, P=0.000, 0.000,阴性组和阳性对照组相比,P=0.448,0.263. 干扰后细胞继续生长,与干扰前相比,生长明显减慢,F=20.830, P=0.000, 组间比较F=149.710, P=0.000,shRNA干扰组与阴性组和阳性组比较,P=0.000, 0.000. 结论: 成功构建Galectin-3 shRNA表达载体,干扰后Galectin-3在mRNA和蛋白水平的表达明显降低,Galectin-3表达的抑制可能会导致大肠癌细胞lovo增殖率的降低.     

膜联蛋白A7表达稳定下调的小鼠肝癌Hca-F细胞株的建立

目的:建立针对膜联蛋白A7(annexin A7)的shRNA(small hairpin RNA)稳定转染的小鼠肝癌细胞株Hca-F,为后续研究奠定基础.方法:构建3条针对annexin A7的shRNA(shRNA1、2、3),分别与pSilencer连接,构建表达载体并分别转染Hca-F细胞,在mRNA和蛋白质水平比较3条shRNA对annexin A7表达的抑制作用,筛选抑制效果最好的shRNA转染Hca-F.稳转后用含400 μg/ml G418的完全培养基筛选,获得annexin A7表达稳定下调的Hca-F细胞株后传代扩增,应用Western印迹法检测Hca-F细胞annexin A7蛋白的表达,并与空载体转染组及正常对照组进行比较.结果:经DNA测序鉴定,所得到干扰序列与GenBank中序列一致;筛选出其中shRNA1对annexin A7的表达抑制效果最好.pSilencer-shRNA1转染Hca-F细胞株后,annexin A7蛋白的表达远低于空载体转染组和正常对照组(0.318 6 vs 0.798 7,0.824 3,P<0.05),而后二者间无统计学差异.结论:成功建立了annexin A7表达稳定下调的小鼠肝癌Hca-F细胞株,为后续研究奠定了基础.     

短发卡状PTI-1(PC-3)基因特异性RNA干扰表达载体对PC-3细胞的体外效应

目的:通过基因克隆技术构建人前列腺癌PC-3细胞系PTI-1(PC-3)基因[prostate carcinoma tumor-inducing gene 1(PC-3)]的特异性短发卡shRNA(short-hairpin RNA)真核表达载体,采用RNA干扰(RNA interference,RNAi)技术,体外观察对PC-3细胞系PTI-1(PC-3)基因的沉默作用以及干扰后对PC-3细胞的体外效应. 方法:采用基因克隆技术,将合成的短发卡样特异性PTI-1(PC-3) RNA干扰寡核苷酸序列插入真核表达载体pEGFP/U6,构建PTI-1(PC-3)shRNA的真核表达载体,体外转染人前列腺癌PC-3细胞,48 h后观察细胞生物学变化;提取转染细胞总RNA及总蛋白,行RT-PCR以及Western blot观测胞内PTI-1(PC-3)mRNA及蛋白水平. 结果:①成功构建短发卡样PTI-1(PC-3) shRNA真核表达载体pEGFP/U6-mPs;②转染(脂质体法)PC-3细胞,48 h后细胞大部分死亡;③转染48 h后细胞内PTI-1(PC-3)mRNA水平下降;④转染48 h后下调胞内PTI-1(PC-3)蛋白水平. 结论:本实验成功构建的shRNA真核表达载体通过RNA干扰,能够干扰人前列腺癌PC-3细胞内PTI-1(PC-3)基因的表达,抑制PTI-1(PC-3)蛋白的表达,降低了由PTI-1蛋白可能发挥的"翻译失真性"作用,促进癌细胞的死亡,进一步揭示了PTI-1在前列腺癌发生、发展过程中的显性癌基因作用. 由于RNA干扰的特异性从而为临床上前列腺癌的基因治疗提供了新的可能的方法.     

RNA干扰抑制HMGB1基因表达对子宫内膜癌的增殖抑制作用及其分子机制

目的：研究RNA干扰抑制高迁移率族蛋白1(high mobility group box-1 protein,HMGB1)的表达对子宫内膜癌 细胞株HEC-1A的增殖抑制作用及对细胞周期、细胞凋亡的影响,并探讨其可能的分子机制。方法：构建靶向HMGB1 基因的慢病毒shRNA载体,转染子宫内膜癌细胞株HEC-1A,同时利用实时荧光定量RT-PCR和Western印迹检测转染 HMGB1-siRNA后细胞HMGB1 mRNA和蛋白表达水平的变化。MTT法和流式细胞术分别检测转染HMGB1-siRNA后 HEC-1A细胞增殖、细胞周期和细胞凋亡的变化。Western印迹检测转染HMGB1-siRNA后细胞AKT,pAKT和cyclinD1 的蛋白表达水平。结果：慢病毒HMGB1 shRNA载体成功抑制HMGB1 mRNA(P<0.05)和蛋白(P<0.01)在HEC-1A细胞 中的表达;转染HMGB1 shRNA后HEC-1A细胞的增殖能力明显受抑制(P<0.01),并能阻滞细胞于G0/G1期,且明显 诱导细胞凋亡;转染HMGB1 shRNA组、空白对照组和阴性对照组的总凋亡率分别为(17.89±0.23)%,(4.69±0.20)%和 (4.62±0.17)%,3组之间差异有统计表达学意义(P<0.01)。转染HMGB1 shRNA后细胞pAKT和cyclinD1蛋白表达水平均下 调(均P<0.01)。结论：HMGB1表达下调可以有效地抑制子宫内膜癌细胞HEC-1A的增殖,细胞阻滞于G0/G1期,且可诱 导细胞凋亡,影响磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B(PI3K/AKT)信号通路及下调cyclinD1的蛋白表达水平可能为其主要作 用机制。     

细胞色素氧化酶P450 3A4基因联合环磷酰胺的体外抗肿瘤效应

 目的 克隆细胞色素氧化酶P450 3A4（CYP3A4）基因,构建真核表达质粒并导入K562细胞进行表达,研究CYP3A4联合环磷酰胺（CPA）的体外抗肿瘤效应。方法 利用RT-PCR从人肝细胞中克隆CYP3A4基因,构建重组真核表达载体。脂质体法导入K562细胞,RT-PCR和Western blot检测CYP3A4基因在K562细胞中的表达并筛选稳定转染的细胞克隆。MTT法检测CYP3A4联合CPA对肿瘤细胞的抑制作用。结果 成功克隆CYP3A4基因并构建了真核表达质粒pcDNA3.1/myc-His A(+)-CYP3A4。RT-PCR和Western blot分别显示转基因组的CYP3A4 mRNA和蛋白质表达水平均显著高于转空载体组和对照组。MTT示转基因组IC₅₀值为1.090 16 mmol/L,明显低于转空载体组和对照组。酶诱导剂和抑制剂分别能够减低和增高转基因组IC₅₀。结论 CYP3A4体外具有联合CPA的抗肿瘤作用,这种作用能够被CYP3A4相应的诱导剂和抑制剂增强或减低。     

细胞色素氧化酶P450 3A4基因联合环磷酰胺的体外抗肿瘤效应

目的 克隆细胞色素氧化酶P450 3A4（CYP3A4）基因,构建真核表达质粒并导入K562细胞进行表达,研究CYP3A4联合环磷酰胺（CPA）的体外抗肿瘤效应。方法 利用RT-PCR从人肝细胞中克隆CYP3A4基因,构建重组真核表达载体。脂质体法导入K562细胞,RT-PCR和Western blot检测CYP3A4基因在K562细胞中的表达并筛选稳定转染的细胞克隆。MTT法检测CYP3A4联合CPA对肿瘤细胞的抑制作用。结果 成功克隆CYP3A4基因并构建了真核表达质粒pcDNA3.1/myc-His A(+)-CYP3A4。RT-PCR和Western blot分别显示转基因组的CYP3A4 mRNA和蛋白质表达水平均显著高于转空载体组和对照组。MTT示转基因组IC₅₀值为1.090 16 mmol/L,明显低于转空载体组和对照组。酶诱导剂和抑制剂分别能够减低和增高转基因组IC₅₀。结论 CYP3A4体外具有联合CPA的抗肿瘤作用,这种作用能够被CYP3A4相应的诱导剂和抑制剂增强或减低。     

CYP3A4内含子10对CYP3A4基因表达的增强子作用

目的 探讨CYP3A4内含子10及其内SNP CYP3A4*1G对CYP3A4基因表达的调控作用.方法构建CYP3A4启动子启动转录的CYP3A4真核表达质粒, 将CYP3A4内含子10 (CYP3A4*1G野生型/突变型) 正向或反向插入该质粒的启动子上游, 从而构建出不同基因型、不同方向的CYP3A4内含子10调控的CYP3A4真核表达质粒.将构建好的各质粒分别转染入Hep G2细胞, 应用实时荧光定量PCR方法检测CYP3A4 m RNA表达水平.结果 构建的重组质粒经酶切验证与测序鉴定, 插入片段的序列和方向与预期完全一致.无论CYP3A4*1G野生型还是突变型, 反向组CYP3A4 m RNA表达水平均高于正向组 (P<0.01) ;而CYP3A4内含子10无论是正向还是反向, CYP3A4*1G野生型组CYP3A4 m RNA表达水平均高于突变型组 (P<0.01) .此外, 正向突变组CYP3A4 m RNA表达水平低于阳性对照组, 不但没有增强CYP3A4启动子的转录作用反而有所减弱.结论CYP3A4内含子10有类似于增强子的功能, 能够影响CYP3A4启动子对CYP3A4基因的转录, 且具有方向性和CYP3A4*1G等位基因依赖性.     

几种植物化学物对人孕烷X受体介导的细胞色素P450 3A4转录调节作用

目的：观察几种植物化学物是否能通过活化孕烷X受体（PXR）诱导细胞色素P450 3A4（CyP3A4）的转录表达。方法：在人肝肿瘤细胞株HepG2细胞中，用瞬时共转染报告基因实验进行异鼠李素、大豆异黄酮、木犀草素、姜黄素和芦丁素共5种植物化学物在不同浓度和不同处理时间下对PXR介导的CYP3A4的转录调节作用研究。结果：5种植物化学物分别作用于HepG2细胞24h后，大豆异黄酮、木犀草素、姜黄素均能诱导PXR介导的CYP3A4基因的转录表达，诱导能力随浓度增强，而异鼠李素和芦丁素无类似作用。大豆异黄酮、木犀草素、姜黄素均能在1～50μmol／L浓度之间诱导CYP3A4的转录表达，这3种植物化学物在50μmol／L浓度时，诱导倍数分别为0．1％DMSO处理细胞的5．46倍、2．87倍和2．07倍。在不同处理时间的研究中，10μmol／L和50μmol／L大豆异黄酮、木犀草素和姜黄素均能在12h～48h内增强CYP3A4的转录表达，诱导能力随时间延长呈增强趋势。50μmol／L大豆异黄酮、木犀草素和姜黄素作用HepG2细胞48h后，诱导倍数分别为0．1％DMSO处理细胞的6．72倍、3．24倍和2．13倍。结论：植物化学物大豆异黄酮、木犀草素和姜黄素能通过活化PXR诱导CYP3A4的转录表达，异鼠李素和芦丁素则没有类似作用。     

山奈酚调节细胞色素P450 3A4转录表达的研究

目的:观察山奈酚能否通过活化孕烷X受体(PXR)诱导细胞色素P 450 3A 4(CYP 3A 4)的转录表达。方法:在人肝肿瘤细胞株H epG2细胞中,用瞬时共转染报告基因试验检测山奈酚对PXR介导的CYP 3A 4的转录调节作用。结果:山奈酚能通过活化PXR诱导CYP 3A 4的转录表达,其诱导能力随山奈酚的浓度增大和处理时间延长而呈增强趋势。山奈酚在浓度为0.001、0.01、0.1、1.0和10.0μm o l/L下,其诱导倍数分别为0.1%二甲基亚砜(DM SO)处理组的(1.31±0.27)倍、(1.45±0.36)倍、(1.96±0.50)倍、(2.90±1.07)倍和(7.93±0.75)倍(P均<0.05)。1.0和10.0μm o l/L的山奈酚在48 h内其诱导作用随诱导时间的增加而增强,处理48 h后其诱导能力分别为0.1%DM SO处理组的(3.73±1.21)倍和(8.42±1.47)倍。结论:山奈酚能通过活化PXR诱导CYP 3A 4的转录表达。     

大鼠STAT3特异性shRNA慢病毒载体的构建与鉴定

目的在已经成功构建4个针对STAT3的shRNA质粒表达载体的基础上,筛选出干扰效果最佳者进行慢病毒包装并鉴定。方法将STAT3的干扰质粒shRNA1、shRNA2、shRNA3、shRNA4及Control1(空载体对照),Control2(无效shRNA对照)分别转染目的细胞(大鼠肾小球系膜细胞),48h后收集细胞提取mRNA,以RT-PCR检测各组分STAT3表达量。对于筛选所得干扰效果最佳的质粒,采用pPACKH1TM慢病毒载体系统进行病毒包装。利用绿色荧光蛋白作为报告基因,对感染效率及病毒滴度进行检测。结果 RT-PCR检测结果显示,shRNA3样品受干扰的效果最佳。成功构建了慢病毒载体Lenti-shRNA3,共转染293T细胞24h、48h,荧光显微镜下可见强绿色荧光,细胞生长状态良好,表明病毒包装成功。转染HT1080细胞,收集慢病毒液,测定病毒滴度为3.34×108ifu/ml,适合感染目的细胞。结论成功构建了STAT3基因的shRNA慢病毒表达载体,为进一步应用奠定了基础。     

沉默驱动蛋白KIF4A的表达对卵巢癌细胞SKOV3迁移的影响

目的  研究沉默KIF4A基因对人卵巢癌SKOV3细胞迁移能力的影响。方法  检索针对KIF4A基因的小干扰RNA（siRNA）,构建shRNA表达质粒,转染人卵巢癌细胞SKOV3,通过G418筛选建立稳定低表达KIF4A的SKOV3细胞株。采用蛋白质免疫印记（Western blot）法检测shRNA对KIF4A蛋白分子的敲除效率。并通过细胞迁移实验评价低表达KIF4A对SKOV3细胞迁移能力的影响。结果  成功筛选出稳定低表达KIF4A的细胞株,选择干扰效率较高的细胞株进行实验。Transwell细胞迁移实验显示,低表达KIF4A的细胞株的迁移率较阴性对照组增长近3倍(P＜0.05)。结论   KIF4A低表达,可增强人卵巢癌细胞SKOV3的迁移能力。     

6种中药单体对人孕烷X受体介导细胞色素酶P450 3A4转录的调节作用

目的研究6种中药单体野黄芩苷、丹皮酚、芍药苷、甘草苷、黄芪甲苷以及黄芩素是否可以通过诱导孕烷X受体(PXR)介导细胞色素酶P4503A4(CYP3A4)转录表达。方法采用脂质体瞬时转染的方法,将人PXR表达质粒、CYP3A4报告质粒以及内参质粒转入LS174T细胞中,建立报告基因体系,与不同浓度及不同给药时间的中药单体共同孵育,检测细胞中荧光素酶的活性。结果黄芩素(20μmol/L、40μmol/L和80μmol/L)分别诱导PXR介导CYP3A4表达(1.49±0.23)倍(P<0.05)、(2.45±0.56)倍(P<0.01)和(5.27±0.40)倍(P<0.01),野黄芩苷、丹皮酚、芍药苷、甘草苷和黄芪甲苷在实验的浓度范围内不能明显诱导LS174T细胞中PXR介导CYP3A4表达。在不同给药时间实验中,20μmol/L、40μmol/L和80μmol/L的黄芩素在12～48h能诱导PXR介导CYP3A4表达,诱导能力随时间的延长而呈增强的趋势,各浓度的最大诱导倍数均在48h出现。结论黄芩素在LS174T细胞系中可以通过诱导PXR介导CYP3A4转录表达,而野黄芩苷、丹皮酚、芍药苷、甘草苷或黄芪甲苷无此作用。     

靶向siRNA对人子宫颈癌细胞的抑制作用

目的构建增殖细胞核抗原（PCNA）的小发夹结构RNA（shRNA）的真核表达载体并在人HeLa细胞表达，同时观察PCNAshRNA对HeLa细胞体外增殖及生物学特性的影响。方法将PCNAcDNA的shRNA引物插入真核表达载体pGenesil-1，构建真核表达质粒pGenesil-1-PCNA（1—4），并通过酶切和测序等方法进行鉴定，将真核表达质粒pGenesil-1-PCNA（1—4）转染HeLa细胞，运用Western blot方法检测PCNA蛋白的表达，流式细胞仪分析细胞周期变化。结果PCNAshRNA能显著抑制人HeLa细胞的生长，阻滞细胞于G0／G1期，PCNA的蛋白表达同时受到抑制。结论PCNAshRNA能显著抑制人HeLa细胞的生长，其抑制作用可能通过阻断PCNA蛋白表达实现，实验结果为进一步研究PCNAshRNA对子宫颈癌的基因治疗奠定了基础。     

Hsa-miR-660负调控人类肝脏组织中药物代谢酶CYP3A4的表达

 【摘要】目的 探讨Hsa-miR-660 (简称miRNA-660)是否参与调控人类重要I相药物代谢酶CYP3A4的表达,是否影响人类肝脏组织中的CYP3A4酶活性。方法 生物信息学预测出miRNA-660可以作用于CYP3A4基因mRNA 3′端非编码区(3′untranslated region,3′UTR);细胞转染和双萤光素酶报告实验进一步验证miRNA-660能直接作用于CYP3A4 mRNA 3′UTR;收集28例人肝脏组织,检测其成熟miRNA-660表达量、CYP3A4的mRNA和蛋白质表达量及酶活性;将miRNA-660表达水平与CYP3A4 3种表达水平进行Pearson两两回归分析,探索miRNA 660与CYP3A4表达之间的相关性,从而推测miRNA-660在调控CYP3A4表达中的作用。结果miRNA-660能直接作用CYP3A4 mRNA 3′UTR(t检验,P=0.017),miRNA-660表达量与CYP3A4 mRNA表达量无显著相关性(P=0.20),但与CYP3A4蛋白表达量、酶活性负相关(P<0.05)。结论 在肝脏组织中,miRNA 660虽然不影响CYP3A4基因的mRNA表达,但可能在翻译水平抑制其蛋白质表达及酶活性,负调控CYP3A4基因的翻译过程。miRNA 660可能直接参与调控人肝脏组织中CYP3A4的表达,miRNA可能是引起人群中CYP3A4酶活多态性的重要原因之一。