增强磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶活性对谷氨酸棒状杆菌积累α-酮戊二酸的影响

磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶是谷氨酸棒杆菌中催化合成TCA循环中重要代谢物草酰乙酸的关键酶,本文以谷氨酸棒状杆菌GDK-10为出发菌株,通过同源重组技术对磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶编码基因pepc进行以下改造:将GDK-10的Ppepc启动子替换为强启动子Ptuf,获得菌株GDK-11;构建pepc双拷贝菌株GDK-12;对GDK-10基因组pepc进行定点突变(N917G),获得菌株GDK-13。实时荧光定量PCR检测表明,菌株GDK-11和GDK-12的pepc表达量是GDK-10的47.05倍和2.03倍。发酵结果表明,菌株GDK-11和GDK-12的产酸量相对于出发菌株分别下降45.50%和13.90%,但GDK-12的单位菌体产量较GDK-10提高38.59%。菌株GDK-13产酸量无明显变化,但其单位菌体产量和糖酸转化率分别提高21.14%和8.97%。可见,适量过量表达pepc和将GDK-10基因组pepc替换为解除天冬氨酸反馈抑制的pepc(N917G)均可提高α-KG的单位菌体产量且后者可显著提高糖酸转化率。本研究结果可对α-KG的基因工程改造奠定基础。     

谷氨酸棒杆菌代谢副产物对α-酮戊二酸积累的影响

谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)中ldh基因编码乳酸脱氢酶,可以催化丙酮酸转化生成乳酸,ackA和pqo基因编码乙酸激酶和丙酮酸:醌氧化还原酶,可以催化丙酮酸转化为乙酸.为了研究这三个基因缺失对谷氨酸棒杆菌α-酮戊二酸积累的影响,以Cglutamic um GDK-10为出发菌株,通过重叠延伸PCR及同源重组技术分别构建ldh,pqo,ackA,pqo和ackA基因缺失突变株GDK-14,GDK-15,GDK-16,GDK-17.对出发菌及上述重组菌株进行发酵验证比较,发酵结果表明:ldh和pqo基因缺失菌株的α--酮戊二酸产量分别比出发菌降低了8.54％和27.9％,而ackA基因的缺失使α-酮戊二酸产量比出发菌提高了8.99％.     

谷氨酸棒状杆菌果糖代谢阻断工程菌的构建

谷氨酸棒状杆菌不仅可以利用葡萄糖和果糖作为碳源进行糖类代谢,也可以利用这些碳源作为底物生产葡萄糖酸、甘露醇及山梨醇等产品。为了提高底物利用率和目的产物的积累量,利用代谢工程阻断糖类代谢的磷酸烯醇式丙酮酸-糖磷酸转移酶系统（phosphoenolpyruvate carbohydrate phosphotransferase system,PTS）和失活相应磷酸激酶。是实现此目标的有效手段。本实验利用同源重组和反向筛选等技术手段,分别获得ptsF单基因缺失工程菌CGΔptsF和ptsF、ptsH、ptsI三基因缺失工程菌CGΔptsFΔptsHΔptsI。工程菌的生长情况研究表明：在以葡萄糖为唯一碳源的培养基上,工程菌CGΔptsF和工程菌CGΔptsFΔptsHΔptsI与野生型生长情况基本一致,说明葡萄糖代谢不受3 个基因影响;在以蔗糖为唯一碳源的培养基上,工程菌CGΔptsF和工程菌CGΔptsFΔptsHΔptsI的生长速率分别是野生型的48.4%和29.7%,菌体浓度分别是野生型的61.6%和34.1%;在以果糖为唯一碳源的培养基上,工程菌CGΔptsF菌体浓度是野生型43.2%,工程菌CGΔptsFΔptsHΔptsI生长为0,证明其完全阻断了果糖代谢,同时说明果糖的PTS系统受ptsF、ptsH和ptsI基因编码的PTS相关蛋白的联合控制。果糖代谢阻断工程菌的获得,为进一步构建以果糖原型为底物的甘露醇或山梨醇生产工程菌株提供了遗传资源,也为谷氨酸棒状杆菌的糖类代谢研究提供了理论依据。     

谷氨酸棒杆菌KGA-3产α-酮戊二酸补料分批发酵工艺优化

α-酮戊二酸(α-KGA)是微生物三羧酸循环中重要的中间产物,在生命代谢中起到重要的作用,具有广泛的应用价值.对谷氨酸棒杆菌KGA-3发酵产α-KGA进行了研究,确立了补料分批发酵最佳条件,即种子培养基pH控制为7.0,摇瓶种子培养温度32℃,接种时间为12h,发酵培养基装液量25 mL/500 mL圆底三角瓶,按体积分数20％接种,最适初始糖浓度为90g/L,发酵周期为32 h.发酵采取初期补氨水,转型后添加0.75 moL/L NaOH溶液调节pH的工艺.在优化条件下,α-KGA产量和糖酸转化率分别为25.8 g/L和35.1％,比初始条件下分别提高了45.5％和11.5％.     

敲除aceA和gogat及过表达gltA对谷氨酸棒状杆菌GKGD合成α-酮戊二酸的影响

α-酮戊二酸(α-ketoglutarate,α-KG)在生命活动中具有重要的作用,被广泛应用于食品、医药等领域。以α-KG生产菌谷氨酸棒状杆菌GKGD为出发菌株,敲除其异柠檬酸裂解酶编码基因ace A以增加异柠檬酸供应,获得GKGD-1,摇瓶发酵条件下其α-KG产量和转化率分别提高14.72%和9.76%;敲除谷氨酸合酶编码基因gogat以降低L-谷氨酸生成量,获得GKGD-2,其α-KG产量和转化率分别提高7.39%和5.43%,L-谷氨酸生成量降低52.87%;过表达柠檬酸合酶编码基因glt A以进一步增加前体物供应,获得GKGD-3,其α-KG产量提高35.9%;于7.5 L发酵罐经30 h发酵,GKGD-3α-KG产量达49.5 g/L,较出发菌株提高36.4%,L-谷氨酸生成量降低50%。敲除ace A和gogat并过表达glt A可显著提高α-KG产量并降低L-谷氨酸生成量。     

利用代谢工程改造谷氨酸棒杆菌产丙酮酸研究

丙酮酸是一种重要的有机酸,可以作为前体物质,参与合成多种有机化合物,在生物体的能量代谢中发挥着重要作用。为提高丙酮酸产量,选择利用代谢工程改造谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)生产丙酮酸。利用同源重组的方法,依次敲除谷氨酸棒杆菌中与丙酮酸代谢支流相关的5个关键基因(丙酮酸醌氧化还原酶基因pqo、丙酮酸羧化酶基因pyc、转氨酶基因alaT、缬氨酸-丙酮酸氨基转移酶基因avtA、丙酮酸脱氢酶基因aceE),摇瓶发酵72h后丙酮酸的产量达到14.64g/L。通过过表达编码转酮醇酶基因tkt、转醛酶基因tal、磷酸烯醇丙酮酸羧激酶基因pck,增加合成丙酮酸前体物质的供应。最终,复合培养基摇瓶发酵72h后,发酵液中丙酮酸的产量达到15.39g/L,与野生型菌株相比提高了28倍。研究旨在为利用微生物发酵生产丙酮酸提供一定的理论参考。     

生物法合成α-酮戊二酸及其衍生物的研究进展

α-酮戊二酸是三羧酸循环的中间代谢产物,参与氨基酸、维生素和有机酸的合成及能量代谢,具有广泛的应用前景。该研究从α-酮戊二酸及其衍生物的应用、生物合成途径及代谢调控、生物法合成策略等方面综述了生物法合成α-酮戊二酸及其衍生物的研究进展,旨在为生物法合成α-酮戊二酸及其衍生物以及生产菌株的代谢工程研究提供参考。     

谷氨酸棒杆菌中。谷氨酸生物合成是怎样调节的？

生物对于任何物质的合成,都具有自身的调节控制能力,在谷氨酸棒杆菌中,谷氨酸比冬天氨酸优先合成,谷氨酸合成过剩时,就会反馈控制谷氨酸脱氨酶（GD）,使从草酰乙酸开始的生物合成转向天冬氨酸。当天冬氨酸合成过量时,就会反馈控制磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶（PC）所催化的反应,停止草酰乙酸的合成。所以,在正常情况下,谷氨酸并不积累。     

钙盐沉淀法从酮酸发酵液中提取α-酮戊二酸

酮戊二酸作为一种重要的有机酸,在食品、化工、医药等领域具有广泛的用途。目前,发酵法是生产α-酮戊二酸最具优势的方法。但在解脂亚洛酵母发酵生产α-酮戊二酸的过程中,丙酮酸作为副产物总是大量积累。这2种酮酸物化性质相似,为下游分离提取过程造成了很大的困难。研究对比3种不同钙盐对酮酸分离的影响,建立了一种有效分离发酵液中α-酮戊二酸的钙盐沉淀方法。采用CaCO3为α-酮戊二酸的最佳沉淀剂,α-酮戊二酸的回收率和纯度分别为82.5%和98.89%。同时,结果表明在偏中性和高温作用下,丙酮酸的稳定性受到影响,丙酮酸分离不适用于钙盐沉淀法。该研究可为酮酸的分离提取过程提供重要的理论参考。     

离子交换法纯化α-酮戊二酸

为了从发酵液中分离纯化出α-酮戊二酸,作者利用活性炭对发酵液进行脱色后,采用离子交换法对α-酮戊二酸的纯化工艺进行了研究。结果表明,活性炭用量1.5 g/L、pH 3.0、脱色时间1 h、脱色温度50℃的条件下能取得最佳脱色效果,脱色率达89.2%。分析了6种阴离子交换树脂对α-酮戊二酸的吸附容量,确定了吸附性能显著的D301大孔弱碱型树脂。在固定床上上样条件优化表明,当发酵液中α-酮戊二酸质量浓度为20 g/L、上样流速为2.67 BV/h、径高比为1∶12时,上样吸附效果最佳。采取阶段洗脱工艺:第一阶段用0.01 mol/L的NaCl和0.01 mol/L的HCl混合溶液进行洗脱,第二阶段采用0.3 mol/L的HCl溶液在6 BV/h的流速下进行洗脱。验证结果表明,在此洗脱工艺下,收集液中α-酮戊二酸与丙酮酸的质量比由初始发酵液中的1.5∶1提高为10∶1时,α-酮戊二酸收率为93.2%。因此,采用离子交换法可有效的分离纯化发酵液中的α-酮戊二酸。     

α-酮戊二酸对L-羟脯氨酸产量的影响

微生物合成L-羟脯氨酸时需要α-酮戊二酸的参与,而细胞内α-酮戊二酸的含量有限,限制了L-羟脯氨酸的高效合成。 因此该实 验通过在L-羟脯氨酸发酵过程中外源添加α-酮戊二酸,来考察α-酮戊二酸对发酵菌体生长、L-羟脯氨酸产量、糖酸转化率和代谢流的 影响。 结果表明,α-酮戊二酸对菌体生长有一定的抑制作用,但在一定浓度范围内,外源添加α-酮戊二酸能有效提高L-羟脯氨酸的产量和 糖酸转化率,当随糖流加5 g/L（初始发酵液）α-酮戊二酸时,L-羟脯氨酸产量能够达到最大值62.14 g/L,糖酸转化率为22.37%,与不添加 α-酮戊二酸相比,分别提高了47.85%和13.04%,同时,L-羟脯氨酸的合成代谢流提高了11.98%,副产物乙酸合成代谢流减少了29.42%。     

合成5-氨基乙酰丙酸谷氨酸棒杆菌的代谢工程构建

作为高附加值氨基酸衍生物,5-氨基乙酰丙酸具有重要的生理活性,被广泛应用于医药、农业和畜牧业。为强化5-氨基乙酰丙酸的合成,该研究以前期构建的谷氨酸棒杆菌AL6为出发菌株,首先过表达异柠檬酸脱氢酶编码基因icd强化α-酮戊二酸合成;然后利用弱启动子控制α-酮戊二酸脱氢酶以弱化α-酮戊二酸降解,菌株AL8的5-氨基乙酰丙酸产量达到1.92 g/L。利用动态调控策略调节5-氨基乙酰丙酸的降解,有效降低了副产物胆色素原和血红素的生成。在此基础上证明了谷氨酸棒杆菌苏氨酸输出蛋白ThrE具有输出5-氨基乙酰丙酸的功能,但大肠杆菌苏氨酸输出蛋白RhtA效果更佳,采用基因组整合过表达rhtA的方式效果最好,所构建菌株AL12的5-氨基乙酰丙酸产量为2.69 g/L。该研究可为提升5-氨基乙酰丙酸的发酵合成效率提供参考。     

α-酮戊二酸分离提取工艺的优化

运用全细胞催化法生产α-酮戊二酸的过程中,α-酮戊二酸生物转化液中含有残留底物、杂蛋白、有机杂酸和色素等杂质,用单一的分离方法不易去除。该文使用钙盐沉淀法结合离子交换法对α-酮戊二酸全细胞转化液进行分离纯化,将预处理后的料液酸化至pH=2.0,用Ca(OH)₂做沉淀剂沉淀α-酮戊二酸得到α-酮戊二酸钙,然后使用浓H₂SO₄处理α-酮戊二酸钙得到离子交换母液,经液相色谱检测,α-酮戊二酸的纯度从78.79%上升至93.66%。通过离子交换静态试验筛选出D301型树脂作为离子交换填料。动态上样最优参数为：高径比2.5∶1、上样质量浓度30 g/L、上样流速2.4 BV/h。最佳洗脱条件为：质量分数为0.02%的HCl溶液洗脱2个柱体积,流速4 BV/h,以质量分数为5%的NaOH溶液洗脱4个柱体积,流速2 BV/h,最终分离纯化处理后的总收率为80.32%,纯度为97.32%。     

增强回补途径对谷氨酸棒状杆菌合成L-异亮氨酸的影响（英文）

该实验考察和比较增强回补途径对谷氨酸棒状杆菌合成Lacterium glutamicum-异亮氨酸的影响。通过以L-异亮氨酸生产菌Corynebppc YI为出发菌株,分别采用基因组整合和质粒的方式过表达磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶编码基因及丙酮酸羧化酶编码基因pyc。结果表明,获得pyc基因组整合和质粒过表达菌株ILE01和ILE02,摇瓶条件下菌株L-异亮氨酸产量分别提高17. 3%(6. 1 g/L)和9. 6%(5. 7 g/L)、发酵罐条件下分别提高11. L7%(24. 8 g/L)和8. 1%(24. 0 g/L)。获得ppc基因组整合和质粒过表达菌株ILE03和ILE04,摇瓶条件下菌株-异亮氨酸产量分别提高(30. 8%(6. 8 g/L)和13. 5%(5. 9 g/L)、发酵罐条件下分别提高15. 8%(25. 7 g/L)和9. 5%24. 3 g/L)。此外,过表达pyc和ppc还可不同程度地提高L-异亮氨酸转化率。然而采用质粒过表达pyc和ppc均使得菌株生物量下降。因此,过表达pyc和ppc均能显著提高L-异亮氨酸产量和转化率,基因组整合的过表达方式效果优于质粒...     

过表达mqo对重组谷氨酸棒杆菌L-异亮氨酸和4-羟基异亮氨酸合成的影响

4-羟基异亮氨酸(4-hydroxyisoleucine,4-HIL)具有促进胰岛素分泌、降低胰岛素抵抗活性功能,在治疗糖尿病方面有潜在的应用价值。在产L-异亮氨酸(L-isoleucine,Ile)的谷氨酸棒杆菌SN01菌株中过表达ido基因后可以合成4-HIL。为了促进草酰乙酸的供应和4-HIL合成,在这株重组菌中又过表达了mqo。发酵144 h后,ido-mqo过表达菌的4-HIL产量是(60.86±2.24)mmol/L,低于ido过表达菌(72.06±5.60)mmol/L;但是,Ile的积累量高达(101.39±2.20)mmol/L,显著高于ido过表达菌(5.00±1.43)mmol/L。对ido-mqo过表达菌代谢途径中部分关键基因的RT-PCR分析表明,进入TCA循环的碳流由异柠檬酸裂解酶分流,进入乙醛酸循环,导致4-HIL合成所需的另一底物α-酮戊二酸(α-ketoglutarate,α-KG)供应不足和Ile过剩。于是添加α-KG,当添加量为40 mmol/L时,4-HIL的产量提高到(77.7±10.91)mmol/L,Ile到4-HIL的转化率提高到75%。因此,过表达mqo能够促进Ile合成,添加α-KG后能够促进Ile向4-HIL转化,从而提高4-HIL产量。     

谷氨酸棒状杆菌合成L-高丝氨酸的代谢改造与发酵条件探究

目的:本研究以谷氨酸棒状杆菌ATCC 13032为底盘细胞,构建1株L-高丝氨酸合成菌株并分析溶氧环境对其产物合成的影响。方法:首先通过外源添加0～40 g/L的L-高丝氨酸分析谷氨酸棒状杆菌的产物耐受性;随后,通过基因thrB敲除阻断L-高丝氨酸的降解途径,获得谷氨酸棒状杆菌重组菌H1;在此基础上利用挡板摇瓶进行细胞培养以增强发酵过程中氧气供给能力。结果:与大肠杆菌相比,谷氨酸棒状杆菌对L-高丝氨酸具有更强耐受性。研究中通过敲除基因thrB构建了L-苏氨酸缺陷型谷氨酸棒状杆菌重组菌H1,发现基础培养基中加入0.5 g/L的L-苏氨酸后,该重组菌生长恢复正常水平。挡板摇瓶条件下重组菌H1的L-高丝氨酸产量增加至836.7 mg/L,较普通摇瓶产量44.6 mg/L提高了17.76倍。结论:通过阻断L-苏氨酸的合成,成功构建L-高丝氨酸合成菌株谷氨酸棒状杆菌H1,并且发现利用挡板摇瓶增强发酵过程中供氧能力是促进谷氨酸棒状杆菌高效合成L-高丝氨酸的有效手段,为后续提高L-高丝氨酸发酵产量提供了参考。     

高产α-酮戊二酸解脂亚洛酵母的选育及其发酵过程优化

为了提高解脂亚洛酵母(Yarrowia lipolytica)发酵生产 α-酮戊二酸(α-ketoglutaric acid,α-KG)的效率,对前期获得的1株 α-酮戊二酸高产菌株1-C6进行了迭代诱变处理,并对最终获得的高产突变菌株进行了系统的发酵过程优化.首先,基于前期构建的高通量筛选方法,应用甲基磺酸乙酯(et...     

亮氨酸和α-酮戊二酸对小鼠体重、血清及脏器的影响

选取40只4周龄C57BL/6雄性小鼠,随机分为4组。对照组正常饮水,其他组小鼠分别在水瓶中加入1.0%的α-酮戊二酸(Ⅰ组)、1.8%的亮氨酸(Ⅱ组)、1.8%的亮氨酸和1.0%的α-酮戊二酸(Ⅲ组)。试验期为35d。结果表明:①Ⅲ组的体重比对照组、Ⅰ组和Ⅱ组分别降低了8.7%,10.1%,10.4%;②Ⅲ组的血清白蛋白含量比对照组、Ⅰ组和Ⅱ组显著提高(P0.05);③Ⅲ组的心脏指数比对照组、Ⅰ组和Ⅱ组分别提高了19.3%,13.6%,15.2%;④Ⅲ组的腹部脂肪指数比对照组、Ⅰ组和Ⅱ组分别降低了24.1%,10.0%,6.7%,Ⅲ组的腓肠肌横截面积比对照组、Ⅰ组和Ⅱ组分别提高了46.9%,20.2%,27.9%。说明亮氨酸和α-酮戊二酸两者联合能减轻小鼠体重,加强器官对脂肪的利用,增加腓肠肌纤维横截面积。     

响应面法优化重组谷氨酸棒杆菌G-BC产脂肪酸的培养条件北大核心CSCD

乙酰辅酶A羧化酶是谷氨酸棒杆菌中调控脂肪酸合成的关键酶。为了研究乙酰辅酶A羧化酶α亚基(accBC)基因对脂肪酸合成的影响,以accBC表达的菌株重组谷氨酸棒杆菌G-BC为材料,研究了诱导剂异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)浓度、培养时间、培养温度对重组谷氨酸棒杆菌G-BC脂肪酸产量的影响,并通过响应面法优化了重组谷氨酸棒杆菌G-BC产脂肪酸的培养条件,同时与原始菌株脂肪酸产量进行了对比。结果表明:重组谷氨酸棒杆菌G-BC产脂肪酸的最佳条件为诱导剂浓度1 mmol/L、培养时间20 h、培养温度32℃,在此条件下脂肪酸产量为34.56 mg/g(以菌体干质量计),比原始菌株提高了1.68倍。说明乙酰辅酶A羧化酶α亚基对于谷氨酸棒杆菌合成脂肪酸有促进作用。     

双底物指数流加和双阶段溶氧控制对谷氨酸棒状杆菌生产L-异亮氨酸的影响

为了实现L-异亮氨酸的高效生产,提高谷氨酸棒状杆菌YILW生产L-异亮氨酸的产量和生产强度,在详尽分析磷酸盐和玉米浆初始浓度对L-异亮氨酸发酵影响的基础上采用了双底物(玉米浆、磷酸盐)指数流加与双阶段溶氧相结合的控制策略进行L-异亮氨酸发酵。结果表明,最佳磷酸盐和玉米浆浓度分别为1.5 g/L和35 mL/L,此条件下分批补料发酵菌体生物量和L-异亮氨酸产量分别为27.66 g/L和25.89 g/L。在生长阶段进行双底物指数流加并结合双阶段溶氧控制,发酵60 h菌体生物量和L-异亮氨酸产量分别为32.29 g/L和31.32g/L,较优化前分别提高16.73%和20.97%。