冻干ACYW 135群脑膜炎球菌多糖疫苗的稳定性

目的评价冻干ACYW135群脑膜炎球菌多糖疫苗的稳定性。方法取3批冻干ACYW135群脑膜炎球菌多糖疫苗,分别置2~8℃及37℃存放,于不同时间点(37℃第1、2、3、4、12、24、48周;2~8℃第3、6、12、18、24、30、36个月)取样,上XK16/100 Sepharose CL-4B层析柱后,采用火箭电泳法检测4种多糖分子大小(KD值)及多糖回收率。另取3批疫苗,置2~8℃存放,分别于第12、18、24、30个月取样,进行疫苗全面检定;取同批疫苗进行酸(调p H值至5.0和4.0)、碱(调p H值至10.0和12.0)处理后置2~8℃,于不同时间点取样,上XK16/100 Sepharose CL-4B层析柱后,采用火箭电泳法检测多糖KD值及回收率。结果于2~8℃存放36个月、37℃存放24周的疫苗的多糖KD值及回收率,以及2~8℃存放30个月的疫苗的鉴别试验、外观、水分、多糖含量、分子大小及回收率、无菌检查、异常毒性检查、热源试验、细菌内毒素检查结果均符合企业内部《ACYW135群脑膜炎球菌多糖疫苗制造和检定规程》(草案)要求。疫苗调p H值至5.0及10.0后置2~8℃存放48 h,多糖KD值及回收率均符合本企业内部《ACYW135群脑膜炎球菌多糖疫苗制造检定规程》(草案)要求。结论冻干ACYW135群脑膜炎球菌多糖疫苗于2~8℃存放30个月,性能稳定。     

ACYW135群脑膜炎球菌多糖疫苗多糖含量火箭电泳检测方法的建立及其验证

目的建立ACYW135群脑膜炎球菌多糖疫苗多糖含量检测的火箭电泳法,并对该方法进行验证。方法分别用A、C、Y、W135群菌液免疫家兔,制备特异性抗血清,加至琼脂糖凝胶平板中,以定量的各群多糖原液作为抗原参考品进行火箭电泳,用已知的多糖浓度及对应的火箭峰高绘制标准曲线,得出直线回归方程,根据样品的火箭峰高计算多糖含量,确定该方法的检测限,并对该方法进行专属性、线性重复性、准确度、精密度验证;用建立的方法检测3批ACYW135群脑膜炎球菌多糖疫苗多糖含量。结果根据该方法绘制的标准曲线呈良好的线性关系,R2均≥0.95;该方法确定样品多糖浓度检测范围为3~7μg/ml,回收率在90%~110%范围内;重复性及不同操作者间的精密度试验结果 RSD均小于5%;特异性好,未检出各群抗原之间的交叉反应。3批ACYW135群脑膜炎球菌多糖疫苗多糖含量均符合企业内部《ACYW135群脑膜炎球菌多糖疫苗制造与检定规程》的要求。结论建立的火箭电泳方法可用来检测ACYW135群脑膜炎球菌多糖疫苗的多糖含量。     

冻干A、C群脑膜炎球菌多糖结合疫苗的稳定性

目的观察冻干A、C群脑膜炎球菌多糖结合疫苗在2~8℃条件下的稳定性。方法将冻干A、C群脑膜炎球菌多糖结合疫苗放置在2~8℃条件下,定期取样,检查其物理外观,检测多糖含量、水分含量和分子大小,并进行鉴别试验以及异常毒性和免疫原性试验,考察其稳定性。结果冻干A、C群脑膜炎球菌多糖结合疫苗于2~8℃保存30个月,各项质量控制指标仍符合该疫苗企业注册标准。结论冻干A、C群脑膜炎球菌多糖结合疫苗在2~8℃条件下,其质量稳定。     

我国ACYW135群脑膜炎球菌多糖疫苗趋势分析及质量评价

<正>ACYW135群脑膜炎球菌多糖疫苗是我国于21世纪新研制的疫苗,用于预防由相应群脑膜炎球菌引起的疾病[1-2]。我国对疫苗实行批签发监管制度,2007年签发了第1批ACYW135群脑膜炎球菌多糖疫苗,迄今为止,由2007年的1家企业至今已有5家企业获得了生产文号,共签发近500批制品约4 000万人份。仅2013年,该疫苗批签发85批次,共计7 484 833人份。     

C群脑膜炎球菌多糖结合疫苗制备工艺的优化

目的优化C群脑膜炎球菌多糖-破伤风类毒素(Tetanus toxoid,TT)结合疫苗的制备工艺。方法分别采用衍化的降解多糖与TT结合、衍化TT与降解多糖结合和1-氰基-4-二甲基氨基吡啶.四氟化硼(CDAP)活化降解多糖后衍化再与TT结合的方法制备C群脑膜炎球菌多糖蛋白结合物PSAH-TT、PS-AHTT和PSCDAPAH-TT,并进行生化指标和抗原性检测,与溴化氰(CNBr)活化多糖衍化与TT的结合物PSCNBrAH-TT进行免疫原性比较,确定最适制备工艺,并制备2批结合疫苗,与市售疫苗进行免疫原性比较。结果 3种方法制备的多糖蛋白结合物生化指标存在差异,以PSCDAPAH-TT收率最高,且均保持了多糖的抗原性及免疫原性,并有免疫加强效应;PSCDAPAH-TT免疫2针后抗体GMT水平高于PSAH-TT和PS-AHTT,差异有统计学意义(P<0.05),3针后抗体GMT水平仍高于PSAH-TT和PS-AHTT,但差异无统计学意义(P>0.05),PSCDAPAH-TT免疫2针和3针后抗体GMT水平均高于PSCNBrAH-TT,且2针后差异有统计学意义(P<0.05),3针后差异也无统计学意义(P>0.05),但制备的2批PSCDAPAH-TT疫苗免疫2针和3针后的抗体GMT水平均明显高于市售疫苗,差异有统计学意义(P<0.05)。结论经CDAP活化降解多糖后衍化再与载体蛋白结合制备的疫苗具有较好的免疫原性。     

A群脑膜炎球菌多糖结合疫苗的稳定性

目的　观察A群脑膜炎球菌多糖结合疫苗的稳定性。方法　疫苗放不同温度和不同时间后 ,用乙醇沉淀法测定A群脑膜炎球菌多糖结合疫苗的游离多糖含量 ,SepharoseCL 4B凝胶层析法测定分子大小。结果液体疫苗放置 2～ 8℃ 9个月 ,游离多糖含量为 30 %以上 ;4℃放置 18个月 ,Kd <0 2的多糖回收率 <6 0 %。冻干疫苗放置 2 5℃和 37℃ 12个月 ,或放置 2～ 8℃ 18个月 ,游离多糖含量均不高于 2 5 % ,Kd <0 2的多糖回收率 >6 0 %。结论　冻干A群脑膜炎球菌多糖结合疫苗具有良好的稳定性。     

离子色谱法测定脑膜炎球菌多糖蛋白结合疫苗中的高碘酸钠含量

目的建立脑膜炎球菌多糖蛋白结合疫苗中残余高碘酸钠含量的检测方法。方法通过抗坏血酸将高碘酸根还原成碘离子,采用IonPac AS11-HC阴离子交换分析柱(4 mm×250 mm),上样量25μl,以50 mmol/LNaOH淋洗液等度洗脱,流速1.5 ml/min,电化学检测器测定还原出的I-,用Chromeleon色谱工作站记录并分析数据。对建立的方法进行专属性、准确性、重复性验证,确定该方法的最低检出限和最小定量限,并进行初步应用。结果等浓度的抗坏血酸和高碘酸钠的反应比例为4∶1时,高碘酸根可完全还原为I-。对照品I-在10μg/L~1 mg/L范围内,I-浓度和色谱峰面积呈良好的线性关系,r均大于0.999,回收率为91.66%~110.20%,RSD为0.2%~2.3%,最小检出限为1μg/L(信噪比3∶1),最小定量限为5μg/L(信噪比10∶1)。用建立的方法检测A群、C群、Y群和W135群脑膜炎球菌多糖蛋白结合物各2批,均未检测出高碘酸钠。结论离子色谱法可检测脑膜炎球菌多糖蛋白结合疫苗中的高碘酸钠含量,该方法操作简便、灵敏、快速,干扰小,重现性好,适用于对疫苗生产过程中的质量控制。     

脑膜炎球菌多糖结合疫苗的研究进展

脑膜炎球菌多糖结合疫苗基本采用化学结合方式制备,最常用的方式为酰胺缩合反应,由于多糖与蛋白以共价键形式结合,因此制备的结合疫苗稳定性较高,具有较好的技术优势,在脑膜炎球菌相关疾病预防中发挥重要作用。脑膜炎球菌多糖结合疫苗应用于2岁以内婴幼儿的免疫接种,保护效果持久。本文就脑膜炎球菌多糖结合疫苗制备的影响因素、多糖与载体蛋白的结合方式、国内外现状以及制备过程中存在的问题进行综述。     

差异火箭免疫电泳定量检测四价脑膜炎球菌结合疫苗游离多糖方法的建立及验证

目的建立差异火箭免疫电泳(differential rocket immunoelectrophoresis,DRIEP)定量检测四价脑膜炎球菌结合疫苗游离多糖的方法,并对该方法进行验证。方法制备非均一性抗体琼脂糖凝胶,建立脑膜炎A群、C群、Y群、W135群游离多糖的DRIEP定量检测法,并对该方法的专属性、分离效果、线性、重复性及稳定性进行验证。分别采用DRIEP法及DOC沉淀化学法对11批各群脑膜炎球菌单价结合物进行检测。结果各群多糖抗原只与其相应特异性抗体发生结合,无交叉反应;各群结合物或混合物中的TT可完全与多糖分离;A群、W135群游离多糖定量对照品在2.5~20μg/ml范围内,C群、Y群游离多糖定量对照品在2~10μg/ml范围内,与沉淀峰高度呈良好线性关系,R2均>0.99;各群单价结合物的9次检测结果的CV值均<15%;多价脑膜炎球菌结合疫苗中各群游离多糖含量均比较接近。DRIEP法检测值较DOC沉淀化学法高约1/2倍,但两种方法检测结果的高低趋势具有相似性。结论DRIEP法可用于四价脑膜炎球菌结合疫苗中游离多糖的定量检测,提高了该疫苗的质控水平。     

A群脑膜炎球菌多糖结合疫苗的研制

目的 制备安全有效的Ａ群脑膜炎球菌多糖结合疫苗。方法 通过碳二亚胺（ＥＤＡＣ）将Ａ群脑膜 炎球菌多糖－ＡＨ衍生物与破伤风类毒素（ＴＴ）蛋白共价结合,制备Ａ群脑膜炎球菌多糖结合疫苗。结果 所结合 成的多糖－蛋白结合物,具有Ａ群脑膜炎球菌多糖和破伤风类毒素抗原特异性。单独用多糖免疫小鼠未能诱导出 高水平的血清Ｐｓ抗体,而用结合物免疫小鼠却诱导出高水平的血清Ｐｓ抗体及ＴＴ抗体,并有免疫记忆性。结论 为进一步临床评价该疫苗的人群免疫效果提供了实验基础。     

不同蛋白载体制备A、C、Y、W_(135)群四价脑膜炎球菌多糖结合疫苗的免疫原性

目的探讨以破伤风类毒素(tetanus toxoid,TT)及白喉类毒素(diphtheria toxoid,DT)为载体的A、C、Y、W_(135)群四价脑膜炎球菌多糖结合疫苗的免疫原性。方法将A、C、Y、W_(135)群流脑多糖经溴化氰(CNBr)活化后,以1,6己二酰肼(1,6-adipic acid dihydrazide,ADH)作为衍生剂制备相应的衍生物,分别与TT及DT在碳二亚胺[N-(3-Dimethylami-nopropyl)-N’-ethylcarbodiimide hydrochloride,EDAC]作用下结合,经Sepharose 4FF凝胶层析纯化后,加入冻干保护剂进行冻干,制备成A、C、Y、W_(135)群四价脑膜炎球菌多糖结合疫苗。用两种蛋白载体疫苗分别按1及2.5μg两个剂量(各型多糖的含量为1和2.5μg)免疫小鼠,经腹部皮下注射,于0及14 d各免疫1次,于首次免疫后第28天经静脉采血,分离血清,ELISA法检测血清各型抗体水平。结果 1及2.5μg两个剂量组的阳转率均高于80%,2.5μg免疫组的阳转率优于1μg免疫组;总体上来说,以TT为蛋白载体结合疫苗的阳转率高于以DT为载体的结合疫苗,对A和W_(135)群脑膜炎球菌多糖结合疫苗较明显。结论以TT及DT为载体制备的A、C、Y、W_(135)群四价脑膜炎球菌多糖结合疫苗均具有良好的免疫原性,TT略优于DT。     

人血清中A、C、Y、W135群脑膜炎球菌荚膜多糖IgG抗体含量ELISA检测方法的建立

目的建立人血清中抗A、C、Y、W135群脑膜炎球菌荚膜多糖Ig G抗体含量的ELISA定量检测方法,并进行验证。方法筛选适用的酶标板,优化抗原包被浓度,确定ELISA检测过程的关键条件,对建立的ELISA方法的特异性、线性、准确性、精密度、最低检测值和稳定性进行验证,并建立实验室质控血清的质控检测范围。结果酶标板的板内CV为9.8%,板间CV为16.4%,符合检测使用要求。免疫血清经多糖吸收后,群特异性抗体含量与同群多糖吸收剂量呈明显的剂量依赖关系。12份美国CDC质控血清中各群Ig G抗体含量与血清的稀释度呈负相关,相关系数(r)和斜率(slope)均接近-1,线性关系良好;检测结果与CDC公布数据一致性良好,一致性相关系数A、C、W135、Y群分别为0.912 5、0.939 6、0.963 7和0.920 6,准确度较好。实验室内部质控血清Men20中各群Ig G抗体含量试验内和试验间精密度分别小于10%和20%,精密度较好;各血清群别的CV值均30%,稳定性较好;A、C、Y、W135群多糖Ig G抗体含量最低检测值分别为0.092、0.118、0.067和0.035μg/ml,质控血清的检测范围分别为:92.49~36.53、37.29~17.69、66.18~25.54和50.15~23.31μg/ml。结论建立了标准化的检测人血清中抗A、C、Y、W135群脑膜炎球菌多糖Ig G抗体含量的定量ELISA方法,并确定了实验室日常用质控血清Men20的质控检测值范围。     

A群C群脑膜炎球菌结合疫苗游离蛋白含量HPLC检测方法的建立

目的 建立A群C群脑膜炎球菌结合疫苗中游离蛋白含量的HPLC检测方法,并对其进行验证。方法 采用HPLC法,色谱条件:色谱柱:TSKgel G3000SW(300 mm×7.5 mm,10μm);流动相:0.01 mol/L磷酸盐缓冲液[pH(7.2±0.2)];流速:0.5 ml/min,自动进样100μl;检测波长:280 nm;柱温:室温。对该方法进行专属性、分离度、线性、精密性和准确性验证,确定该方法的定量限和检测限;应用建立的方法检测3批A、C群脑膜炎球菌结合疫苗原液及A群C群脑膜炎球菌结合疫苗成品中游离蛋白含量。结果 该方法检测游离蛋白的专属性、分离度良好;蛋白对照品在3~18μg/ml范围内,标准曲线的线性关系良好,R~2=0.998;3批A、C群脑膜炎球菌结合疫苗原液、A群C群脑膜炎球菌结合疫苗成品的加样回收率在82.9%~119.33%之间,RSD小于5%;确定方法检测限为1.0μg/ml,定量限为2.6μg/ml。3批A、C群脑膜炎球菌结合疫苗原液和A群C群脑膜炎球菌结合疫苗成品未检测出游离蛋白。结论 建立的HPLC法简便、灵敏、准确度高,可检测A群C群脑膜炎球菌结合疫苗中游离蛋白含量。     

层析法纯化脑膜炎球菌A、C、Y、W135群多糖工艺的建立

目的建立一种新型脑膜炎球菌A、C、Y、W135群多糖层析纯化工艺。方法将A、C、Y、W135群粗糖样品溶解后,用含2%脱氧胆酸钠(SDC)的Tris-HCl缓冲液稀释,用串联的Capto Adhere和Capto DEAE介质,采用流穿模式,经一步层析将多糖与其他杂质分离,再经Sephodex G25脱盐后获得精糖原液,根据《欧洲药典》7.0的方法和标准,对各型样品的各项指标进行检测。结果 4群多糖均可在柱上流穿,多糖可与蛋白及核酸完全分离;纯化多糖样品的各项指标均符合《欧洲药典》标准,各群多糖的回收率均高于55%。结论建立了一种新型脑膜炎球菌A、C、Y、W135群多糖层析纯化工艺,缩短了生产时间,提高了回收率,可替代传统的苯酚抽提工艺,用于脑膜炎球菌A、C、Y、W135群多糖的纯化。     

A、C群流脑多糖结合疫苗与A群流脑多糖疫苗序贯加强免疫效果观察

目的观察A、C群脑膜炎球菌多糖结合疫苗(MCV-AC)和A群流脑多糖疫苗(MPV-A)序贯加强免疫效果。方法对118名2岁内已完成2剂次MPV-A或MCV-AC基础免疫接种的儿童,3~4岁时进行1剂次MCV-AC加强免疫。采集免疫前后血清标本,分别测定A、C群杀菌抗体几何平均滴度(geometric mean titer,GMT),计算阳转率。根据既往流脑疫苗基础免疫接种史,分两个观察组(MCV-AC和MPV-A)进行分析。结果加强免疫前,MCV-AC和MPV-A组A群抗体阳性率(18.75%和14.28%)和GMT(2.09和1.79)差异均无统计学意义(P0.05);两组间C群抗体阳性率(均为0)差异无统计学意义(P0.05),GMT(1.30和1.00)差异有统计学意义(P0.05)。加强免疫后,MCV-AC和MPV-A组A群抗体阳性率(97.91%和100.00%)和GMT(241.63和227.32)差异均无统计学意义(P0.05),同组间加强免疫前后抗体阳性率和GMT差异均有统计学意义(P0.05);两组间C群抗体阳性率(89.58%和92.85%)差异无统计学意义(P0.05),GMT(106.09和105.00)差异有统计学意义(P0.05),同组间加强免疫前后抗体阳性率和GMT差异均有统计学意义(P0.05)。结论 A、C群流脑结合疫苗有必要进行加强免疫,其加强免疫效果不受基础免疫疫苗种类的影响,均能产生有效的免疫应答。     

VVM标签在A群C群脑膜炎球菌多糖结合疫苗上的应用

目的探讨VVM标签在A群C群脑膜炎球菌多糖结合疫苗(以下简称流脑AC结合疫苗)上的应用效果,为该疫苗的冷链运输管理提供参考。方法抽取2012年生产的3批批签发合格的流脑AC结合疫苗,贴上VVM14标签,分别于37℃放置0、7、14、21 d和25℃放置0、30、60、90、100 d取样,检测VVM14标签反应区和参照区的A值差值及疫苗的多糖含量、p H值、水分、游离多糖含量、游离蛋白含量和鼠免疫原性等质量指标。结果随着放置时间的延长,流脑AC结合疫苗VVM14 A值的差值明显下降,游离多糖含量均有升高趋势,鼠免疫原性均有下降趋势,但变化不明显,其余指标变化趋势不明显,均在《A群C群脑膜炎球菌多糖结合疫苗制造及检定规程》YBS00102009质量标准规定的范围内。疫苗于37℃放置21 d和25℃放置100 d后,质量均符合标准要求。结论冻干流脑AC结合疫苗具有良好的热稳定性,VVM14的A值差值与疫苗质量具有相关性,VVM14标签在疫苗上的应用,可直观反映该疫苗在冷链运输、保存和使用环节的质量,提高免疫接种率。     

A群C群脑膜炎球菌结合疫苗的制备

目的制备A群C群脑膜炎球菌结合疫苗,并对其进行生化检测及免疫原性和抗原性分析。方法经溴化氰(CNBr)分别活化的A群、C群脑膜炎球菌荚膜多糖,在己二酰肼(ADH)的连接作用和碳二亚胺(EDAC)的偶联作用下,与破伤风类毒素(Tetanic toxoid,TT)形成结合物。以不同剂量的GAMP-TT和GCMP-TT的混合物免疫小鼠,检测小鼠血清中GAMP、GCMP和TT的抗体滴度,评价其免疫效果。根据剂量试验结果,制备A群C群脑膜炎球菌结合疫苗并进行抗原性检测,并与市售同类产品进行对比试验。结果制备的3批GAMP-AH和3批GCMP-AH的批间差异较小,GAMP-AH和GCMP-AH的衍生率相差较大,由GCMP-AH制备的GCMP-TT的结合率明显高于GAMP-TT(P<0.01),结合物含量差异无统计学意义(P>0.05)。GAMP-TT和GCMP-TT具有良好的免疫原性和抗原性,多糖蛋白结合物组较多糖组可诱导产生更高水平的GAMP和GCMP抗体,且具有免疫记忆。由以上两者制备的A群C群脑膜炎球菌结合疫苗生化指标、血清抗体效价与市售的同类产品差异无统计学意义(P>0.05)。结论成功研制了具有良好免疫原性和抗原性的A群C群脑膜炎球菌结合疫苗,为其产业化奠定了基础。     

脑膜炎球菌多糖蛋白结合疫苗中A群游离多糖含量测定方法的建立

目的建立脑膜炎球菌结合疫苗中A群游离多糖含量的定量检测方法,并进行验证。方法采用高效阴离子色谱-电导法(high-performance anion-exchange chromatography with conductivity detection,HPAEC-CD),分析柱:IonPacTMAS11 Analytical(4 mm×250 mm),22 mmol/L Na OH流洗,流速为1 ml/min,25μl自动进样,电导检测。筛选样品的氧化反应最佳温度、双氧水浓度及干烤时间,确定HPAEC-CD的检测限和定量限,并进行专属性、准确性及精密度验证。应用建立的方法检测3批多糖蛋白结合物原液A-破伤风类毒素(A-tetanus toxoid,A-TT)多糖及游离多糖含量,并与《中国药典》三部(2010版)附录ⅦA磷测定法中的传统比色法进行比较;同时检测3批A、C群及A、C、W135、Y群脑膜炎球菌多糖蛋白结合疫苗的多糖及游离多糖含量。结果确定样品的氧化条件为:100μl/ml H2O2,220℃干烤90 min。磷标准品在0.1~1μg/ml范围内,峰面积和浓度线性关系良好(r=0.999 877);TT、C-TT、W-TT及Y-TT对测定无干扰;该方法的检测限为0.007μg/ml,定量限为0.024μg/ml;A群脑膜炎球菌多糖原液的加样回收率在97.56%~102.95%之间;重复性及不同操作者间的精密度试验结果 RSD均小于5%。A-TT的多糖含量及游离多糖含量与传统比色法测定结果差异较小;3批A、C群及A、C、W135、Y群脑膜炎球菌多糖蛋白结合疫苗的多糖含量均符合《A、C群脑膜炎球菌结合疫苗制造及检定规程草案》及《A、C、W135、Y群脑膜炎球菌结合疫苗制造及检定规程草案》要求,游离多糖含量分别为24.31%、23.04%、24.44%和19.07%、17.80%、19.46%。结论采用H2O2氧化处理,HPAEC-CD检测,除了能对脑膜炎球菌多糖蛋白结合疫苗中微量A群多糖含量进行定量检测外,还能够进行游离多糖含量的检测。该方法灵敏度和精密度良好,操作简单、安全,对操作者及环境提供了保护。