鼠间充质干细胞向成骨细胞定向诱导分化的研究

目的:探讨干细胞向成骨细胞诱导分化的特征。方法:利用成骨细胞诱导体系诱导小鼠骨髓间充质干细胞系(D1细胞)向成骨细胞定向分化,D1细胞诱导不同时间后,运用免疫组化方法检测碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP),Ⅰ型胶原(typeⅠcollagen,COL1)的表达;RT-PCR检测Osterx和OCN mRNA的表达。结果:细胞诱导培养3、7、14和21 d后结果显示:3 d时ALP、COL1呈阴性表达,7 d ALP呈阳性表达,14 d ALP表达最高,21 d ALP表达明显减少;7 d COL1呈阳性表达,14 d和21 d表达显著增强;14 d有矿化结节形成,21 d形成典型的矿化结节。7 d时OSX和OCN基因表达上调,14 d时OSX基因表达下调,21 d其表达上调;14 d时OCN表达上调,21 d后表达下调。结论:间充质干细胞能定向诱导为成骨细胞,OSX基因的表达是其分化的关键。     

人骨髓间充质干细胞定向诱导分化为脂肪细胞

探讨人骨髓间充质干细胞（hMSCs）体外分离培养、鉴定以及分化。认为hMSCs在体外很容易分离培养和扩增,成人骨髓间质干细胞在体外可以分化为脂肪细胞。     

体外诱导人脐带华通胶间充质干细胞向内皮细胞分化过程中APJ表达变化

目的研究人脐带华通胶间充质干细胞（human umbilical cord Wharton′s Jelly mesenchymal stem cells,HUW MSCs）体外诱导向内皮细胞分化过程中表面APJ受体表达的变化,探讨APJ是否可作为鉴定内皮细胞的早期细胞表面标志物。方法剖宫产取脐带后分别用酶消化和组织贴壁法培养获得脐带华通胶间充质干细胞,用酶消化法获得人脐静脉内皮细胞（human umbilical vein endothelial cells,HUVECs）。取2×107第2代HUW MSCs用单克隆APJ APC荧光抗体标志后行流式分选,测定HUW MSCs实验前细胞表面表达APJ的水平。实验分3组：诱导组MSCs用含血管内皮细胞生长因子5 μg/L、碱性成纤维细胞生长因子10 μg/L、表皮生长因子10 μg/L和10%胎牛血清（fetal bovine serum,FBS）M199培养基培养;共同培养组MSCs先与HUVECs在Transwell 6孔培养板中,用含10%FBS的M199培养5~7 d后转入25 cm2培养瓶中继续培养,培养液为含10%FBS的M199和培养1 d内皮细胞的M199（2∶1）混合培养基;单纯培养组细胞培养基为含10% FBS的M199。培养周期为14 d。分别于第7、10、14天流式检测各组细胞APJ表达水平,同时检测内皮细胞表面APJ水平作为阳性对照。另外于第7、14天检测3个实验组、内皮细胞组、HUW MSCs组内皮细胞早期标志物CD309表达变化情况,比较各实验组之间APJ与CD309变化趋势。结果HUW MSCs流式分选出5×103APJ+ HUW MSCs,表面表达APJ基本呈阴性。诱导组、共同培养组和单纯培养组细胞形态均较HUW MSCs有显著改变,诱导组呈圆形、线性、网状,共同培养、单纯培养组细胞呈卵圆形、长梭形。另外,诱导组生长最快,增殖能力最强;单纯培养组次之;共同培养组细胞生长缓慢,增殖能力最弱。第7、10、14天,3组细胞CD309表达分别为诱导组18%、26%和88%,共培养组05%、25%和47%,单纯培养组03%、21%和27%。第7、10、14天各组APJ阳性表达率分别为诱导组05% 、09%和52%,共培养组04%、08%和30%,单纯培养组02%、06%和21%。结论HUW MSCs表面APJ表达基本呈阴性,HUW MSCs向内皮细胞诱导分化过程中APJ表达逐渐上调,与内皮细胞早期标志物CD309变化趋势基本一致,可作为早期内皮细胞鉴定的标志物。     

人脐带间充质干细胞的生物学特性、分化及应用研究

间充质干细胞是一类存在于多种组织、具有高度自我更新能力和多向分化潜能的细胞。由于作为间充质干细胞（mesenchymal stem cell,MSC）经典来源的骨髓组织,可随老化而致干细胞含量及其增殖能力显著降低^[1],而且其标本需要通过骨髓穿刺来获取,是一个侵袭性、有创伤、易污染的过程。因此,寻找新的MSC来源有着重要意义。     

重组腺病毒介导noggin诱导骨髓问充质干细胞向神经细胞分化

目的 探讨体外分离、培养大鼠间充质干细胞(MSCs)的方法 ,采用重组腺病毒介导的noggin基因体外诱导方法 ,观察MSCs向神经细胞的定向分化效应.方法 原代培养MSCs 24h开始贴壁,呈梭形,集落样生长,纯化后,采用含noggin基因的重组腺病毒(pAdEasy-1-noggin)感染原代培养的MSCs,诱导骨髓MSCs分化为神经细胞.用鉴定神经特异性烯醇化酶(NSE)、神经元核抗原(NeuN)、神经丝蛋白(NF-200)和胶质纤维酸性蛋白(GFAP)的免疫细胞化学方法 对诱导后的细胞进行鉴定.结果 倒置显微镜下观察可见,MSCs经重组腺病毒感染后48h,细胞向神经细胞分化,胞体呈锥形、多角形,由胞体伸出较长的轴突样和树突样突起,且有分支.免疫组织化学鉴定显示,诱导后的细胞能特异性表达NSE、NeuN和NF-200,而GFAP表达阴性.结论 利用密度梯度离心法结合贴壁法可以获得比较纯的MSCs;noggin基因重组腺病毒载体可成功诱导骨髓间充质干细胞向神经元样细胞分化.     

人转化生长因子β_2基因转染诱导脂肪间充质干细胞向软骨细胞定向分化的实验研究

目的:探讨脂肪间充质干细胞作为软骨组织工程的种子细胞和基因增强的组织工程的可行性。方法:取3周龄Lewis大鼠的腹股沟脂肪垫,消化法获得脂肪间充质干细胞,通过脂质体介导,将hTGFβ2基因转染到体外培养的脂肪间充质干细胞中,采用免疫组织化学染色、RT-PCR和Western blotting的方法检测目的基因与软骨特异性蛋白——Ⅱ型胶原和蛋白多糖表达的情况。结果:从成体大鼠脂肪组织中培养出脂肪间充质干细胞,体外培养呈成纤维细胞样,能大量稳定增殖传代。原代脂肪间充质干细胞能自发分化为脂肪细胞,传代细胞在胰岛素和地塞米松的作用下生成脂滴向脂肪细胞分化;hTGFβ2基因转入脂肪间充质干细胞能获得瞬时及稳定表达,并促使Ⅱ型胶原和蛋白多糖合成。结论:从脂肪组织中可获得具有多分化潜能的间充质干细胞,并能在体外稳定增殖传代,可自发或经诱导后分化为脂肪细胞;pcDNA3.1(+)/hTGFβ2真核表达载体成功转染脂肪间充质干细胞,诱导其向软骨细胞分化。     

特定微环境诱导人脐带沃顿胶间充质干细胞向汗腺样细胞分化的实验研究

目的鉴定人脐带沃顿胶间充质干细胞(hUCWJ-MSCs)经汗腺诱导培养基培养后向汗腺样细胞分化的潜能。方法酶消化法分离培养人正常汗腺细胞,热休克汗腺细胞后收集培养基上清液,按10%的体积分数配制汗腺分化诱导培养基。酶消化法分离获取hUCWJ-MSCs,流式细胞仪分析细胞表型特征;成骨诱导培养基和成脂诱导培养基中培养2～3周后采用碱性磷酸酶染色和油红-O染色对其分化潜能进行鉴定;在汗腺诱导培养基中培养3周,倒置显微镜观察细胞形态变化,分别收集培养1、2、3周时的细胞,采用免疫组织化学和流式细胞术检测汗腺标记物CEA、CK14、CK19的表达,RT-PCR检测汗腺发育基因(EDA)的表达。结果正常汗腺细胞呈铺路石状克隆样增生。hUCWJ-MSCs呈梭形、成纤维细胞样,流式细胞分析显示其CD44、CD105、CD34、CEA阳性率分别为97.37%9、6.26%、0.56%0、.52%;经成骨诱导培养基和成脂诱导培养基培养2～3周后,可诱导成为油红-O染色阳性的脂肪细胞和碱性磷酸酶染色阳性的骨细胞;在汗腺诱导培养基中培养3周后,细胞具有类似汗腺样结构,免疫组织化学DAB显色结果显示分化后的hUCWJ-MSCs表达汗腺细胞标记物CEA、CK14、CK19,流式细胞仪检测其阳性率分别为54.37%、60.25%、62.13%,RT-PCR结果显示其可较高水平地表达EDA基因。结论 hUCWJ-MSCs具有向汗腺样细胞分化的潜能。     

人骨髓间充质干细胞的培养及向软骨细胞分化

为建立分离纯化、大鼠扩增人骨髓间充质MSC，改进其冰冻保存的方法，并初步探索其体内向软骨细胞分化的最佳方法，以Percoll(1.073g/ml）密度梯度离心法分离人骨髓中单个核细胞，用含经筛选的10％的胎牛血清的低糖DMEM体外培养扩增骨髓干细胞（MSC），FCM鉴定细胞纯度，传代2次以后的细胞吸附于明胶海绵内，以TGF－β为主要刺激因子体外诱导1周，植入裸鼠皮下。在不同的时间取出组织块，甲苯胺蓝染色显示细胞外基质。结果发现，体外培养扩增的人间充质MSC表达CD166、CD29、CD44等表面抗原，不表达CD34、CD45、HLA－DR等抗原；MSC可以不经消化，直接在原培养瓶内冻存在－70℃低温冰箱，3个月后复苏的细胞生物学特性没有明显改变；体外诱导的细胞植入裸鼠皮下4周后即出现软骨细胞特有的结构。说明骨髓MSC具有独特的生物学特征，体外培养的MSC具有体内成软骨能力，应用MSC构建软骨组织具有一定的可行性。     

骨髓间充质干细胞培养并向骨骼肌诱导分化的实验研究

目的 研究大鼠骨髓间充质干细胞（BMSCs）的定向分化及其在体内的形态发育情况。方法 Wistar大鼠24只，向其左胫前肌处注射0．2ml无水乙醇，致其无菌坏死，右胫前肌注射等渗盐水0．2ml作为对照，制成动物模型后备用；取大鼠第3代BMSCs，5-氮杂胞苷、成肌调节因子（MyoD）、转化生长因子-β1（TGF-β1）、胰岛素样生长因子-1（IGF-1）联合进行诱导分化。诱导后第9天，收集BMSCs，用BrdU标记并诱导后注射到大鼠双下肢胫前肌处，分别在3，6，9和12d取材进行形态观察和免疫组织化学检查。结果 注射诱导后3d，实验组的成活率明显高于注射单纯注射BMSCs的对照组，BrdU标记细胞向骨骼肌分化，结蛋白、骨骼肌特异肌球蛋白均为弱阳性表达，6，9d可见BrdU标记细胞向骨骼肌分化，结蛋白、骨骼肌特异肌球蛋白阳性表达，第9天更为明显，注射后12d后可见新生骨骼肌细胞形成肌小管，细胞核结蛋白、骨骼肌特异肌球蛋白强阳性表达。结论 大鼠损伤肌肉的微环境中，BMSCs可向骨骼肌定向分化，并伴有结蛋白和骨骼肌肌球蛋白阳性表达；定向诱导后BMSCs在体内成活率高，增殖速率快，向骨骼肌分化纯度更高。     

骨髓间充质干细胞体外诱导分化研究进展

骨髓间充质干细胞(MSC)是存在于骨髓中的具有高度自我更新能力和多向分化潜能的干细胞群体,MSC既具有干细胞的特性又具有明显的可塑性,获取简便,体外培养条件不高,分离增殖能力强,可以自身获取,因此它可以作为种子细胞。与造血干细胞相比,MSC在疾病治疗上更为理想。目前MSC及其在组织工程方面的研究已取得较大进展。     

人脐带源间充质干细胞体外成脂、成骨、成软骨诱导分化

目的体外分离培养脐带来源间充质干细胞,确定其向脂肪、骨、软骨细胞的分化能力。方法取新鲜的脐带组织,剔除脐动静脉,剩余部分剪成极为细小的组织块,02%Ⅱ型胶原酶37℃静止消化17 h,用含10%胎牛血清的达尔伯克改良伊格尔培养基/Ham′s F12培养基终止消化,培养3~5 d后得到较为均一的贴壁细胞。取第3代细胞做流式检测,并定向诱导分化,14 d后成脂、成骨染色鉴定,21 d后取诱导分化的细胞团做冰冻切片,阿尔法蓝染色软骨鉴定。结果体外培养的间充质干细胞高表达CD29、CD13、CD90、CD105、CD44等间充质细胞标志物,不表达CD34、CD45、人类白细胞抗原DR等造血细胞标志物;诱导分化后油红O染色、冯库萨染色均为阳性,冰冻切片阿尔法蓝染色呈明显阳性。结论人脐带间充质干细胞在体外能够培养并定向分化为脂肪、骨、软骨细胞。     

骨髓间充质干细胞成骨定向分化的研究进展

就骨髓间充质干细胞的形态和表面分子特征、体外成骨定向分化的特性及影响因素等方面的研究进展作一综述 ,并初步探讨了骨髓间充质干细胞在骨组织工程中的应用前景。     

骨向分化骨髓间充质干细胞的免疫学特性研究

目的 探讨骨向分化骨髓间充质干细胞(bone mesenchymal stem cells,BMSCs)的免疫学特性. 方法 正常成人骨髓分离的BMSCs在骨向诱导培养基中培养2周后,将未分化的BMSCs和骨向分化的BMSCs与同种异体T淋巴细胞、植物血凝素(PHA)共培养,MTT法检测T淋巴细胞的增殖情况;ELISA法测定骨向分化2周的BMSCs上清以及共同反应5d的混合淋巴细胞反应(mixed lymphocytes reaction,MLR)上清转化生长因子(transforming growth factor -β1,TGF -β1)的浓度,并通过加入抗TGF-β抗体检测MLR情况. 结果 无论是未分化的BMSCs还是骨向分化的BMSCs都不会引起同种异体T淋巴细胞的增殖,并且都能抑制PHA诱导的T淋巴细胞增殖.MLR中的TGF -β1浓度显著升高.抗TGF-β抗体能够抵消骨向分化的BMSCs免疫抑制作用. 结论 骨向分化的BMSCs具有低免疫原性和免疫抑制特性.     

AdEasy1／Cbfa1诱导间充质干细胞向成骨细胞分化的实验研究

目的：观察核心结合因子a1（Cbfa1）对兔骨髓间充质干细胞（MSCs）向成骨细胞分化的诱导作用。方法：体外分离培养兔骨髓MSCs，用AdEasy1／Cbfa1。转染MSCs，在转染后3d,1、2、3和4周时，组织化学和免疫组化等方法检测成骨标志碱性磷酸酶和骨钙素的表达。结果：AdEasy1／Cbfa1转染后的兔骨髓MSCs表现出与成骨细胞相似的形态，并且表达碱性磷酸酶和骨钙素。结论：Cbfa1可诱导兔骨髓MSCs向成骨细胞分化。     

瘀胆血清体外诱导骨髓间充质干细胞向肝细胞分化的实验研究

目的探讨骨髓间充质干细胞（MSCs）体外诱导其分化为肝细胞的可行性。方法分离、纯化并鉴定大鼠骨髓MSCs,制备正常及瘀胆大鼠血清,取第3代MSCs分组培养：A组：DMEM＋10％FBS;B组：肝细胞生长培养基（HGM）＋5％FBS0、组：HGM＋5％正常大鼠血清;D组：HGM＋5％瘀胆大鼠血清;E纽：HGM＋5％瘀胆大鼠血清＋25ug／LHGF。观察各组细胞形态变化,MTT法测定细胞生长曲线,采用RT～PCR检测甲胎蛋白（AFP）和细胞角蛋白18（CK18）的表达,溴甲酚绿法检测上清液中白蛋白（ALB）的含量。结果培养过程中,D、E组出现多角形及双核细胞,A、B、C组细胞形态无明显变化。生长曲线显示细胞生长速度C组最快,D、E组均较B组快（P〈0．05）。D、E组于诱导第7,14天出现AFPmRNA阳性表达,第14,21天出现CK18mRNA阳性表达,D、E组上清波中白蛋白浓度随诱导时间延长逐渐升高,且E组高于D组（P〈0．05）。A、B、C组未见AFP、CK18表达及白蛋白浓度变化。结论正常大鼠血清能明显促进MSCs的增殖;瘀胆血清对MSCs有一定促增殖作用,且能有效诱导其向肝细胞分化,联合使用HGF能提高分化率。     

BMP12诱导恒河猴骨髓间充质干细胞定向分化为腱细胞

目的研究骨髓间充质干细胞定向分化为腱细胞的可能性。方法通过电穿孔法将外源基因BMP12导入骨髓间充质干细胞中，诱导骨髓间充质干细胞定向分化为腱细胞；在形态学和分子生物学水平上对诱导后的细胞加以鉴定。结果光镜下，诱导后的细胞形态发生明显改变；RT-PCR结果表明，诱导后的细胞有BMP12和Collagen Ⅰ的mRNA表达，而没有Coilagen Ⅲ的mRNA表达；诱导后98.39％的细胞呈CD44^ 、HLA-DR^-。结论BMP12能够诱导骨髓间充质干细胞定向分化为腱细胞，间充质干细胞有可能成为肌腱组织工程种子细胞来源之一。     

人脐带组织间充质干细胞研究进展及应用前景

近年来对间充质干细胞（mesenchymal stem cells,MSCs）的研究越来越多,MSCs可以从骨髓、脂肪组织、肾和各种胎儿组织中提取,并能横向分化成成骨细胞、脂肪细胞和神经细胞等不同胚层的细胞。人脐带组织间充质干细胞是一类具有自我更新、增殖和多向分化潜能的干细胞,与其他来源的MSCs相比,具有来源广泛,易于采集、保存和运输,无异体排斥,避免伦理争议等诸多优点。本文就其生物学特征、优势以及临床应用前景等予以综述。     

脐带间充质干细胞与类风湿性关节炎

类风湿性关节炎(rheumatoid arthritis,RA)是一种病因不明的慢性、消耗性、反复发作、以关节症状为主的自身免疫性疾病。多发于女性,其发病率国内尚无精确的统计,估计在1.08%左右,欧美国家的发病率约为0.5%～3.0%。典型的临床表现为反复发作的对称多发性小关节炎,以手、腕、足、膝等关节最常受累。早期可有红、肿、热、痛和关节功