重组质粒hTSHR转染低分化甲状腺癌细胞株后对摄碘能力及特异性基因表达的影响

Objective To investigate the changes of iodide uptake and the expression of thyroidspecific genes in poorly differentiated follicular thyroid carcinoma (FTC) cells after transfection of human TSH receptor (hTSHR) gene in vitro. Methods The recombinant eukaryotic expression plasmid PcDNA3. 1/hTSHR-cDNA was transformed into DH5a bacterial for amplification and then the recombinant plasmid was extracted. The recombinant was identified with PCR amplifying, restriction enzyme digestion analysis and DNA sequencing. The recombinant plasmid pcDNA3.1/hTSHR was transfected into FTC-133 cell line by lipofectin methodin vitro. Immunofluorescence, iodide uptake studies and real time-PCR were applied to detect target protein expression. Statistical analysis was performed with t-test using SPSS 13. 0 software. Results Kpn Ⅰ and Xba Ⅰ restriction enzyme digestion, PCR amplifying and DNA sequencing confirmed that pcDNA3. 1/hTSHR was successfully constructed. After transfection of the recombinant plasmid pcDNA3. 1/hTSHR-cDNA and the stimulation of hTSH, the tumor cells displayed the expression of hTSHR protein at cell surface and cytoplasm. The iodine uptake in pcDNA3. 1/hTSHR transfected cells was 2. 9 times higher than that of control(pcDNA3.1(+) transfected cells) group(t = 28.63, P ＜0. 01). The expression of TSHR,NIS, TPO and Tg (mRNA levels) in pcDNA3. 1/hTSHR transfected cells were also significantly elevated by 1.74 (t =5.959, P＜0.01), 7.2 (t =3.807,P＜0.05), 2.88 (t=4.769,P＜0. 01) and 2.67 times (t=6.388,P ＜0.01) respectively compared to those of the control group. Conclusion The study demonstrates that iodide uptake may be reactivated by hTSHR receptor gene transfection in poorly differentiated FTC cell.     

全反式维甲酸对甲状腺癌细胞NIS基因表达及摄碘水平的影响

目的探讨全反式维甲酸(ATRA)对甲状腺癌细胞株钠／碘同向转运体(NIS)基因表达及摄碘水平的影响。方法以不同浓度ATRA作用于3株甲状腺癌细胞(FIE-133、K1、8505C)，利用半定量逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测NIS mRNA表达，并测定细胞摄碘水平。结果ATRA在10^-7～10^-4mol／L范围内可剂量依赖性上调FTC-133细胞NIS mRNA的表达，增强FIE-133细胞的摄碘能力；ATRA在10^-6～10^-4mol／L范围内可上调K1细胞NIS mRNA的表达，并增加其摄碘水平；不同浓度组均未见8505C细胞NIS mRNA的表达和摄碘水平增加。结论ATRA可上调FIE-133、K1细胞NIS基因表达，提高其摄碘能力，这为ATRA用于分化型甲状腺癌的^131I治疗提供了实验依据。     

17-AAG对转染NIS基因的未分化甲状腺癌摄碘动力学的影响

目的 探讨17-丙烯胺基-17-去甲氧基格尔德霉素(17-AAG)对已转染NIS基因的未分化甲状腺癌(ATC)细胞摄碘动力学的影响.方法 采用脂质体转染法,将携带NIS基因的重组质粒pcDNA3.1-NIS转染入ATC细胞株FRO细胞中,G418抗性筛选获得稳定表达细胞系NIS-FRO.在NIS-FRO细胞的培养基中引入125I,进行125I内流及外流的系列实验,绘制时间-放射性曲线.进一步分析经1μmol/L的17-AAG作用24 h后NIS-FRO细胞125I内流及外流的变化,并与未经转染的细胞进行对比,2组间各个时间点的放射性计数采用两样本t检验进行统计学分析.结果 NIS-FRO细胞的摄125I能力明显提高,约为FRO细胞的10.68倍(t=45.329,P＜0.001),但去除孵育环境中的125I后30 min,细胞内的125I滞留率仅为初始的10.5％.1μmol/L的17-AAG作用于NIS-FRO细胞后24h,细胞摄125I能力进一步提高,在含125I的培养基中孵育20～60 min,其放射性计数为31771.8～54815.5 min-1,摄125I能力较对照组( 24020.3～41293.8)提高了24.8％～ 35.5％(t值依次为3.096、4.275、3.055、4.292和5.496,P均＜0.05);撤掉孵育环境中的131I后5～30 min,细胞内的125I滞留率为32.7％ ～85.2％,较对照组(10.5％～56.8％)明显增加(t值依次为22.801、13.096、19.631、38.205、43.519和29.322,P均＜0.01),125I的外流减少,30 min后17-AAG作用组的细胞内125I滞留率为32.7％,为对照组的3.1倍.结论 把NIS转染入ATC细胞后获得的稳定表达细胞株在经一定浓度的17-AAG作用后,可进一步提高肿瘤细胞的摄碘率,并可明显延迟碘的外流,提高细胞内碘的滞留率.     

131I对分化型甲状腺癌细胞核因子κB表达和功能的影响

目的 探讨131I对DTC细胞核因子κB(NF-κB)表达和功能的影响,以及1311和NF-κB抑制剂Bay 11-7082联合治疗的可行性.方法 用不同放射性浓度131I和不同浓度Bay 11-7082处理DTC细胞,加入四氮唑盐显色,测定450 nm的吸光度(A)值,用公式(A药物处理组- A空白)/(A对照组-A空白)×100％计算癌细胞存活率(A空白为空白孔的吸光度,A对照组为单纯细胞孔的吸光度);选择癌细胞存活率约60％左右的131I和Bay 11-7082浓度进行联合实验.将131I和Bay 11-7082作用于DTC细胞6、24和48 h后,提取核蛋白,分别与NF-κB结合序列探针相结合,测定450 nm的A值,NF-κB的DNA结合率=(A药物处理组-A空白)/(A对照组- A空白)×100％.用Western blot鉴定单用131I、Bay 11-7082和联合用药6h后NF-κB核蛋白相对表达水平的变化,并以β-actin作为内参对照进行半定量分析.用配对t检验、F检验和q检验进行统计分析.结果 细胞存活分析发现不同放射性浓度131 I和不同浓度Bay 11-7082处理后癌细胞的存活率不同(F=281.07和173.84,P均＜0.01);单用131I组、单用Bay 11-7082组与联合用药组癌细胞的存活率分别为(67.33 ±5.65)％、(61.83±6.68)％和(36.67±5.35)％,差异有统计学意义(F =45.79,P＜0.01),其中前2组分别与联合处理组相比q=8.20和8.35,P均＜0.01.DNA结合实验证实131I可以诱导癌细胞内NF-κB结合率增高,24h为(255.33±29.86)％(最高);而联合使用Bay 11-7082后,在6、24和48 h时间点能够抑制到相应刺激状态下NF-κB功能的22.10％、39.75％和43.18％,联合处理组与单用131I组比较,3个时间点差异均有统计学意义(t:24.58、26.29和8.20,P均＜0.01);6h时NF-κB p65功能受抑程度最明显,DNA结合率仅为(35.33±8.21)％,与对照组相比差异有统计学意义(t=28.98,P＜0.01).半定量分析:131I作用6h后p65和p50相对表达水平均升高,Bay 11-7082联合131I作用6h后两者的表达水平均受到明显抑制;不同给药方式作用后p65和p50的相对表达水平差异均有统计学意义(F=100.93和193.55,P均＜0.01),131I组和对照组两两比较,q=4.75和8.22,P均＜0.05,联合处理组与对照组两两比较,q=30.80和22.83,P均＜0.01.结论 131I会导致DTC细胞NF-κB表达增加、功能增强,联合使用NF-κB抑制剂可以抑制这种改变,获得协同疗效.     

重组人促甲状腺激素在131I治疗分化型甲状腺癌中的价值

目的 评价重组人TSH (rhTSH)介导DTC 131I清除甲状腺残余组织(简称清甲)治疗的安全性及有效性.方法 回顾性分析144例甲状腺全切或次全切术后接受131I清甲治疗的DTC患者.rhTSH替代组(Ⅰ组)72例使用rhTSH 0.9mg,1次/d,连续2d肌内注射;甲状腺激素撤退组(Ⅱ组)72例停用甲状腺素药物4～6周,2组均给予3.7 GBq 131I进行清甲.观察2组FT3、FT4、TSH和Tg的变化,同时观察患者怕冷、体质量增加、腹胀、便秘、动作迟缓、皮肤干燥、眶周水肿、骨痛等反应;根据131I全身显像结果,评价2组患者的131I清甲治疗效果,显像示甲状腺床区无放射性摄取或摄取率＜1％为一次清甲完全.数据比较行x2检验或t检验.结果 2组131I治疗前血清TSH水平均升高,Ⅰ组TSH明显高于Ⅱ组[(141.26±27.30)与(70.57±51.13) mU/L,t=2.435,P＜0.05],且Ⅰ组患者血清FT3、FT4水平无明显变化;2组131I治疗前血清Tg均升高.Ⅱ组患者发生不良反应统计:怕冷80.56％(58/72),体质量增加86.11％(62/72),便秘15.28％ (11/72),动作迟缓22.22％(16/72),皮肤干燥56.94％(41/72),骨痛2.78％ (2/72),无眼眶周围水肿者.Ⅰ组治疗安全性高,主要不良反应为:头晕恶心(2.78％,2/72),骨骼疼痛(2.78％,2/72),短暂性心动过速(1.39％,1/72).131I全身显像评价患者一次清甲完全率,Ⅰ组达70.83％ (51/72),Ⅱ组达66.67％(48/72),二者差异无统计学意义(x2 =0.58,P ＞0.05).结论 使用rhTSH能有效完成DTC131I治疗前准备,提高患者的生活质量,有利于残余甲状腺组织的清除.     

^131I对分化型甲状腺癌细胞核因子KB表达和功能的影响

目的探讨^131I对DTC细胞核因子KB（NF-KB）表达和功能的影响,以及^131I和NF-KB抑制剂Bay11-7082联合治疗的可行性。方法用不同放射性浓度^131I和不同浓度Bay11-7082处理DTC细胞,加入四氮唑盐显色,测定450nm的吸光度（A）值,用公式（A药物处理组-A空白）／（A对照组-A空白）×100％计算癌细胞存活率（A空白为空白孔的吸光度,A对照组为单纯细胞孔的吸光度）;选择癌细胞存活率约60％左右的^131I和Bay11-7082浓度进行联合实验。将^131I和Bay11-7082作用于DTC细胞6、24和48h后,提取核蛋白,分别与NF-KB结合序列探针相结合,测定450nm的A值,NF-KB的DNA结合率=（A药物处理组-A空白）／（A对照组-A空白）×100％。用Westernblot鉴定单用^131I、Bay11-7082和联合用药6h后NF-KB核蛋白相对表达水平的变化,并以B-actin作为内参对照进行半定量分析。用配对t检验、F检验和q检验进行统计分析。结果细胞存活分析发现不同放射性浓度^131I和不同浓度Bay11-7082处理后癌细胞的存活率不同（F=281．07和173．84,P均〈0．01）;单用^131I组、单用Bay11-7082组与联合用药组癌细胞的存活率分别为（67．33±5．65）％、（61．83±6．68）％和（36．67±5．35）％,差异有统计学意义（F=45．79,P〈0．01）,其中前2组分别与联合处理组相比q=8．20和8．35,P均〈0．01。DNA结合实验证实”。I可以诱导癌细胞内NF-KB结合率增高,24h为（255．33±29．86）％（最高）;而联合使用Bay11-7082后,在6、24和48h时间点能够抑制到相应刺激状态下NF-KB功能的22．10％、39．75％和43．18％,联合处理组与单用^131I组比较,3个时间点差异均有统计学意义（t：24．58、26．29和8．20,P均〈0．01）;6h时NF-KBp65功能受抑程度最明显,DNA结合率仅为（35．33±8．21）％,与对照组相比差异有统计学意义（t=28．98,P〈0．01）。半定量分析：^131I作用6h后p65和pSO相对表达水平均升高,Bay11-7082联合^131I作用6h后两者的表达水平均受到明显抑制;不同给药方式作用后p65和p50的相对表达水平差异均有统计学意义（F=100．93和193．55,P均〈0．01）,^131I组和对照组两两比较,q=4．75和8．22,P均〈0．05,联合处理组与对照组两两比较,q=30．80和22．83,P均〈0．01。结论^131I会导致DTC细胞NF-KB表达增加、功能增强,联合使用NF-（B抑制剂可以抑制这种改变,获得协同疗效。     

分化型甲状腺癌术后^131I清甲治疗方法的相关问题

分化型甲状腺癌（DTC）是最常见的甲状腺恶性肿瘤,其中包括乳头状甲状腺癌、滤泡状甲状腺癌和混合型甲状腺癌。治疗方法有手术治疗、^131I治疗和内分泌治疗。其中^131I治疗是甲状腺癌重要的治疗环节或步骤。随着对DTC术后^131I治疗方案的不断研究与探索,在重组人促甲状腺激素辅助,^131I清甲的应用、^131I清除大量残留的甲状腺叶组织、^131I清甲治疗碘剂量的选择等方面的认识与实践也不断更新。该文就以上几个清甲治疗方法的研究进行综述。     

人钠/碘同向转运体基因转染胶质瘤细胞介导放射性碘治疗的研究

目的 在体外细胞实验中证明转染人钠/碘同向转运体(hNIS)基因介导放射性碘治疗胶质瘤是有效的.方法 以脂质体转染法、用重组质粒将hNIS基因转染至人胶质瘤细胞株U251中.经过G418硫酸盐筛选获得稳定表达hNIS的细胞株(hNIS-U251),然后进行体外摄125I实验、NaClO4抑制实验、体外125I外流和内流实验,并绘制时间-放射性曲线.对经3700 MBq/L 131I处理的hNIS-U251细胞进行四甲基偶氮唑蓝(MTY)分析和流式细胞仪测定分析.两组间比较采用独立样本t检验,多组间比较用单因素方差分析(LSD法).结果 hNIS-U251细胞株可以摄取碘,其摄碘能力较U251细胞提高117倍左右[2种细胞所摄取125I分别为(50 469.88±997.29)和(432.92±89.28)计数·min-1].经131I处理后,hNIS-U251细胞株的细胞增殖活性低于U251细胞株,两者S期细胞比率(SPF)差异有统计学意义(t=35.5,P＜0.001);增殖指数(PI)差异有统计学意义(t=6.33,P＜0.05).结论 131I可以被hNIS-U251细胞摄取,而且可以有效地杀伤胶质瘤细胞.     

pEGFP-NeuroD重组质粒的构建及其在肝癌细胞中的表达

神经分化因子1(NeuroD-1)又名B细胞E盒转录激活因子2(Beta-2),属于B类碱性螺旋-环-螺旋(bHLH)转录因子家族.NeuroD-1蛋白与广泛存在的A类bHLH蛋白E47形成异二聚体,激活胰岛素基因的转录,对胰腺β细胞的发育及生理功能有重要作用,被认为是治疗糖尿病的候选基因之一.     

杆状病毒介导NIS基因放射治疗甲状腺癌的实验研究

目的探讨重组钠／碘同向转运体(NIS)基因杆状病毒介导甲状腺癌细胞放射性碘治疗的可行性。方法构建杆状病毒载体质粒(pFBNIS)并制备重组NIS杆状病毒(BacNIS)，体外感染甲状腺癌细胞，通过免疫荧光检测NIS蛋白的表达，通过动态摄碘及NaC104摄碘抑制实验观察表达蛋白的功能和特性；进行^131I杀伤细胞的克隆形成实验。结果成功构建了重组NIS杆状病毒，受巨细胞病毒(CMV)极早期基因启动子调控；BacNIS体外感染的甲状腺癌细胞表达的NIS蛋白具有摄碘功能和NaC104抑制的特性；BacNIs感染的肿瘤细胞可被^131I有效杀伤。结论BacNIS是介导肿瘤细胞摄碘的有效方法，为杆状病毒介导NIS基因治疗失分化甲状腺癌转移灶提供依据。     

重组NIS基因腺相关病毒的制备及其在甲状腺癌细胞系表达

目的探讨钠碘同向转运体（NIS）基因介导的甲状腺癌基因治疗的可行性。方法构建腺相关病毒载体质粒pGA—NIS，并采用磷酸钙沉淀法制备重组NIS基因的腺相关病毒rAAV—NIS，体外感染甲状腺癌细胞系FTC-133、8505C后，通过免疫荧光检测被感染细胞的NIS蛋白表达，并通过摄碘实验及NaClO4摄碘抑制实验验证其表达的NIS蛋白功能和特性。结果成功制备了重组NIS基因的rAAV—NIS，其感染肿瘤细胞所表达的NIS蛋白位于细胞膜上，且具有介导碘摄取的功能，以及被NaClO4抑制的特性，表明与正常甲状腺细胞的NIS具有相同的功能和特性。感染细胞的碘摄取较未感染细胞明显增高。结论rAAV—NIS能介导甲状腺癌细胞的碘摄取，为甲状腺癌NIS基因介导的基因治疗提供了实验依据。     

hTERT启动子调控hNIS基因介导肺癌细胞碘摄取和131I治疗的实验研究

目的 构建含人端粒酶反转录酶(hTERT)核心启动子调控的人钠/碘同向转运体(hNIS)基因重组腺病毒,并靶向转染至肺癌A549细胞中特异性表达.探讨hTERT启动子调控的hNIS基因介导放射性碘治疗肿瘤的可能性.方法 应用AdEasy系统构建重组腺病毒Ad-hTERT-hNIS,同时构建巨细胞病毒(CMV)启动子调控的hNIS重组腺病毒Ad-CMV.hNIS作为阳性对照,不含hNIS的重组腺病毒Ad-CMV作为阴性对照.应用反转录.聚合酶链反应(RT-PCR)方法验证hTERT在转染肿瘤细胞中的转录活性,摄碘实验检测表达的hNIS蛋白功能,细胞克隆形成实验评价131I对转染肿瘤细胞的毒性作用.结果 成功构建重组腺病毒Ad-hTERT-hNIS、Ad-CMV-hNIS及Ad-CMV,并经PCR验证正确.RT-PCR证实hNIS cDNA能从Ad-hTERT-hNIS转染的细胞中扩增出来.Ad-hTERT-hNIS和Ad-CMV-hNIS转染的肺癌A549细胞摄碘能力比阴性对照组Ad-CMV转染的细胞分别提高了23和31倍,且摄碘能力可以被NaClO4抑制.Ad-hTERT-hNIS和Ad-CMV-hNIS转染的肺癌A549细胞均可被131I杀死,2组细胞成活率分别为(31.2±1.45)%和(23.6±4.08)%,而阴性对照组和未转染病毒组分别为(89.0 ±2.99)%和(91.2 ±4.63)%.结论 hTERT启动子调控的hNIS重组腺病毒转染肿瘤细胞后,应用131I治疗有望成为一种新的基因靶向治疗手段.     

hTPO和hNIS共转染胶质瘤细胞U251介导放射性碘摄取的研究

目的 将人甲状腺过氧化物酶（hTPO）基因及人钠/碘同向转运体（hNIS）基因共转入胶质瘤细胞系U251后,研究其摄碘能力的变化.方法 克隆、重组、包装并扩增纯化得到重组腺病毒（AdTPO）,测定病毒滴度,Western-Blotting检测重组腺病毒的表达.使用脂质体转染法将hNIS基因转染入人胶质瘤细胞系U251中,经过G418硫酸盐筛选获得稳定表达hNIS的细胞系（hNIS-U251）,为hNIS-U251组;使用重组腺病毒将hTPO基因转导入hNIS-U251中,使胶质瘤细胞获得hTPO基因（AdTPO-hNIS-U251）,为AdTPO-hNIS-U251组;未转入hTPO和hNIS的细胞为对照组（U251）.然后进行3组稳定表达细胞系体外摄125I实验及体外125I外流实验.3组间两两比较用q检验（Newman-Keuls法）.结果 AdTPO-hNIS-U251细胞、hNIS-U251细胞和U251细胞所摄取125I分别为（74 647.53±3605.88）、（55 769.96±4353.26）和（507.67±57.69）计数/min,3组间差异有统计学意义（F=836.17,P＜0.01）.AdTPO-hNIS-U251组较对照组（U251）摄125I能力增高约147倍（q=55.64,P＜0.01）,hNIS-U251组较对照组（U251）摄碘能力增高约110倍（q=41.47,P＜0.01）.AdTPO-hNIS-U251组较hNIS-U251组高约1.3倍（q=14.17,P＜0.01）.在体外125I外流实验中证实AdTPO-hNIS-U251组125I外流减慢,其有效半衰期延长至13 min.结论 将hTPO和hNIS基因共转染至胶质瘤细胞系U251后,能有效提高U251的摄碘能力.     

维甲酸诱导甲状腺癌细胞摄碘的实验研究

目的探讨全反式维甲酸(ATRA)诱导甲状腺癌细胞系的钠碘同向转运体(NIS)表达及其碘摄取。方法通过ATRA诱导甲状腺癌细胞系滤泡状甲状腺癌细胞株(FIE-133)、乳头状甲状腺癌细胞株(W3)及未分化甲状腺癌细胞株(8505C)后，经逆转录．聚合酶链反应(RT-PCR)及Western blot检测甲状腺癌细胞系的NIS mRNA及其蛋白质表达，并测定甲状腺癌细胞系诱导后的摄碘变化。结果ATRA诱导甲状腺癌细胞系48h后，FTG-133和W3的NIS mRNA及蛋白质表达增高，8505C未见变化；ATRA诱导甲状腺癌细胞系2周后．FTC-133和W3的摄碘增高。结论ATRA能诱导分化型甲状腺癌细胞摄碘增高，为ATRA诱导分化治疗甲状腺癌提供了依据。     

青少年分化型甲状腺癌与131Ⅰ治疗

青少年分化型甲状腺癌发病率不高,但与成人分化型甲状腺癌相比,具有一些鲜明的特征:发现时往往体积较大,诊断时多出现颈部淋巴结或远处转移,肿瘤细胞钠.碘转运体表达数量和频率多,治疗后复发率高,尽管如此,其总体存活率较高.手术后131Ⅰ去除残余甲状腺组织和131Ⅰ治疗远处转移依然是治疗青少年分化型甲状腺癌的重要手段.     

131I-17-丙烯胺基-17-去甲氧基格尔德霉素对人乳腺癌细胞生长的抑制作用

目的 探讨^131I-17-丙烯胺基-17-去甲氧基格尔德霉素（17-AAG）对人乳腺癌细胞生长的影响及其相关机制。方法 采用过氧化氢标记法制备^131I-17-AAG。细胞杀伤实验分为5组：二甲基亚砜（DMSO）对照（A）组，Na^131I370kBq（B）组，17-AAG2．5mg／L（C）组，^131I-17-AAG370kBq（D）组，^131I-17-AAG370kBq＋17-AAG2．5mg／L（E）组。用四甲基偶氮唑蓝（MTT）法检测各种药物对人乳腺癌细胞MCF-7的生长抑制作用，流式细胞术分析细胞凋亡及细胞周期变化，RT—PCR检测药物处理前后MCF-7细胞中Akt2基因的mRNA表达情况。结果 ^131I-17-AAG的标记率为83％，放化纯为96．6％，比活度为1．48×10^5MBq／μmol。各组药物对细胞的杀伤呈时间效应，随着时间的延长，细胞的抑制率都呈明显上升趋势，尤以E组趋势明显。A～E组药物作用48h后，通过亚G1峰检测MCF-7细胞凋亡率分别为（1．54±0．13）％，（5．72±1．05）％，（12．97±1．44）％，（20．65±1．36）％，（35．39±4．15）％，各组细胞凋亡率差异有统计学意义（P均〈0．05）。C组，D组及E组Akt2基因的mRNA表达均比A组降低，其中E组降低尤为明显。结论 ^131I-17AAG能够抑制MCF-7细胞的生长并促进其凋亡，且能有效抑制Akt2基因的mRNA表达，和17-AAG联合应用能够增强肿瘤细胞对放疗的敏感性。