加速超分割术前放疗诱导非小细胞肺癌细胞凋亡的研究

目的　探索放射线诱导非小细胞肺癌细胞凋亡及对凋亡相关蛋白Bcl 2、Bax表达的影响。方法　 81例初治的非小细胞肺癌患者 ,分为加速超分割术前放疗组 ( 2 0例 )和单纯手术组 ( 61例 )。术前放疗组采用前后对穿照射 ,2 .5Gy/次 ,2次 /天 ,总量 2 5Gy/10次 /5～ 7天 ,放疗后 2周内手术。用间接免疫荧光法和流式细胞术定量分析细胞凋亡指数 (AI)、细胞周期分布和凋亡相关蛋白Bcl 2和Bax的表达。结果　单纯手术组AI为 4.6%± 2 .3 % ,术前放疗组为 12 .8%± 4.3 % (P <0 .0 0 1)。单纯手术组S期细胞比例 (Sphasefraction ,SPF)为 16.3 %± 4.6% ,术前放疗组为 14 .9%± 4.1% (P >0 .0 5 )。单纯手术组Bcl 2、Bax蛋白免疫荧光指数 (FI)和Bcl 2 /Bax比值分别为 1.3 3± 0 .2 1、1.0 5± 0 .13和 1.2 9± 0 .2 3 ,术前放疗组分别为 1.14±0 .2 6、1.19± 0 .16和 0 .96± 0 .2 3 ,术前放疗组Bcl 2蛋白表达水平下降 (P <0 .0 1) ,Bax蛋白表达水平升高 (P<0 .0 0 1) ,Bcl 2 /Bax比值明显下降 (P <0 .0 0 1)。AI与Bax蛋白表达呈正相关 (P <0 .0 0 1) ,与Bcl 2 /Bax比值呈负相关 (P <0 .0 1)。结论　加速超分割术前放疗使Bcl 2蛋白表达水平下降并诱导Bax蛋白表达水平升高 ,诱发了较高水平的细胞凋亡 ,但是否能提高     

Survivin反义核酸诱导卵巢癌细胞SKOV3凋亡及对 docetaxel的增敏作用

背景与目的:Survivin在大多数肿瘤组织中特异性高表达,并与肿瘤细胞的凋亡和耐药密切相关。本研究探讨Survivin反义真核表达载体(anti-pcDNA3-svv)对卵巢癌细胞SKOV3凋亡的诱导作用及对docetaxel的增敏作用。方法:采用Survivin反义核酸瞬时电转染法转染SKOV3细胞,筛选出阳性细胞株。以RT-PCR检测survivinmRNA的表达,Westernblot检测Survivin蛋白的表达。用流式细胞仪和透射电镜观察Survivin反义核酸对SKOV3细胞凋亡的诱导作用,MTT法检测其对docetaxel的增敏作用。结果:稳定表达anti-pcDNA3-svv的SKOV3细胞survivinmRNA及Survivin蛋白均比未转染者明显降低,透射电镜下可见稳定转染组细胞呈凋亡晚期变化,流式细胞仪显示其凋亡率为19%,docetaxel对实验组细胞的IC50值为(13.3±2.2)ng/ml,而对照组为(53.2±2.4)ng/ml,差异具有显著性(P<0.05)。结论:Survivin反义核酸可诱导SKOV3细胞凋亡,增强SKOV3细胞对docetaxel的敏感性。     

放射治疗对恶性肿瘤患者血细胞动力学的影响

目的　探讨放射治疗对恶性肿瘤患者血细胞动力学的影响。方法　用流式细胞术对2 5 7例放射治疗患者和 2 88例未放射治疗患者外周血细胞的增殖活性和细胞凋亡水平进行了对比分析。结果　肿瘤放射治疗患者、未放射治疗患者和正常对照者血细胞S期细胞比率和凋亡水平均有显著差异 ,分别为 1.2 3%± 1.15 %、0 .5 4%± 0 .46 %、0 .33%± 0 .2 6 %和 8.93%± 6 .94%、0 .2 0 %±0 .2 0 %、0 .15 %± 0 .13 % (F =3.18,P <0 .0 5和F =5 .77,P <0 .0 1)。在放射治疗患者中 ,放射治疗后<1个月者的细胞凋亡水平和S期细胞增殖活性均显著高于放射治疗后 1～ 3个月患者 ,分别为16 .5 6 %± 12 .95 %和 1.76 %± 1.75 %、0 .49%± 0 .2 9%和 0 .5 0 %± 0 .48% (t =9.0 6 ,P <0 .0 1和t =4.6 1,P <0 .0 1)。结论　放射治疗能促进恶性肿瘤患者血细胞凋亡水平和增殖活性显著升高。其检出率随时间增加而减低。该结果为探讨肿瘤放射反应提供了新的资料     

反义抑制Survivin表达增强肝癌细胞系对阿霉素的敏感性

背景与目的:由于Survivin在大多数肿瘤细胞中过表达,而在正常成人终末分化组织中沉默,并参与了恶性肿瘤的发生、发展和化疗耐药,使其成为值得关注的抗癌治疗靶。反义寡核苷酸可用来封闭凋亡抑制基因Survivin,诱导肿瘤细胞凋亡或增强其化疗敏感性。本研究旨在探讨反义抑制Survivin表达对肝癌细胞系阿霉素敏感性的影响。方法:RT鄄PCR、Westernblot检测HepG2和HepG2/ADM细胞Survivin表达;MTT法评估HepG2和HepG2/ADM对反义复合物和阿霉素的敏感性;不同浓度的反义复合物分别转染HepG2和HepG2/ADM细胞,RT鄄PCR检测SurvivinmRNA表达;等辐射分析法评估不同浓度反义复合物和亚致死浓度阿霉素对HepG2和HepG2/ADM细胞的协同效应;流式细胞术检测激活型Caspase鄄3表达及凋亡率。结果:HepG2/ADM细胞SurvivinmRNA是HepG2细胞的15倍,蛋白水平是HepG2的18倍。两种细胞均显示对反义复合物敏感并呈浓度依赖关系,反义复合物对HepG2和HepG2/ADM细胞的IC50分别为317.90nmol/L和480.74nmol/L,在500nmol/L时抑制率达到71.10%和53.67%。ADM对HepG2和HepG2/ADM细胞的IC50分别为0.36μg/ml和2.12μg/ml,耐药指数为6。反义复合物剂量依赖性下调HepG2和HepG2/ADM细胞SurvivinmRNA表达,对HepG2和HepG2/ADM细胞的IC50分别为271.93nmol/和365.72nmol/L,400nmol/L时表达水平分别下调了69.12%和60.01%。反义复合物和低浓度ADM联合使HepG2细胞的敏感性增加了6倍,使HepG2/ADM细胞的敏感性增加了4倍。联合处理激活了HepG2/ADM细胞Caspase鄄3活性,诱导细胞凋亡,激活型Caspase鄄3和凋亡率随反义复合物浓度的增加而逐渐递增。结论:反义抑制Survivin表达增强肝癌细胞系对阿霉素的敏感性,反义寡核苷酸和阿霉素联合可能是耐阿霉素肝细胞癌临床治疗的一种合理策略。     

鼻咽癌中EB病毒潜伏膜蛋白1对p53表达的调控

目的 探讨EB病毒潜伏膜蛋白1（LMP1）是否通过NF-kB在鼻咽癌细胞中促进p53蛋白的表达,为阐明LMP1促进细胞凋亡的机制提供实验依据。方法 利用四环素诱导表达系统,建立受四环素调控表达LMP1的鼻咽癌细胞系,用报道基因检测法和Western印迹技术,观察LMP1过量表达对NF-kB的功能性活化及p53、bcl-2表达的影响。结果 在鼻咽癌细胞中,LMP1能活化NF-kB。过量表达的LMP1促进p53基因的表达,这种促表达可以被硫代磷酸化修饰的LMP1及p65反义寡聚脱氧核苷酸阻断,LMP1和p65地bcl-2的表达则没有影响,LMP1过表达对bcl-2的表达无影响。结论 鼻咽癌中LMP1通过活化核转录因子NF-kB调节p53的表达;而在LMP1过表达时,bcl-2介导的抗凋亡机制未被启动,至少是未被上调的。     

EB病毒LMP1对鼻咽癌中瘤细胞分化的影响

目的　探讨EB病毒LMP1对早期鼻咽癌中瘤细胞分化的影响。方法　收集 31例早期鼻咽非角化性癌活检组织。采用DAKO公司的PNA探针和PNA原位杂交试剂盒检测EB病毒早期RNAs (EBERs)。应用免疫组化法检测LMP1,α catenin ,β catenin ,γ catenin以及高、低分子量细胞角蛋白。结果　 31例癌组织中均有相当数量的瘤细胞呈EBERs阳性 ,其中19例表达LMP1( 6 1.2 9% )。LMP1阳性组γ catenin的表达百分率 ( 5 3 .2 5± 34.12 % )明显低于LMP1阴性组 ( 80 .42±15 .77% ,P <0 .0 1)。γ catenin的表达与低分子量细胞角蛋白的表达间呈正相关 (r=0 .44 0 ,P <0 .0 5 )。α catenin ,β catenin和γ catenin的表达相互间呈两两正相关。结论　鼻咽癌中瘤细胞的LMP1能下调γ catenin的表达 ,从而抑制瘤细胞的分化。     

bcl-2反义核酸提高γ线对恶性淋巴瘤细胞凋亡的作用

目的研究bcl-2反义核酸能否增加^60Coγ线对恶性淋巴瘤细胞凋亡的作用。方法采用细胞染色方法观察细胞凋亡的形态，原位末端标记法检测凋亡细胞，流式细胞仪检测细胞的DNA含量和bcl-2蛋白的表达。结果1～8Gyγ线和10～40μmol/L bcl-2基因反义核酸均能抑制B淋巴瘤细胞株Raji细胞生长，诱导细胞凋亡。流式细胞仪检测亚G1期细胞增多，bcl-2蛋白表达降低，呈现时间剂量依赖效应，联合应用比单独应用抑制作用显著。结论bcl-2反义核酸能够增加^60Coγ线对恶性淋巴瘤细胞凋亡的作用。     

Ki67反义肽核酸、反义寡核酸对肾癌细胞系增殖及凋亡影响的研究

 目的 探讨肿瘤增殖相关基因Ki67反义肽核酸(PNAs)、反义寡核酸(ASODNs)对人肾癌细胞增殖及凋亡的调控。寻找肾癌反义治疗的合适药物。方法 将PNAs转染人肾癌786-0细胞系，采用免疫组化、Western blot技术检测Ki67表达，细胞生长曲线，³H-thymidine掺入试验检测肾癌细胞增殖，TUNEL法检测癌细胞凋亡。并与相同浓度的ASODNs进行对比。结果 PNAs处理组(10μmol／L)786-0细胞Ki67表达阳性率(％)(16．9±0．7)降低，Ki67蛋白(％)(42．1±2．2)降低，与ASODNs处理组(28．6±0．4)(83.6±1．4)比较差异有显著性(P<0．01，P<0．01)。PNAs处理组³H-thymidine掺入率(％)(20．7±1．5)减少，与ASODNs处理组(58．6±1．4)比较差异有显著性(P<0．01)。PNAs处理组凋亡细胞阳性率(％)(28．7±2．3)增加，与ASODNs处理组(13．8±1．0)比较差异有显著性(P<0．01)。结论 PNAs可在反义及反基因二个环节发挥抗肿瘤作用，与ASODNs相比，PNAs有更强的阻抑人肾癌Ki67基因表达、增殖及促进凋亡作用，是一种有前途的基因治疗药物。     

柔红霉素对HL-60细胞凋亡及Fas、FasL表达的影响

目的 :通过测定柔红霉素 (DNR)对急性早幼粒细胞白血病细胞株HL 60凋亡及Fas/FasL基因表达的变化 ,探讨Fas/FasL系统在细胞凋亡中的作用。方法 :应用荧光显微镜、结合DNA电泳及流式细胞仪分析技术 ,观察柔红霉素对HL 60细胞凋亡的影响及细胞凋亡过程中Fas/FasL基因的表达。结果 :柔红霉素浓度为 0 .1、1 μg/ml时 ,作用 6小时出现典型凋亡细胞 ,荧光显微镜观察HL 60细胞可见凋亡小体、染色质浓缩和胞体出芽改变 ,流式细胞仪分析可见凋亡峰 ,2 4小时达高峰 (45 .2 %± 1 0 .3 % )。 1 0 μg/ml柔红霉素作用 6小时 ,未见凋亡峰。柔红霉素可诱导Fas/FasL基因表达。结论 :柔红霉素诱导细胞凋亡是其治疗白血病的主要机制之一 ,Fas/FasL系统参与柔红霉素诱导的HL 60细胞的凋亡过程     

鼻咽癌组织中bcl-2及EB病毒潜伏膜蛋白表达与放射诱发细胞凋亡的关系

目的　探讨鼻咽癌 (NPC)组织bcl 2及EB病毒潜伏膜蛋白 (LMP)表达与放射诱发细胞凋亡的关系。方法　采用免疫组化S P法及TdT酶介导的生物素化dUTP缺口末端标记技术 (TUNEL法 ) ,分别检测 35例NPC组织中bcl 2及EB病毒LMP的表达 ,以及放疗总量为 10Gy时NPC组织的细胞凋亡率 (AR )。结果　NPC组织bcl 2及LMP的表达率分别为 71.4%(2 5 /35 )、45 .7% (16 /35 ) ,AR为 (6 1.3± 11.8) %。放疗后的AR与LMP表达呈正相关 ,与bcl 2的表达呈负相关。结论　LMP有促进NPC放疗后细胞凋亡的生物学作用 ,其作用与bcl 2的表达无关 ;而bcl 2表达阴性者对放射线的敏感较阳性者强。     

EB病毒LMP1在鼻咽癌细胞系中通过NF-κB、AP-1促进MMP9表达

目的 探讨EB病毒（Epstein-Barr Virus,EBV)LMP1是否通过NF－κB和AP－1促进MMP9表达,为全面阐明LMP1的分子致瘤机制提供实验依据。方法 将MMP9－CAT表达质粒导入HNE2－pSG5、HNE2－LMP1、HNE2－LMP1（1－185）、HNE2-LMP1(1-231)、HNE2－LMP1 Δ187-351鼻咽癌（nasopharyngeal carcinoma,NPC) 细胞系,比较各组细胞系的氯霉素乙酰转移酶（CAT）活性,以确定LMP1或其不同的结构域是否上调MMP9转录;采用明胶Zymography法检测上述细胞产生MMP9的活性,以确定LMP1或其不同的结构域是否促进MMP9蛋白表达;借助报道基因分析法确定在NPC中野生型LMP1能否激活NF－κB和AP－1的活性,进一步将突变了NF－κB或AP－1结合位点的MMP9－CAT表达质粒导入上述细胞系;比较相应的CAT活性,以确定LMP1或其不同的结构域是否通过NF－κB或AP－1上调MMP9表达。结果 与导入载体pCDNA3比较,HNE2－LMP1、HNE2－LMP1（1－185）、HNE2－LMP1（1－231）和HNE2－LMP1 Δ187－351 NPC细胞系CAT活性分别提高7.2,1.3,3.3和4．0倍。明胶Zymography法检测显示,在HNE2－LMP1、HNE2－LMP1（1－231）和HNE2－LMP1 Δ187－351细胞系中,均可检测到92000 MMP9活性,而HNE2－pSG5、HNE2－LMP1（1－231）几乎均为阴性。较之母细胞,野生型LMP1活化NF－κB及AP－1分别为13．8和8．4倍。导入NF－κB mut MMP9的HNE2－LMP1、HNE2－（1－231）和HNE2－LMP1 Δ187－351细胞系CAT活性,与导入MMP9－CAT相应的细胞系比较,分别下降至原有水平的18．1％、35．0％和29．1％;而导入AP－1 mut MMP9,则分别下降至原有水平的16．3％、33．3％5和26．1％,HNE2－pSG5、HNE2（1－185）影响不大。结论 LMP1 CTAR1与CTAR2可能通过NF－κB或AP－1促进MMP9表达,从而有助于NPC侵袭与转移。     

EB病毒潜伏膜蛋白(LMP1)与survivin在鼻咽癌中的表达

目的探讨鼻咽低分化鳞状细胞癌组织中EB病毒潜伏膜蛋白LMP1和survivin表达水平与预后的关系。方法用免疫组化SP法对83例鼻咽低分化鳞状细胞癌组织进行LMP1和survivin标记,分析其与临床分期、放疗后三年内结果的关系。结果LMP1的表达与临床分期无关(P>0.05),但与放疗后三年内复发有关(P<0.05)。survivin与临床分期,放疗后三年内复发有关(P<0.05)。LMP1与survivin有相关(P<0.05)。结论LMP1与survivin在鼻咽癌的预后中有重要价值,可作临床治疗的参考指标。     

EB病毒LMP1羧基端胞浆区介导端粒酶活化

目的 探讨EB病毒LMP1羧基端胞浆区与端粒酶活化的关系。方法 利用四环素衍生物强力霉素(Dox)调控LMP1表达的鼻咽癌细胞p^Tet-on-LMP1 HNE2，检测Dox诱导时细胞表达的端粒酶活性；将野生型LMP1表达质粒及其羧基端胞浆区、CTAR1功能域和CTAR2功能域分别缺失的表达质粒分别转染LMP1阴性的鼻咽癌细胞HNE2，观察端粒酶活性的变化情况。结果 在Dox诱导下，细胞表达的端粒酶活性较强；若HNE2细胞转染LMP1基因后，端粒酶活性明显升高。将LMP1羧基端胞浆区完全缺失后，端粒酶活性明显下降；若分别缺失CTAR1功能域和CRAR2功能域，端粒酶活性分别下降了4．43倍和2．88倍。结论 EB病毒LMP1可活化端粒酶活性，这一功能与LMP1羧基端胞浆区，特别是其功能域CTAR1和CTAR2密切相关。     

Identification and prevalence of CD8(+) T-cell responses directed against Epstein-Barr virus-encoded latent membrane protein 1 and latent membrane protein 2

Epstein-Barr virus (EBV) is associated with several human malignancies that each show different viral gene expression profiles. In malignancies such as Hodgkin's disease and nasopharyngeal carcinoma only Epstein-Barr nuclear antigen 1 (EBNA1) and varying levels of latent membrane proteins 1 and 2 (LMP1 and -2) are expressed. Since endogenously expressed EBNA1 is protected from CTL recognition, LMP1 and LMP2 are the most likely target antigens for anti-tumor immunotherapy. Therefore, we sought to identify in a systematic way CD8(+) T-cell responses directed against eptitopes derived from LMP1 and LMP2. Using IFNgamma-ELISPOT assays of interferon-gamma release, peripheral blood mononuclear cells (PBMC) of healthy donors were screened with peptide panels (15 mer overlapping by 10) spanning the LMP1 and LMP2 sequences of the prototype EBV strain B95.8. When positive responses were found, CD4(+) or CD8(+) T cells were depleted from donor PBMC to determine the origin of the responder population. We detected CD8(+) T-cell responses to LMP1 in 9/50(18%) donors and to LMP2 in 15/28 (54%) donors. In addition to the already described epitopes, 3 new LMP1- and 5 new LMP2-derived CD8(+) epitopes were identified. In most donors LMP1- and LMP2-specific CD8(+) precursor frequencies were low compared with precursors against immunodominant EBV epitopes from latent (EBNA3A, -3B and -3C) and lytic cycle antigens. These results demonstrate that CD8(+) memory T cell responses to LMP1 and especially to LMP2 do exist in Caucasians, albeit at low levels and could potentially be exploited for therapeutic use.     

LMP1 and LMP2 may be Prognostic Factors for Outcome ofTherapy in Nasopharyngeal Cancers in Indonesia

Nasopharyngeal carcinoma (NPC) is an epithelial malignancy that is invasive and metastasizes easily. Inseveral Asian countries it is the most commonly found of the head and neck malignancies. Epstein Barr virus(EBV) infection is one of the agents causing NPC, so that expression of LMP1 and LMP2 may affect the outcomeof therapy, metastasis, recurrence, and survival of NPC patients. This study aimed to investigate their expressionin relation to therapy outcome and survival in a series of Indonesian NPC patients. The methods used werenested case control and Kaplan-Meier survival analysis. Differences in therapy outcome in relation to LMP1and LMP2 expression were analyzed through chi square statistics. As a result, in post treatment NPC, there wasa significant difference in therapy outcome between LMP2 (+) compared to LMP2 (-) (P = 0.001). There wasalso a significant difference in 24-months-survival between NPCs expressing LMP1 (+) or LMP2 (+) comparedto those expressing LMP1 (-) or LMP2 (-).     

The significance of LMP1 expression in nasopharyngeal carcinoma

The Epstein-Barr virus (EBV)-encoded latent membrane protein 1 (LMP1) is a key effector of EBV-mediated B cell transformation. LMP1 displays potent oncogenic properties in rodent fibroblasts, and induces a wide range of effects in B cells and epithelial cells. LMP1 functions as a constitutively active tumor necrosis factor receptor (TNFR) engaging a multitude of signaling pathways that include NF-kappaB, the mitogen-activated protein kinases (MAPKs), JNK, p38, the JAK/STAT pathway and, more recently, the small Rho GTPases. The constitutive activation of these signaling cascades explains LMP1's ability to induce such a diverse array of morphological and phenotypic effects in cells and provides an insight into how LMP1 may induce cell transformation. The frequent expression of LMP1 in undifferentiated nasopharyngeal carcinoma (NPC) points to a role for this viral oncoprotein as a key effector molecule in NPC pathogenesis.     

EB病毒与结直肠癌的相关性

背景与目的:研究表明,EB病毒(Epstein-Barrvirus,EBV)除与鼻咽癌密切相关外,可能与其它癌症相关。本研究旨在探讨EBV与中国人结直肠癌的关系。方法:采用PCR方法从90例原发性结直肠癌标本及25例配对的癌旁标本检测EBVLMP1(latentmembraneprotein1)基因的第3外显子及BamHⅠW片段的部分序列;采用免疫组织化学方法检测EBNA1(EBVnuclearantigen1)和LMP1的表达,采用原位杂交检测EBERs(EBV-encodedRNAs)的表达。结果:在90例原发性结直肠癌标本中,EBV基因阳性率为27.7%(LMP1外显子3)和32.2%(W片段),而25例癌旁组织中只有1例(4.0%)EBV基因阳性,癌组织和癌旁组织EBV阳性率差异有显著性(P<0.001)。29例W片段阳性的大肠癌标本中,有23例(79.3%)EBNA1表达阳性,只有1例(3.4%)EBERs阳性,阳性细胞主要为癌细胞,阳性信号集中在核内;而在8例W片段阴性的标本中,未检测到EBNA1的表达,也未检测到EBERs;以上标本中均未检测到LMP1的表达。结论:EBV与部分中国人结直肠癌相关。     

LMP1 structure and signal transduction

The oncogenic Epstein-Barr virus (EBV)-encoded latent membrane protein 1 (LMP1) has structural features and functions reminiscent of a constitutively active TNF family receptor. LMP1 aggregates at the plasma membrane and initiates the activation of signalling pathways, such as NF- kappa B, the mitogen-activated protein kinases JNK and p38, the small GTPase Cdc42 and the JAK/STAT cascade. The constitutive engagement of these signals and the characteristic molecular interactions that regulate them provide the basis for the molecular explanation of the transforming properties of this key EBV protein.