丹参肉桂醇脱氢酶基因（SmCAD）的克隆及表达分析

肉桂醇脱氢酶（cinnamyl alcohol dehydrogenase,CAD）依赖于NADPH还原肉桂醛及其衍生物,是催化木质素单体生物合成途径的最后一步关键酶。通过分析丹参转录组数据库,从丹参中获得一条肉桂醇脱氢酶基因,命名为SmCAD（Genebank注册号：HQ162287）。该序列包含一个长为1083 bp的开放阅读框,有3个内含子和4个外显子,编码360个氨基酸,含有NADP（H）结合域,Zn1和Zn2锌结合位点。利用BD walking的方法获得其启动子序列1202 bp,序列分析结果表明,SmCAD启动子区包含茉莉酸甲酯（MeJA）、脱落酸（ABA）、赤霉素（GA3）响应元件以及MYB结合位点。利用实时荧光定量PCR分析表明,该基因在丹参根、茎、叶中均有表达,且其表达受到MeJA的诱导和GA3的抑制,推测该基因可能参与了丹参对外源信号的应答反应。研究结果可为进一步研究SmCAD基因在丹参中的具体功能提供理论依据。     

孝顺竹肉桂醇脱氢酶基因的克隆及表达研究

肉桂醇脱氢酶(cinnamoyl alcohol dehydrogenas,CAD)是木质素生物合成过程中的一类关键酶.采用RT-PCR及RACE方法从孝顺竹笋中分离出CAD基因家族的一个基因,cDNA全长是1131 bp(GenBank注册号为GU985522),含有一个1 107 bp的读码框,编码一个368 aa...     

水芹肉桂醇脱氢酶基因的克隆与表达特性分析

以‘八卦洲水芹’及其紫色叶柄突变型水芹‘南选八卦洲紫水芹’为实验材料,利用RT-PCR方法从‘南选八卦洲紫水芹’中克隆得到水芹肉桂醇脱氢酶(CAD)基因,命名为OjCAD。OjCAD基因开放阅读框长为1 074bp,编码357个氨基酸。OjCAD蛋白相对分子质量为39 143.10,理论等电点为6.91,属于MDR家族。系统进化分析显示,水芹OjCAD与同属伞形科的胡萝卜CAD进化关系最近,具有高度保守性。OjCAD编码的蛋白属于疏水蛋白,空间结构主要由7个α-螺旋和17个β-折叠组成。实时定量PCR分析显示,OjCAD基因在紫色和非紫色水芹的叶片和叶柄中相对表达量存在差异,水芹OjCAD基因在叶片中的表达量显著高于叶柄,在‘八卦洲水芹’中的表达量高于‘南选八卦洲紫水芹’。该研究结果为进一步分析水芹木质素生物合成奠定了基础。     

胡萝卜肉桂醇脱氢酶基因的克隆及其对非生物胁迫的响应

该实验采用RT PCR技术,从胡萝卜‘黑田五寸’中克隆获得了编码肉桂醇脱氢酶（Cinnamyl alcohol dehydrogenase, CAD）的基因DcCAD。DcCAD序列长1 074 bp,编码357个氨基酸。亲水/疏水性分析表明,DcCAD属于亲水性蛋白。系统进化分析显示,DcCAD与番茄CAD（XP_010314515.1）亲缘关系最近。荧光定量PCR结果显示,DcCAD基因在胡萝卜根、叶片和叶柄中的表达量差异显著,其相对表达量为叶片＞根＞叶柄。DcCAD基因对高温（38 ℃）、低温（4 ℃）、干旱（20% PEG）和盐（0.2 mol·L^-1 NaCl）胁迫均有响应,尤其对高温胁迫和低温胁迫响应明显,而且高温处理后1 h和低温处理后2 h表达量最高。研究推测,DcCAD基因对胡萝卜抗逆性具有一定的作用。     

植物肉桂醇脱氢酶及其基因研究进展

肉桂醇脱氢酶(cinnamyl alcohol dehydrogenase,CAD)作为植物次生代谢特别是木质素合成的关键酶,与植物生长发育和抵御病原菌入侵关系密切,研究CAD基因表达调控及其与组织木质化的关系具有重要的植物生理学意义.该文综述了植物CAD的蛋白特征、酶学性质、基因分布和分类、基因结构和表达调控以及CAD表达与木质素合成的关系,为研究CAD在植物生长发育和抗病中的作用提供理论指导.     

酵母醇脱氢酶辅酶结合结构域基因片段的克隆与表达

本文报道应用重组ＤＮＡ方法对酵母醇脱氢酶结构基因－功能片段的定向克隆与表达。应用聚合酶链反应技术实现了对ＹＡＤＨ组成型同工酶ＡＤＨＩ结构基因中编码ＮＡＤ结合结构域的一段约４００ｂｐ的基因片段的定向克隆。     

‘三红蜜柚’CmCAD基因的克隆与表达分析

为了探究CmCAD基因在‘三红蜜柚’果实发育过程中的作用与表达规律,该研究以‘三红蜜柚’果实为材料,利用反转录PCR技术克隆获得3个‘三红蜜柚’CmCAD基因,分别命名为CmCAD1、CmCAD3和CmCAD4。对这3个基因所编码的蛋白进行了生物信息学分析,研究了它们在不同品种蜜柚及‘三红蜜柚’果实生长发育阶段的表达模式。结果表明:克隆得到的3个CmCAD基因cDNA长度分别为1 032 bp、1 080 bp和1 071 bp,编码344、360和357个氨基酸;生物信息分析发现3个CmCAD基因编码的蛋白含有相同的保守结构域,均有跨膜螺旋结构与磷酸化位点;系统进化树分析表明,CmCAD1、CmCAD3和CmCAD4分别与甜橙CsCAD1、拟南芥AtCAD9和甜橙CsCAD4的亲缘关系最近。实时定量PCR分析结果显示,3个CmCAD基因在不同品种蜜柚果实生长过程中表达水平存在差异,且3个CmCAD基因在‘三红蜜柚’果实发育过程中的表达规律也有所不同。研究推测,CmCAD4具有一定的潜在功能,可能参与调控‘三红蜜柚’果实中木质素的合成,但基因的具体功能与调控机理还需进一步探索。     

新疆核桃WJ-CAD和ZJ-CAD基因克隆及时空表达表达分析

肉桂醇脱氢酶(CAD)是木质素生物合成中最后一步反应酶。本研究采用RT-PCR技术克隆露仁核桃WJ-CAD基因和硬壳完整核桃ZJ-CAD基因,研究CAD基因在硬壳完整和露仁核桃内果皮中发育过程中的表达特性。WJ-CAD基因cDNA序列含有788 bp ORF,编码258个氨基酸,分子量84.57 kD,理论等电点5.05;ZJ-CAD基因cDNA序列含有666 bp ORF,编码332个氨基酸,分子量81.93 kD,理论等电点5.09;对所编码的蛋白预测分析表明均属于FrmA超基因家族;实时荧光定量PCR结果表明,WJ-CAD基因的相对表达量整体呈现下降-上升-下降的趋势,ZJ-CAD基因的相对表达量整体均呈现上升-下降-上升-下降的趋势,2个基因均在花后65 d表达量达到最高峰,其后期表达量均较低,CAD基因在"温138"核桃内果皮中的表达量远低于同期"纸皮"的表达量。推测"温138"核桃露仁现象由于花后65 d后木质素合成量降低,导致缺乏木质素的积累或影响木质素单体的组成,从而造成内果皮发育不完整(露仁),初步证明CAD基因参与调控木质素合成,露仁现象可能由于硬核期缺乏木质素的积累。     

香蕉胁迫相关蛋白基因的克隆及其表达分析

通过随机克隆测序的方法从香蕉根系cDNA文库中获得胁迫相关蛋白基因,命名为MaSAP1(GenBank登录号为AGH14257.1)。扩增获得的cDNA序列与质粒OZ092的目的片段序列一致,表明MaSAP1是香蕉SAP基因编码框全长cDNA,包含一个510bp的最大开放阅读框,编码一个长169个氨基酸的蛋白质。蛋白质序列同源比对发现其含有完整的A20和AN1基序结构。系统进化树比对分析表明,MaSAP1与水稻和獐茅的亲缘关系较近。组织特异性研究表明,MaSAP1基因在香蕉根和果实中的表达量较高,在茎中的表达量最低。实时荧光定量PCR分析表明MaSAP1响应激素的处理,同时也响应干旱、低温、高盐和枯萎病菌的侵染等胁迫。可见,MaSAP1基因在植物生长发育和植物响应逆境中具有重要作用。     

蒙古冰草肉桂醇脱氢酶基因序列鉴定及功能分析

肉桂醇脱氢酶(CAD)作为植物次生代谢尤其是木质素生物合成过程的关键酶,在调控植物生长发育和抵御生物/非生物胁迫等过程中发挥关键作用。蒙古冰草(即沙芦草(Agropyron mongolicum))耐旱耐寒,在我国北方荒漠草原区域广泛分布。为探讨CAD基因在蒙古冰草木质素合成和非生物胁迫抗性中的作用,从蒙古冰草全长转录组数据中筛选并克隆到1个CAD基因,序列长度1 083 bp,命名为AmCAD。该基因编码361个氨基酸残基,同源序列比对发现蛋白质序列保守区域含有2个Zn²⁺结合基序和NADP(H)辅因子结合基序,属于典型的CAD蛋白,且三维结构与AtCAD5相似。AmCAD在茎秆中高表达,对AmCAD重组蛋白的酶学性质分析表明,该蛋白对不同肉桂醛类底物均具有很强的催化能力,其中对松柏醛和芥子醛的底物亲和力更强。用不同浓度甘露醇模拟干旱胁迫,蒙古冰草AmCAD基因表达受到显著诱导。研究结果表明,AmCAD在蒙古冰草木质素合成和干旱胁迫抗性中发挥重要作用,可为提高蒙古冰草品质和抗逆性分子育种提供有价值的基因资源。     

香蕉中4条乙醇脱氢酶基因的克隆及表达分析

该研究采用RACE技术从香蕉中克隆了4条乙醇脱氢酶基因——MaADH1(GenBank No.KM253748)、MaADH2(GenBank No.KM253749)、MaADH3(GenBank No.KM253750)、MaADH4(GenBank No.KM253753),且在核苷酸水平上4条基因与2A基因组中的乙醇脱氢酶同源性较高;遗传进化树分析显示,MaADH2、MaADH3和MaADH4属于乙醇脱氢酶第I类,而MaADH1不属于第I类,也不属于第Ⅲ类。半定量RT-PCR分析显示,4条基因在不同器官中的表达量不同;不同激素、不同非生物胁迫以及生物胁迫处理后4条基因的表达显示,MaADH2受ABA、乙烯、茉莉酸、水杨酸、干旱和涝害诱导表达,最大表达量分别为 19.14、 428.19、 68.21、 61.79、53.73和108.43;MaADH3受盐胁迫诱导表达,最大表达量为220.27;MaADH1和MaADH4在不同处理后的表达量变化不明显。研究表明,在香蕉中MaADH2可以作为ABA、乙烯、茉莉酸、水杨酸、干旱和涝害的标记基因,MaADH3可以作为盐害的标记基因。     

茶树醇脱氢酶基因的表达特征及番茄遗传转化分析

根据茶树醇脱氢酶基因(CsiADH1)的cDNA序列设计引物,采用RT-PCR方法从茶树品种‘龙井43’中克隆了CsiADH1序列,分析了CsiADH1在生物和非生物胁迫下的诱导表达情况并转化番茄。结果表明:CsiADH1包含一个1 044bp的最大开放阅读框,编码347个氨基酸。qRT-PCR分析显示,CsiADH1的表达受到茶尺蠖取食、机械损伤、茉莉酸和水杨酸的诱导;将CsiADH1基因ORF区域克隆进pCAMBIA1301载体中,构建了由CaMV35S启动子驱动的CsiADH1基因植物表达载体pCAMBIA-ADH,并以农杆菌介导的方法侵染番茄‘中蔬四号’子叶,经PCR鉴定,获得了8个转CsiADH1基因阳性植株。该结果为进一步揭示CsiADH1基因在植物诱导防御反应中的分子机理研究奠定了基础。     

甘蔗细胞质型苹果酸脱氢酶基因的克隆及其表达分析

对甘蔗(Saccharum officinarum L.)叶片全长cDNA文库进行测序,获得了1个细胞质型苹果酸脱氢酶(cMDH)基因的全长cDNA序列,命名为Sc-cMDH。生物信息学分析表明,该基因全长1314 bp,开放阅读框为999 bp,编码332个氨基酸。Sc-cMDH与其他植物cMDH的氨基酸序列同源性高达86.5%～97.0%。Sc-cMDH包含典型的NAD+结合基元T11GAAGQI17和催化基元I184WGNH188,还有相当保守的6个半胱氨酸残基,因此推断该基因为细胞质型NAD-MDH。定量PCR分析结果表明,该基因在甘蔗叶片和根中的表达量高于茎。     

油茶脂酰辅酶A脱氢酶基因的克隆与表达分析

以国审油茶(Camellia oleifera)良种‘华硕’种子为材料,在已构建的转录组和表达谱数据库基础之上,采用RACE技术,克隆获得油茶脂酰辅酶A脱氢酶基因的全长c DNA序列,命名为Co ACAD(基因登录号KJ910338)。该基因c DNA全长为2702 bp,含有2487 bp的开放读码框,编码828个氨基酸,分子量为92.4113 k D,理论等电点p I为8.47,具有2个比较明显的跨膜区和酪氨酸蛋白激酶活性位点LVHGDFRIDNLVF,存在5个亚结构域;在Co ACAD基因c DNA全长序列的基础上构建表达载体,其中原核表达载体在宿主细胞BL21(DE3)中成功诱导表达,获得表观分子量约为93 k D的目的蛋白;实时荧光定量PCR分析表明,Co ACAD基因在果实膨大期和成熟期上调表达,预示着Co ACAD基因可能在种子发育过程中参与能量供应过程的调控。     

荧光假单胞菌香兰素脱氢酶基因的克隆及表达

对荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens ATCC13525)香兰素脱氢酶基因vdh进行了克隆、序列分析以及表达。PCR扩增获得了长度为1 449 bp的核苷酸序列,该序列编码含438个氨基酸,分子量约为50 ku的多肽。序列分析表明该基因与GenBank提供的部分已知vdh基因具有高度的同源性。该基因在大肠杆菌DH5α中能高效表达,而在野生型P.fluorescens ATCC13525中本身并不表达出功能。Vdh基因表达产物香兰素脱氢酶(Vdh)在细胞中主要以可溶性蛋白的形式存在。同时研究表明诱导剂IPTG对vdh基因在大肠杆菌中的表达并不起作用。     

重组酵母菌乙醇脱氢酶基因的克隆及序列分析

目的:克隆产麻黄碱重组酵母菌乙醇脱氢酶基因片段,并对其进行序列分析,为研究该基因在重组酵母中与麻黄碱生物合成途径的关系提供参考.方法:根据一段利用抑制差减杂交技术获得的来源于重组酵母乙醇脱氢酶基因片段,采用RACE的方法扩增Adh基因,使用分子生物学软件对该基因进行生物信息学分析.结果:获得一段大小为1 245 bp的基因片段,编码375个氨基酸,含有两个催化域和两个锌结合域,与来源于Gandida boidinii ADH3基因的同源性为85％.结论:克隆的基因为乙醇脱氢酶基因,并在GenBank注册,登录号为JF293468.     

小麦TaLEC1基因的克隆及其表达特性分析

为了探讨LEC1基因在小麦(Triticum aestivum L)非生物胁迫应答中的功能,该研究通过RT-PCR结合RACE技术克隆小麦TaLEC1基因,并采用qRT-PCR方法分析了该基因在小麦不同组织以及不同处理下的表达模式,为深入研究小麦LEC1基因在干旱、高温和高盐胁迫下的响应机制奠定基础。结果表明:(1)成功克隆到小麦TaLEC1基因,该基因cDNA序列全长为1 074 bp,其中5′端非编码区23 bp,开放阅读框为741 bp,3′端非编码区310 bp,编码246个氨基酸,具有典型的CBFD_NFYB结构域。(2)实时荧光定量分析显示,TaLEC1在不同组织间表达差异显著,10 d龄幼苗的叶中表达量最高。(3)TaLEC1基因可被植物激素ABA诱导而上调表达,属于ABA依赖型的表达调控通路。(4)PEG模拟干旱胁迫处理后的0.5～1 h,TaLEC1基因呈上调表达;42℃胁迫处理过程中,TaLEC1基因呈稳定上调表达趋势,并在胁迫处理后12 h和48 h时表达急剧上调,分别为对照的52.8倍和34.5倍;NaCl胁迫处理0.5 h时TaLEC1基因迅速上调表达。研究表明,小麦TaLEC1基因参与ABA依赖的胁迫响应,推测可能在小麦耐受高温胁迫和渗透胁迫过程中发挥着重要的脱水保护功能。