室间隔缺损相关基因-BMPR下游基因的探讨

目的：探索室间隔缺损相关基因—骨形态形成蛋白受体IA(BMPRIA，又名ALK3)的下游心脏特异基因。方法：使用PCR选择性cDNA减数法和基因芯片(microarray)的方法筛选ALK3下游基因，比较两组mRNA。试验组的mRNA来自α-MHC Cre /-、ALK3 F/ 的11．5d小鼠胚胎心脏。对照组的mRNA来自α-MHC Cre /-、ALK3 F/-的11．5d小鼠胚胎心脏。结果与结论：在心脏特异的ALK3基因敲除下，血小板激活因子乙酰水解酶及转录因子Pax—8等基因的表达水平下降，其均是ALK3的重要下游基因，与室间隔缺损的形成有关；14—3—3蛋白β亚型及蛋白酪氨酸激酶等基因的表达水平上调，是骨形态形成蛋白信号途径的调控因子。     

Pax-8基因敲除小鼠心脏中Fgf-6基因表达的上调及其意义

目的探讨先天性心脏病相关基因转录因子Pax-8的下游基因以及Pax-8基因下调引起心脏形态改变的机制。方法分别提取Pax-8基因敲除小鼠纯合子（Pax-8 KO^-/-）和杂合子（Pax-8 KO^4/-）的心脏总RNA，利用含31802个小鼠基因的基因芯片检测Pax-8 KO^-/-和Pax-8 KO^-/-小鼠的基因表达水平，找出差异表达的基因，并经荧光实时定量PCR技术初步筛选出转录因子Pax-8的下游基因。结果基因芯片检测发现，Pax-8 KO^-/-小鼠较Pax-8 KO^＋／-小鼠有25个基因表达下调，另有17个基因表达上调，差异基因涉及细胞周期及信号转导的调节因子、直接参与代谢的酶以及核转录因子等。定量RT-PCR证实，Pax-8 KO^-/-小鼠Fgf-6基因的表达水平较Pax-8 KO^＋/-小鼠及野生型（Pax-8^＋/＋）小鼠分别上调1.13倍和1．67倍，差异均较显著（P〈0.01）。结论Fgf-6基因是转录因子Pax-8的下游基因，可能在心脏的发育过程中发挥着重要作用。     

Pax-8基因抑制后心肌细胞中UCP2的表达

目的 建立Pax-8基因敲除模型及Pax -8基因的体外干扰实验,探索心肌细胞中Pax-8基因抑制后解偶联蛋白2(uncouplingprotein 2,UCP2)基因表达的变化.方法 Pax-8基因敲除纯合子小鼠(Pax-8 KO-/-)为实验组,Pax-8基因敲除小鼠杂合子(Pax -8 KO+/-)和野生型(Pax-8KO+/+)为对照组;同时在体外实验的大鼠心肌细胞株中,加入Pax -8基因的小干扰RNA(Pax-8siRNA)为实验组,非特异性siRNA(NC siRNA)组和空白组为对照组.采用RT-PCR和Westernblotting技术测定UCP2的mRNA和蛋白质表达.结果 在Pax-8基因敲除动物模型中,与Pax-8基因敲除小鼠杂合子组和野生型组相比,实验组Pax-8基因敲除小鼠纯合子心脏组织UCP2的mRNA和蛋白表达均上调( P<0.05),而对照组之间差异无统计学意义(P>0.05);在体外干扰实验中的结果显示,与NC siRNA组和空白对照组比较,Pax-8siRNA组UCP2的mRNA表达和蛋白表达均上调(P<0.05),而NC siRNA组与空白对照组间差异无统计学意义(P>0.05).结论 Pax-8基因被抑制后,心肌细胞凋亡增加,UCP2基因表达上调,提示UCP2参与了心肌细胞凋亡的调控.     

Pax-8基因敲除小鼠心脏中NR4A1基因表达上调

目的：寻找先天性心脏病室间隔缺损相关基因——转录因子Pax-8保护细胞凋亡的途径。方法：提取Pax-8基因敲除小鼠纯合子（Pax-8 KO-/-）和杂合子（Pax-8 KO＋/-）的心脏总RNA,利用小鼠基因的基因芯片检测两组小鼠基因表达水平,找出差异表达的基因,并经半定量RT-PCR和荧光实时定量PCR技术初步筛选出转录因子Pax-8的下游基因。结果：基因芯片检测发现,与Pax-8 KO＋/-组相比,在Pax-8 KO-/-小鼠中有25个基因表达下调,17个基因表达上调。用半定量RT-PCR验证发现,nuclear receptor sub-family4,group A,member 1（NR4A1）基因在Pax-8 KO-/-组上调。定量RT-PCR亦证实在Pax-8 KO-/-组NR4A1基因的表达水平较Pax-8 KO＋/-组及Pax-8＋/＋（野生型）组分别上调1.53倍和4.79倍（P〈0.01）。结论：NR4A1基因受Pax-8基因调控,在Pax-8保护细胞凋亡途径中发挥作用。     

连接蛋白40、45在连接蛋白43基因敲除小鼠胚胎心脏的时空表达

目的 检测连接蛋白(Cx)40、45在Cx43基因敲除小鼠胚胎心脏的时空表达.方法 选取Cx43基因敲除胎鼠,通过PCR方法鉴定其基因型,以Cx43基因敲除胎鼠纯合子作为研究对象,野生型为对照组,获取胎龄10.5、11.5、12.5、13.5、14.5、15.5 d纯合子及野生型各2只胎鼠,免疫组化检测Cx40、Cx45在心脏各部位的表达,SCIM显微图像分析系统对染色强度进行定量分析.结果 (1)野生型小鼠心室原始小梁网在胎龄10.5 d就已经有Cx40表达(A值为8.6),随后在心房、心室、小梁网、房室间隔和主、肺动脉壁表达逐日增加,胎龄14.5 d在心室部位达到高峰(A值为94.8),然后逐渐减少;Cx43基因敲除小鼠胚胎心脏发育中Cx40在各部位的时空表达趋势与野生型相似,胎龄10.5 d在肌小梁A值为7.9,胎龄14.5 d心室部位为75.8.纯合基因敲除型胎鼠Cx40的表达量明显弱于野生型.(2)野生型小鼠肌小梁部在胎龄10.5 d出现Cx45的表达(A值为20.0),随后在房室各部位相继表达,胎龄12.5 d在心房部位达到高峰(A值为49.6),然后表达逐渐减少;Cx43基因敲除小鼠胚胎心脏发育中Cx45在各部位的时空表达趋势与野生型相似,胎龄10.5 d在肌小梁A值为17.8,胎龄12.5 d心房部位为31.5.纯合基因敲除型胎鼠Cx45的表达量明显弱于野生型.结论 Cx40和Cx45在Cx43基因敲除小鼠纯合子胎龄10.5～15.5 d这一心脏分隔、瓣膜发育的关键时期表达异常,可能与Cx43基因敲除小鼠心脏的异常发育有关.     

Pax-8基因敲除小鼠心肌细胞中差异表达的基因的研究

目的研究Pax-8基因敲除小鼠心肌细胞中差异表达的基因。方法利用基因芯片技术初筛在Pax-8基因敲除纯合子小鼠（Pax-8-/-）和杂合子小鼠（Pax-8＋/-）心肌组织中差异表达的基因,运用半定量RT- PCR检验初筛结果,并运用荧光实时定量PCR确定初筛所得的差异表达的基因在Pax-8基因敲除纯合子、杂合子以及野生型小鼠（Pax-8＋/＋）心肌组织中的表达情况。结果基因Bcl2l14、Fgf-6、Lck、Nr4a1以及Tcf7在Pax-8-/-中的表达分别是其在Pax-8＋/-中表达的2.07±0.08、1.13±0.01、1.30±0.01、1.53±0.08及0.75±0.03倍（均P＜0.01）。是在Pax-8＋/＋中表达的2.23±0.16、1.67±0.05、1.77±0.21、4.8±0.35及0.9±0.04倍（P＜0.01或0.05）。结论 Bcl2l14、Fgf-6、Lck、Nr4a1以及Tcf7上述5个基因在Pax-8基因敲除的心肌细胞中差异表达,参与Pax-8基因敲除小鼠的一系列心脏病理生理变化。     

小鼠叉头框C2基因变异致室间隔缺损

目的:探讨叉头框C2基因在心血管发生和发育中的作用。方法：通过敲除小鼠叉头框C2基因,解析敲除叉头框C2基因小鼠的心脏发育情况。结果：在98只新生鼠中仅有15只纯合子型叉头框C2基因突变鼠;这些纯合子型动物心脏的室间隔有细小的缝隙连通左右心室;原位杂交显示在10.5 d的胚胎心室内膜有Fox C2 mRNA的表达。结论：敲除叉头框C2基因可使小鼠室间隔发育缺损。     

心脏发育相关的微小RNA差异表达

目的 探讨微小RNA(miRNA)在心脏发育中的作用.方法 建立先天性心脏病-室间隔缺损相关基因Pax-8敲除小鼠模型Pax-8 KO-/-(纯合子)及Pax-8 KO +/-(杂合子),提取纯合子和杂合子小鼠心脏总RNA,采用含有567种miRNA的芯片进行检测并分析miRNA表达谱的差异,并通过荧光实时定量PCR技术对结果进行验证.结果 纯合子小鼠比杂合子小鼠左心室腔扩大,左心室壁肥厚,室间隔增厚,左室乳头肌肥大,心脏呈球形.超声结果显示杂合子小鼠左室收缩末期内径(LVIDs)[(1.23±0.25)mm比(1.93±0.50)mm]和左室舒张末期内径(LVIDd)[(2.13±0.18)mm 比(2.89±0.29)]均明显小于纯合子小鼠,差异有统计学意义(均P<0.01)心肌左心室壁以及室间隔组织可见大量的凋亡心肌细胞.在纯合子小鼠发现miRNA表达谱中差异表达的miRNA共10个, 其中2个miRNA表达下调,8个miRNA表达上调.荧光实时定量RT-PCR结果与芯片结果基本符合.结论 miRNA参与心脏发育过程,在先天性心脏病室间隔缺损的发病机制中可能发挥重要作用.     

Lck-Cre×Perp^flox/flox条件敲除小鼠的繁育及基因型鉴定

目的 制备Cre-LoxP重组酶系统调控下的T淋巴细胞Perp基因条件性敲除的纯合子小鼠并进行鉴定,为进一步在整体动物水平研究Perp基因在T细胞发育以及在自身免疫疾病发病中的作用提供研究平台.方法 将引进的Perp条件敲除小鼠和T淋巴细胞特异性表达Cre重组酶的Lck-Cre小鼠分别进行繁殖和鉴定,然后将两种小鼠进行杂交并对其子代小鼠的基因型进行鉴定,其子代基因型为Lck-Cre×Perpflox/flox的小鼠即为本实验所构建的T细胞Perp基因特异性敲除的纯合子小鼠.结果 Lck-Cre×Perp^flox/flox的纯合子小鼠被繁殖成功并准确鉴定.Lck-Cre×Perp^flox/flox小鼠脾脏CD3-细胞的Perp基因的RNA及蛋白表达水平与Lck-Cre×Perp^＋/＋小鼠相比显著降低.结论 本研究利用Cre-LoxP技术成功构建了T细胞特异性敲除Perp基因的纯合子小鼠,为进一步研究Perp基因在T淋巴细胞发育以及自身免疫性疾病发病中的作用提供了优良的工具.     

IL-31 RA基因敲除小鼠纯合子模型的建立

目的：建立IL-31RA基因敲除小鼠纯合子模型,为IL-31RA基因相关研究提供动物模型。方法：IL-31RA基因敲除小鼠严格按照SPF级要求的动物饲养标准进行饲养繁殖,采用聚合酶链式反应（ PCR）法鉴定子代小鼠的基因型,RT-PCR法鉴定小鼠IL-31RA mRNA的表达,Western blot鉴定IL-31RA蛋白的表达,HE染色观察小鼠重要脏器的形态学变化。结果：PCR法成功检测出子代小鼠的3种基因型,纯合子基因敲除小鼠未检测出IL-31RA mRNA和IL-31RA蛋白的表达,IL-31RA基因敲除小鼠的重要脏器的形态学特征与野生型小鼠比较无明显变化;基因敲除小鼠可成功饲养繁殖,亦可获得较多的基因敲除纯合子小鼠。结论：成功构建了IL-31RA基因敲除小鼠纯合子模型。     

高表达CYP2C8基因对动脉粥样硬化小鼠肿瘤坏死因子-α的影响

目的研究血管内皮高表达CYP2C8基因对动脉粥样硬化小鼠肿瘤坏死因子-α（TNF-α）表达的影响。方法以20周龄APOEKO＋/-CYP2C8Tg＋/-和CYP2C8Tg＋/-基因（血管内皮转CYP2C8＋/-基因）的小鼠为研究对象,相同基因背景和周龄的同窝APOEKO＋/-和C57BL/6小鼠设为对照。采用PCR技术鉴定小鼠CYP2C8＋/-基因;油红O染色检测APOEKO＋/-CYP2C8Tg＋/-、CYP2C8Tg＋/-、APOEKO＋/-和C57BL/6小鼠主动脉斑块形成面积;用Real-time PCR法检测各组小鼠的主动脉TNF-α基因表达水平;Western blot法分析各组小鼠主动脉TNF-α蛋白的表达情况;用ELISA法检测各组小鼠的血浆TNF-α水平。结果 APOEKO＋/-CYP2C8Tg＋/-和CYP2C8Tg＋/-小鼠主动脉斑块形成面积明显减少。Real-time PCR分析显示,高表达CYP2C8在主动脉中明显下调TNF-α基因的表达;Western blot分析结果显示,高表达CYP2C8在主动脉中明显下调TNF-α蛋白活性。在血清学上,高表达CYP2C8明显下调TNF-α水平。结论高表达CYP2C8基因能够降低动脉粥样硬化小鼠的TNF-α的活性。     

ALK-3、Pax-8基因抑制后大鼠心肌细胞中Smad1/5/8的表达

目的：抑制大鼠胚胎心肌细胞株中ALK-3、Pax-8基因的表达后,探索Smad1/5/8在其中所起的作用。方法：将H9C2（2-1）大鼠胚胎心肌细胞分为4组：针对Pax-8基因的小干扰RNA（Pax-8siRNA）组、ALK-3基因的小干扰RNA（ALK-3siRNA）组、阴性对照（NCsiRNA）组和空白对照组。前3组分别给予相应siRNA（5.0μL）和Lipofectamine2000（5.0μL）配制成的siRNA-脂质体复合物溶液,空白对照组给予等量的细胞培养基。采用qRT-PCR测定Pax-8和ALK-3的mRNA表达,Westernblot法检测磷酸化Smad1/5/8（p-Smad1/5/8）和半胱天冬酶（Caspase）-3表达。结果：与NCsiRNA组和空白对照组比较,Pax-8siRNA组的Pax-8mRNA表达分别下调50%（P＜0.05）和54%（P＜0.05）,ALK-3siRNA组的ALK-3mRNA表达分别下调49%（P＜0.05）和53%（P＜0.05）,而NCsiRNA组与空白对照组间差异无统计意义（P＞0.05）。与NCsiRNA组和空白对照组比较,ALK-3siRNA组p-Smad1/5/8的蛋白表达量分别下调58%（P＜0.05）和55%（P＜0.05）,Pax-8siRNA组p-Smad1/5/8的蛋白表达量差异无统计意义（P＞0.05）。NCsiRNA组与空白对照组间差异无统计意义（P＞0.05）。与NCsiRNA组和空白对照组比较,Pax-8siRNA组Caspase-3蛋白表达量分别上调76%（P＜0.05）和81%（P＜0.05）,ALK-3siRNA组Caspase-3的蛋白表达量分别上调135%（P＜0.05）和140%（P＜0.05）,而NCsiRNA组与空白对照组间差异无统计意义（P＞0.05）。结论：在大鼠胚胎心肌细胞株中对基因ALK-3、Pax-8干扰后能引起细胞凋亡蛋白Caspase-3明显增多,并且在ALK-3siRNA组发现Smad1/5/8蛋白磷酸化减少,而Pax-8siRNA组中未发现Smad1/5/8磷酸化减少,提示Smad1/5/8在基因ALK-3被干扰后引起细胞凋亡蛋白Caspase-3增多中起重要作用。     

Expression of pax-6 in rhesus monkey of optical defocus induced myopia and form deprivation myopia

Pax 6isoneofthehomeoboxgenesthatencodetrans criptionfactorsandfunctionbyregulatingtheexpressionofothergenes Itiswellknownthatpax 6playanimportantroleinthecourseofembryonicdevelopment 1 9Evidencesupportstheideathatpax 6genealsoplaysakeyroleduringtheprocessofeyedevelopment Insomeoculardiseasesinhumans ,forexamplecongenitalaniridia ,thedeletionormutationofpax 6genehasbeenfound 8,10 　Mutationsinpax 6geneinheterozygoushumansoftenresultineyeswithabnormalitiesofthecornea ,iris,lensandretina 10 　Ar…     

检测Cre位点特异重组酶活性的双报告转基因小鼠建立

目的建立用于检测Cre位点特异重组酶活性的双报告转基因小鼠.方法采用显微注射方法,将携带lacZ和人碱性磷酸酶(human alkaline phosphatase,hAP)报告基因的ZAP载体导入近交C57BL/6小鼠554枚受精卵;利用PCR,Southern blotting技术对其仔鼠进行基因整合鉴定;应用X-gal染色方法,对转基因小鼠胚胎进行转基因表达检测.结果存活的398枚受精卵被移入21只假孕受体小鼠输卵管;13只受体怀孕产下68只后代.合子存活率和出生率分别为71%(398/554)和17%(68/398).在68只小鼠中,5只雄性和4只雌性小鼠整合有双报告基因.转基因整合率和有效率分别为13%(9/68)和1.6%(9/554).9只首建鼠与正常C57 BL/6小鼠杂交产生F1代小鼠.F1代小鼠转基因的传递符合孟德尔规律,X-gal染色仅在3只首建鼠的13.5 d龄胚胎中观察到.结论检测Cre位点特异重组酶活性的双报告转基因小鼠已建立.     

PDK1 plays a critical role in regulating cardiac function in mice and human

Background PDK1 is an essential protein kinase that plays a critical role in mammalian development. Mouse lacking PDK1 leads to multiple abnormalities and embryonic lethality at E9.5. To elucidate the role of PDK1 in the heart, we investigated the cardiac phenotype of mice that lack PDK1 in the heart in different growth periods and the alteration of PDK1 signaling in human failing heart.Methods We employed Cre/loxP system to generate PDK1flox/flox： α-MHC-Cre mice, which specifically deleted PDK1 in cardiac muscle at birth, and tamoxifen-inducible heart-specific PDK1 knockout mice （PDK1flox/flox：MerCreMer mice）, in which PDK1 was deleted in myocardium in response to the treatment with tamoxifen. Transmural myocardial tissues from human failing hearts and normal hearts were sampled from the left ventricular apex to analyze the activity of PDK1/Akt signaling pathways by Western blotting.Results PDK1flox/flox： α-MHC-Cre mice died of heart failure at 5 and 10 weeks old. PDK1flox/flox-MerCreMer mice died of heart failure from 5 to 21 weeks after the initiation of tamoxifen treatment at 8 weeks old. We found that expression levels of PDK1 in human failing heart tissues were significantly decreased compared with control hearts.Conclusion Our results suggest that PDK1 signaling network takes part in regulating cardiac viability and function in mice, and may be also involved in human heart failure disease.