抗草甘膦转基因大豆PCR定量检测研究

试验建立大豆中转基因成分的定量测定方法。采用双链DNA SYBR Green I结合染料实时荧光定量PCR技术，扩增编码大豆凝集素的内参照基因lec和抗草甘膦转基因大豆中的外源花椰菜花叶病毒CaMV35s基因。绘制2种基因扩增的循环数一拷贝数标准曲线图，根据标准曲线方程计算样品中的转基因含量；并作重现性和熔解曲线分析。结果表明，lec和CaMV35s基因标准曲线方程线性好，R^2值分别达到0．9997和0．9992。不同转基因含量的标准及模拟大豆样品定量显示，实测值与实际值接近，相对偏差5％～11％。SYBR Green I实时定量PCR方法可用于定量测定大豆中转基因品种的含量。     

转基因抗草甘膦油菜的实用PCR检测方法

 利用定性PCR技术 ,建立了检测孟山都公司培育的转基因抗草甘膦油菜中的epsps、gox和fmv35s的方法 ,同时设立了阳性内对照napin。该方法的检测灵敏度为 0 .0 5 %。利用复合PCR可以在一个PCR反应中同时检测出epsps、gox、fmv35s和napin基因。这种方法可以有效地用于转基因抗草甘膦油菜中的外源基因的检测。     

LAMP在检测转基因抗草甘膦大豆cp4-epsps基因的应用

以转基因抗草甘膦大豆为主要研究对象,利用环介导等温扩增技术（Loop-Mediated Isothermal Amplification,LAMP）,针对cp4-epsps合成酶基因（5-enolpymvlshimimate-3-phosphate synthase）的6个区域设计4条特异性引物,利用一种链置换DNA聚合酶（Bst DNA polymerase）,在65℃保温30Igm,通过荧光显色即可完成对转基因的检测工作。结果显示,该LAMP方法能够特异性检测cp4-epsps基因,其检测灵敏度是常规定性PCR方法的10倍。建立了针对转基因大豆cp4-epsps基因的LAMP检测方法,其具有高度的特异性及稳定性,结果可靠,适合转基因抗草甘膦大豆的快速检测。     

PCR检测转基因大豆

［目的］定性检测转基因大豆。［方法］以非转基因大豆和CP4-EPSPS转基因大豆为材料,以大豆内源基因Lectin和外源基因5-莽草酸-3-磷酸合成酶基因（CP4-EPSPS）为检测的目的片段,建立PCR反应体系。采用改进CTAB法提取大豆基因组DNA,并对所提DNA进行PCR扩增和电泳检测,确定转基因大豆的PCR检测限。［结果］改进CTAB法提取的大豆基因组DNA电泳条带清晰完整,转基因大豆和非转基因大豆基因组DNA均可扩增出约409 bp的条带即Lectin基因,而只在转基因大豆中检测出CP4-EPSPS特异性片段;当转基因大豆的含量为100%～0.2%时,均可扩增出特异性条带。［结论］该研究建立了转基因大豆的PCR检测方法。     

抗草甘膦转基因大豆的获得

大豆[Glycine max(L.)Merrill]是我国主要的粮食和油料作物,但近年来由于大量进口美国的转基因大豆,使我国的大豆生产严重萎缩。生物技术方法应用于改良大豆的农艺性状和产品质量以及对除草剂的耐受性,特别是对草甘膦的耐受性这一个重要性状。本研究以东农50为受体,采用农杆菌介导法,将抗草甘膦基因G10-EPSPS基因转入到大豆中,先后获得了3株T0代植株,在T0代进行抗性鉴定后,1株得到种子。试验通过对转基因后代的PCR检测、Western检测以及草甘膦抗性鉴定,证明外源基因已整合到植物基因组中,并在T0、T1和T2代稳定表达。本研究为转基因大豆育种提供了材料和数据。     

LAMP在检测转基因抗草甘膦大豆cp4-epsps基因上的应用

以转基因抗草甘膦大豆为主要研究对象,利用环介导等温扩增技术(Loop-Mediated Isothermal Amplification,LAMP),针对cp4-epsps合成酶基因(5-enolpyruvlshimimate-3-phosphate synthase)的6个区域设计4条特异性引物,利用一种链置换DNA聚合酶(BstDNA polymerase),在65℃保温30 min,通过荧光显色即可完成对转基因的检测工作。结果显示,该LAMP方法能够特异性检测cp4-epsps基因,其检测灵敏度是常规定性PCR方法的10倍。建立了针对转基因大豆cp4-epsps基因的LAMP检测方法,其具有高度的特异性及稳定性,结果可靠,适合转基因抗草甘膦大豆的快速检测。     

世界抗草甘膦大豆的发展

转基因抗除草剂作物的创制是近代农业生物技术中最活跃、也最具成效的领域,而抗草甘膦作物则是抗除草剂作物中的核心,其中抗草甘膦大豆居于首位而起着极为重要的作用。1抗草甘膦大豆在世界上的分布1996年抗草甘膦大豆开始大面积种植,美国农民迅速接受了抗除草剂品种,种植面积不     

转基因大豆Roundup Ready的高通量PCR检测

以转基因大豆标准品(BF410f)为材料,以标准PCR检测方法为基础,根据不同标准检测参数的兼容性和PCR对引物退火温度的要求,设计高通量的PCR检测方法,从大豆中快速准确地检测出Lectin、CaMV35S、CP4-EPSPS、NOS等转基因元件,提高了PCR检测效率,节约了时间.另通过梯度PCR仪摸索出合适的反应体系:预变性T＝94 ℃,5 min;变性温度T＝94 ℃,30 s;退火温度T＝58 ℃,30 s; 延伸温度T＝72 ℃,延伸40 s.35个循环后,所有受试元件均得到了扩增,很大程度地提高检测效率,该方法对于引物理论退火温度在50～60 ℃范围内具有广泛的适用性.     

转基因抗草甘膦大豆安全性评价及对环境影响的检测

杂草防治是大豆种植中的重要问题。美国、阿根廷等国家主要是通过种植抗草甘膦大豆，进而喷施草甘膦来消灭杂草。转基因抗草甘膦大疆在我国目前尚没有推广种植。为了保护野生大豆资源的多样性，研究抗草甘膦大豆的基因检测方法，对环境尤其是豆类近缘作物的基凶漂移愈来愈重要。本试验对从阿根廷引进的抗草甘膦大豆在田间种植后对大豆及其近缘种漂移可能性及检测方法进行了研究，并在南京点检测到发生基因漂移的野生大豆1株。这说明大豆与野生大豆发生基因漂移是可能的，同时也提示引种抗草甘膦大豆应有足够的安全控制措施，以免发生基因漂移而逸生为超级杂草。     

抗草甘膦转基因大豆对豆田主要杂草多样性的影响

杂草是制约大豆生产的关键因子,抗除草剂转基因大豆为大豆生产提供可持续稳产和增产的潜力。目前,我国转基因大豆至今还处于试验阶段,还不能商业化种植。2010年在中国农科院廊坊科研中试实验基地用5点取样法调查研究了抗草甘膦转基因大豆AG5601、呼交03—263、呼交06—698对豆田杂草的影响。结果表明：在对豆田杂草种类及数量、田间密度（MD）、田间均度（U）、田间频率（F）和相对多度（RA）调查中,只有抗草甘膦转基因大豆呼交03—263豆田中狗尾草的F和RA显著低于亲本受体蒙豆12,其它杂草无显著差异。这说明抗草甘膦转基因大豆AG5601、呼交03—263、呼交06—698对豆田杂草没有显著影响。     

转基因抗草甘膦棉花对草甘膦的耐受性研究

为了明确转基因抗草甘膦棉花10-6001对除草剂草甘膦的耐受性,以转基因抗草甘膦棉花材料10-6001和常规棉花品种冀棉958（ CK）为试验材料,在棉苗6片真叶时叶面喷施不同浓度〔0（不喷施除草剂,人工除草, CK）、0.25％和0.50％〕的草甘膦溶液,分别于施药后0（当天下午）、1、7、14和21 d调查棉花的株高、药害级别、受害指数和死苗率,施药后35 d 调查棉花的死苗情况;分析2种棉花对不同浓度草甘膦的反应程度,并对其株高差异进行了显著性方差分析。结果表明：转基因抗草甘膦棉花品系10-6001对草甘膦的耐受性很好,喷施0.25％和0.50％草甘膦溶液的棉花在整个试验期间药害均较轻,表现为植株矮化,生长减慢,叶片略变小,且无死苗,株高方差分析结果显示与人工除草（ CK）相比差异均不显著;随着时间的延长,药害逐渐缓解。而常规品种冀棉958对草甘膦的耐受性很差,喷施0.25％和0.50％草甘膦溶液的棉花药害症状表现为植株矮化,生长缓慢,叶片变小、枯黄、褐化干枯,并且药害程度随着时间的延长而加重,药害级别和受害指数均高于10-6001,株高方差分析结果显示与人工除草（ CK）相比差异均达到了极显著水平,施药后35 d部分棉花出现整株枯死。     

转基因大豆存在的问题及应对措施

随着分子生物学和基因工程技术的发展,转基因植物研究取得了飞速发展。但是,转基因植物所带来的争议也从未间断过。近年来,我国进口的大豆中有很多是转基因大豆,它是否对人体健康、我国大豆品种资源及生态环境造成影响,越来越引起人们的关注。论述了世界转基因大豆的现状、优缺点和引发的争议,并提出一些建议。     

玉米中转基因成分筛查策略

根据商业化转基因玉米外源基因元件信息,构建玉米转基因检测分子特征矩阵,并根据元件信息建立转基因玉米的筛查检测策略。结果表明:利用CaMV35S启动子、NOS终止子2个元件的组合,可完成对现有转基因玉米转化事件的筛查检测,检测灵敏度可达到1g/kg。该筛查方法可对玉米中的转基因成分进行快速、高灵敏度的筛查。     

利用实时荧光PCR快速筛查玉米中转基因成分

玉米是拥有转基因转化体数量最多的作物,多样的转化体增加了玉米中转基因成分筛查的难度。为了建立玉米中转基因成分的快速筛查方法,利用Taqman探针实时荧光PCR方法,通过对玉米样品中CaMV35S启动子(P-35S)和NOS终止子(T-NOS)2个元件组合的检测,完成对现有玉米转化体的筛查。建立的Taqman探针实时荧光PCR方法灵敏度可达到0.1%,检测时间较普通PCR方法缩短1h以上。同时提出了转基因玉米转化体鉴定路线图。该筛查方法可对玉米中的转基因成分进行快速、高灵敏度的筛查。     

食用大豆油中DNA的快速提取和转基因成分定性检测

转基因生物（GMO）制品中转基因成分检测的难点在于深加工产品中DNA的提取。本试验以食用大豆油为研究对象,研究操作简单、费用低廉的大豆深加工产品DNA提取的新方法。利用大豆内源基因Lectin设计引物,对所获得的DNA进行PCR检测,结果证实通过本方法提取的DNA纯度足以进行PCR反应。利用转基因大豆转化载体序列设计引物,进一步对其转基因成分进行检测,结果表明,用本方法从转基因大豆油中提取的DNA含有转基因成分。     

转基因作物食品基于核酸检测技术研究进展

随着转基因作物的迅速发展,转基因作物食品大量涌向市场,由于其安全性没有定论而受到广泛关注。本文对国内外转基因作物食品基于核酸检测技术进行概述,着重介绍目前使用较广泛的检测技术的特点及其存在的主要问题,为转基因作物食品严格管理提供技术参考。     

豆粕中转基因成分检测方法的研究

从核酸和蛋白质两个角度对转基因豆粕及大豆原料进行了检测方法上的研究。设计并合成引物对转基因豆粕的内源基因lectin、CaMV35S启动子基因、NOS终止子和Cp4-epsps基因进行检测。应用ELISA的方法对不同含量的转基因蛋白及转基因豆粕进行检测,其检测的灵敏度可达到0.25%,但ELISA不适用于加工产品转基因成分的检测。Western杂交检测转基因豆粕及大豆,其检测极限达到0.5%。对于豆粕这样的加工产品,检测蛋白质及核酸两种方法结合使用,可使检测结果更为准确。     

Establishment of PCR-ELISA for Detecting Glyphosate Resistant Transgenic Soybean

A PCR-ELISA method for detecting the glyphosate resistant transgenic soybean was established and optimized. The results showed that the key parameters of PCR-ELISA were as follows: the concentration of digoxin tag probe was 0.5 μmol · L-1, the time of hybridization reaction was 15 min and the chromogenic reaction should last for 30 min. The sensitivity and the repeatability of our PCR-ELISA method were evaluated, and the results showed that it could be detected when the concentration of DNA template from transgenic soybean samples was 0.01% or higher, and the coefficient of variation of this method was less than 5% in our research condition. These results suggested that PCR-ELISA method establishment in this study had good repeatability and high precision for detecting the transgenic soybean samples.     

多重PCR分析方法应用于转基因农作物的检测

以转基因大豆、水稻等样品为材料,采用多重PCR技术对转基因作物中常见的启动子、终止子、筛选标记基因和转入的目的基因等多个外源转基因元件进行检测,以期建立一套快速、准确、高效的转基因农作物筛查鉴定技术。通过多重扩增实验,建立了关于转基因大豆检测的大豆内源Lectin基因,花椰菜花叶病毒(Cauliflower mosaic virus,CaMV)35S启动子和根癌农杆菌胭脂碱合成酶基因NOS终止子的三重PCR分析体系,及关于转基因水稻检测的CaMV35S、NPTII和HPT基因的三重PCR分析的技术体系。并以大豆、水稻等农作物样品为检测材料,采用单一PCR和多重PCR技术同时进行检测,结果表明多重PCR方法具有快速、高效、简便、准确等特点,在转基因成分的检测上具有非常重要的实际应用价值和潜力。