大豆GmGLDH基因的克隆、表达及生物信息学分析

为了探究大豆L-半乳糖酸-1,4-内酯脱氢酶基因Gm GLDH-Glyma.02G166300 (以下简称GmGLDH)的功能,本研究采用同源克隆法获得大豆GmGLDH基因,开展了相关生物信息学分析,并对其非生物胁迫下表达模式进行调查。结果表明,GmGLDH基因包含一个长度为1 752 bp的ORF序列,编码584个氨基酸。GmGLDH蛋白为亲水性较强的蛋白;二级结构中以无规则卷曲和α螺旋结构为主;预测亚细胞定位GmGLDH主要分布在线粒体中,分析结果并未发现跨膜结构域和信号肽结构;该蛋白序列中存在磷酸化位点56个。进化分析表明,克隆的GmGLDH氨基酸序列与菜豆、苜蓿的同源关系较近。基因上游顺式调控元件分析表明该基因可能参与光应答、激素响应、高温响应等,但光处理下大豆子叶中Gm GLDH基因的表达变化不大,且和子叶中抗坏血酸含量无相关性;4种非生物胁迫处理下大豆叶片中Gm GLDH基因是先下调后上调表达,和抗坏血酸含量变化呈反相关。本研究为进一步研究GmGLDH基因在大豆抗逆中的作用提供了重要的帮助。     

玉米热激蛋白基因ZmHSP90-1的克隆及表达分析

HSP90是普遍存在于原核和真核细胞中的一种高度保守的分子伴侣。本研究从玉米中克隆了一个HSP90同源基因, 命名为ZmHSP90-1基因, 并对其进行了初步的序列分析。该基因cDNA序列全长2 371 bp, 开放阅读框2 094 bp, 编码697个氨基酸, 蛋白质分子量约79.98 kD。蛋白结构预测及同源比对分析表明, ZmHSP90-1基因编码蛋白含ATPase位点和HSP90保守结构域, 并与拟南芥、水稻等多种物种的热激蛋白高度同源; 进化树分析表明ZmHSP90-1与拟南芥AtHSP90.1基因关系较近, 蛋白序列相似性达88.3%。目的蛋白亚细胞定位显示, ZmHSP90-1蛋白在细胞质中表达。实时荧光定量PCR分析表明, ZmHSP90-1对非生物胁迫高温、高盐、ABA、低温、干旱均具有明显的应答反应。推测ZmHSP90-1是玉米的一个胁迫相关基因。     

白羊草BiCDPK基因保守区的克隆及序列分析

为了研究CDPK基因的结构和功能,利用RT-PCR方法从白羊草中克隆得到BiCDPK基因,并对其进行生物信息学分析。结果表明：该BiCDPK基因cDNA长1048 bp,包含387 bp的开放阅读框,编码128个氨基酸。蛋白表现为弱酸性,且稳定、亲水,二级结构中以无规则卷曲和α-螺旋为主。亚细胞定位于细胞质中,无跨膜结构域,无信号肽。蛋白序列中存在1个丝氨酸磷酸化位点和3个苏氨酸磷酸化位点。进化分析结果表明,克隆的BiCDPK基因与玉米、小麦和水稻具有较高同源性,相似度分别是97%、86%、86%。为进一步研究BiCDPK基因的功能奠定了基础。     

白菜型冬油菜铜锌超氧化物歧化酶(Cu/Zn-SOD)基因的克隆及其在低温条件下的表达分析

超氧化物歧化酶(SOD)是一种逆境条件下清除细胞内活性氧的关键酶,而铜锌超氧化物歧化酶(Cu/Zn-SOD)是该酶系中最主要的活性氧清除剂,与植物的抗逆性关系密切。本研究根据已发表的十字花科植物Cu/Zn-SOD基因的编码区设计引物,采用RT-PCR克隆超强抗寒冬油菜陇油7号Cu/Zn-SOD的cDNA序列,该基因全长459 bp。生物信息学分析表明,该基因与甘蓝型油菜(Brassica napus) Cu/Zn-SOD基因同源性高达99%,编码1个亲水性稳定蛋白,无跨膜结构域和信号肽,具有胞质Cu/Zn-SOD超基因家族特有的序列特征和保守结构区域。半定量RT-PCR以及SOD酶活性分析表明,低温诱导条件下Cu/Zn-SOD基因差异表达,在白菜型冬油菜适应低温胁迫过程中发挥重要作用。超强抗寒冬油菜陇油6号品种低温诱导蛋白的SDS-PAGE分析以及蛋白串联质谱技术鉴定表明Cu/Zn-SOD是受低温诱导表达的抗逆基因。     

三色堇酪氨酸脱羧酶基因的克隆及其生物信息学分析

本研究以三色堇(Viola×wittrockiana Gam)为研究材料,采用RT-PCR和RACE等方法克隆可能与其花色形成相关的酪氨酸脱羧酶基因(Tyrosine decarboxylase),并对基因全长进行氨基酸序列的生物信息学分析。结果从三色堇中分离克隆出c DNA全长为1 634 bp的TYDC1和1 575 bp的TYDC2两个同源基因,包含相同的且长度为1 485 bp,编码494个氨基酸的开放阅读框;氨基酸多重序列比对和聚类分析结果表明:三色堇中的TYDC基因编码氨基酸和其他植物相关基因的一致性可达到82.43%,且与麻疯树的亲缘关系较近,达到73%;对TYDC蛋白的结构进行预测发现,TYDC蛋白是一种亲水性的不稳定蛋白,也是一种存在跨膜区域且不存在信号肽的非分泌蛋白;通过亚细胞定位预测分析表明该蛋白主要在细胞核和细胞质中表达。本研究为揭示三色堇TYDC蛋白的结构功能务实了基础,为进一步研究和验证该基因在三色堇中的表达提供理论依据。     

白菜型冬油菜铜锌超氧化物歧化酶(Cu/Zn-SOD)基因的克隆及其在低温条件下的表达

超氧化物歧化酶(SOD)是一种逆境条件下清除细胞内活性氧的关键酶,而铜锌超氧化物歧化酶(Cu/Zn-SOD)是该酶系中最主要的活性氧清除剂,与植物的抗逆性关系密切。本研究根据已发表的十字花科植物Cu/Zn-SOD基因的编码区设计引物,采用RT-PCR克隆超强抗寒冬油菜陇油7号Cu/Zn-SOD的cDNA序列,该基因全长459 bp。生物信息学分析表明,该基因与甘蓝型油菜(Brassica napus)Cu/Zn-SOD基因同源性高达99%,编码1个亲水性稳定蛋白,无跨膜结构域和信号肽,具有胞质Cu/Zn-SOD超基因家族特有的序列特征和保守结构区域。半定量RT-PCR以及SOD酶活性分析表明,低温诱导条件下Cu/Zn-SOD基因差异表达,在白菜型冬油菜适应低温胁迫过程中发挥重要作用。超强抗寒冬油菜陇油6号品种低温诱导蛋白的SDS-PAGE分析以及蛋白串联质谱技术鉴定表明,Cu/Zn-SOD是受低温诱导表达的抗逆基因。     

小麦Cyp450基因的电子克隆与生物信息学分析

为获得对小麦Cyp450基因及其编码蛋白质的理化性质与结构特性等,利用电子克隆方法克隆了一个新的小麦Cyp450基因,并对其编码的蛋白质进行了生物信息学分析。结果表明,该基因全长2155 bp,编码511个氨基酸;该蛋白序列的N端存在一个显著信号肽序列,属于CypX超家族,该蛋白定位于细胞质中,属于分泌途径中的信号肽蛋白,含有多个不同的磷酸化位点;二级结构以α螺旋（占48.14%）和无规则卷曲为主（占33.86%）,存在5个不稳定区,在85-511位处形成一个较大的球形蛋白域。该蛋白与大麦、二穗短柄草、水稻和高粱的同源Cyp450蛋白相似性较高,进化距离较近。获得了一个新的小麦细胞色素P450基因,并分析了其编码蛋白质的序列特性,为进一步实验克隆和研究其功能提供了理论基础。     

马铃薯可溶性淀粉合成酶SSⅢ基因克隆及生物信息学分析

用RT-PCR方法从马铃薯中克隆了可溶性淀粉合成酶SSⅢ基因的cDNA片段,序列分析表明该cDNA片段全长为3 967 bp,开放阅读框为3 693 bp,编码1 230个氨基酸.核酸序列同源性分析表明,该cDNA与已发表的马铃薯SSⅢ基因(X94400)具有99%同源性,氨基酸序列同源性达98%.应用生物信息学软件对SSⅢ基因分析表明:其编码的蛋白质具有多个磷酸化位点;蛋白质二级结构预测显示,有369个氨基酸可能形成α-螺旋结构,249个氨基酸可能形成β折叠,102个氨基酸可能形成β转角,510个氨基酸可能形成无规则卷曲;通过亚细胞定位可知,它是一种含有75个氨基酸的叶绿体转运肽蛋白.     

割手密DREB2类转录因子的克隆与比较分析

DREB类转录因子是一类植物中特有的,在非生物逆境胁迫中起重要作用的调控因子。本研究以割手密为材料,采用同源基因克隆的方法克隆获得2个DREB2类转录因子基因Ss DREB2-1和Ss DREB2-2(Gen Bank登录号分别为KU963264和KU963265)。序列分析表明,这2个基因的长度分别为814 bp和709 bp,分别编码262和227个氨基酸;预测其蛋白质分子量分别为28.66 k D和24.95 k D,等电点(PI)分别为5.42和6.47。氨基酸亲水/疏水性分析表明,这2个转录因子属于亲水性蛋白。多序列比对分析表明,两基因序列的相似性为98.7%。原核表达分析表明,这2个基因编码区能正常表达出目的蛋白,说明得到的这2个基因为功能基因而非假基因。     

玉米籽粒发育相关基因ZmMADS-RIN的克隆及表达分析

玉米籽粒发育及产量是玉米重要的经济性状。本研究以玉米骨干自交系郑58为试材,采用同源克隆法得到一个与玉米籽粒发育相关的基因ZmMADS-RIN。该基因的cDNA全长859 bp,开放阅读框为768 bp,编码255个氨基酸,与玉米B73中所对应的cDNA的编码区序列相比,共有6个SNPs位点的差异,3个氨基酸残基发生了变化。生物信息学分析表明,ZmMADS-RIN蛋白的相对分子量为29.23 kD,理论等电点(pI)为8.84,是一种亲水性蛋白,不含信号肽序列,也不含跨膜结构;具有5个磷酸化位点;二级结构中含有50.20%的α-螺旋(alpha helix)、27.45%的无规则卷曲(random coil)、14.51%的延伸链(extended strand)和7.84%的β-转角(beta turn);该蛋白位于细胞核内;其氨基酸序列中含有高度保守的MADS结构域、相对保守的K结构域、低保守的I结构域和最不稳定的C结构域,是典型的MIKC型MADS-box蛋白;系统进化树分析表明,ZmMADS-RIN蛋白属于AGL6分枝,与水稻基因OsMADS6的相似性最高,为89%。ZmMADS-RIN基因在玉米自交系郑58的籽粒中特异表达,在根及不同时期的叶片中没有检测到表达信号。荧光定量PCR结果显示,ZmMADS-RIN基因的表达量在玉米籽粒发育的不同阶段呈一定规律的变化,在授粉后0~20 d,呈上调表达趋势,授粉后25 d表达量迅速下降至较低水平,而在授粉后30~40 d则检测不到其表达。推测该基因可能与玉米籽粒的发育有关。     

斑茅铜锌超氧化物歧化酶基因(SaSOD-1)的克隆与序列分析

斑茅是甘蔗近缘野生种之一,具有较强的抗逆性,研究并开发利用斑茅的强抗逆基因,对甘蔗育种具有重要意义。本研究以高粱Cu/Zn-SOD(登录号:XM 002445626.1)cDNA序列为探针,对甘蔗属EST数据库进行检索、比对、拼接,通过设计特异引物,PCR扩增和序列分析验证,克隆得到2个Cu/Zn-SOD(SaSOD-1a和SaSOD-1b,登录号:KJ001795和KJ001796)基因全序列,其中SaSOD-1a基因组序列全长2 473 bp,SaSOD-1b基因组序列全长2 228 bp,均有8个外显子,7个内含子,其cDNA序列长度均为692 bp,编码206个氨基酸。序列比较分析表明,SaSOD-1a和SaSOD-1b序列相似性为98.6%,有8个单核苷酸多态性位点,蛋白质相似性为99.0%,2个氨基酸变异位点。用推导出的氨基酸序列与其它植物做同源进化分析,与高粱、玉米、谷子等比较均表现出较高的保守性。研究结果可为进一步了解超氧化物歧化酶与斑茅耐旱性的关系奠定基础。     

银缕梅MADS-box家族基因PsuAP1的克隆、生物信息学表达分析

本研究以珍稀濒危植物银缕梅为材料,利用同源克隆与RACE技术克隆得到一个AP1-like基因的c DNA全长序列,命名为Psu AP1。利用生物信息学方法对它所编码的氨基酸序列进行分析,结果表明,该基因序列全长916 bp,开放阅读框长度为747 bp,编码248个氨基酸,分子质量约28.62 k D,理论等电点为9.84,是一种不稳定亲水蛋白。保守结构域分析表明该基因属于MADS-box家族基因;序列比对分析显示其氨基酸序列与连香树相似性最高,达78.57%,进化树聚类分析也表明Psu AP1与连香树的氨基酸亲缘关系最近。亚细胞定位分析显示该蛋白定位于细胞核。二级结构中同时含有琢-螺旋、延伸链和无规则卷曲结构,分别占比47.18%、11.29%、41.53%。荧光实时定量PCR分析表明,Psu AP1基因在花及果实中均有大量表达,推测其与花的发育以及果实的成熟相关。Psu AP1基因的克隆以及表达分析使银缕梅开花调控机理的研究取得了新的突破,为该基因功能的进一步深入研究提供了实验材料以及理论基础。     

家稗丙酮酸磷酸双激酶(PPDK)基因的克隆及序列分析

为揭示C4植物家稗[Echinochloa crusgalli var frumentacea(Roxb.)W.F.Wight] PPDK结构和功能特点,探索改善作物高光效途径,采用RT-PCR技术,克隆了家稗[Echinochloa crusgalli var frumentacea (Roxb.) W. F. Wight]丙酮酸磷酸双激酶（PPDK）基因的cDNA全长。核苷酸序列分析表明, 该片段全长3 085 bp, 包含一个2 844 bp的ORF,编码948个氨基酸(GenBank登录号：AY 792619)。编码区核苷酸序列与高粱（Sorghum bicolor）、甘蔗（Saccharum officinarum）、玉米（Zea mays）等C₄型pdk基因同源率分别为85.1%、84.0%和82.0%;与水稻[Oryza sativa (japonica cultivar-group)] pdk基因同源性也高达82.6%。氨基酸序列进化树分析表明其与玉米、水稻等禾本科植物最为接近;半定量RT-PCR研究表明,pdk基因仅在绿色叶片中表达。     

芍药分生组织决定基因APETALA2(AP2)的克隆及生物信息学分析

花分生组织决定基因APETALA2(AP2)属于植物ABCDE模型基因,在花器官发育过程中起着重要的调控作用。为进一步了解芍药AP2基因的生物学功能,利用RACE扩增和测序技术克隆plAP2基因序列,利用生物信息学在线程序对其序列特征、蛋白结构及功能、亚细胞定位进行预测,并利用MEGA 5.0构建不同植物AP2分子进化树,最后利用qPCR检测其在内外花瓣中的差异表达情况。结果显示,克隆获得芍药AP2基因(plAP2)cDNA序列全长1 935 bp,其ORF全长为1 578 bp,编码525个氨基酸。蛋白结构与功能分析表明,plAP2蛋白为亲水性不稳定蛋白,无跨膜结构和信号肽,表明为非分泌蛋白;核定位信号位于氨基酸序列139-147(KKSRRGPRS);二级结构包括α-螺旋(24%)、β-折叠(19%)、β-转角(28%)和无规则卷曲(28%);plAP2蛋白存在8个糖基化位点和64个磷酸化位点,plAP2蛋白包含2个相同的保守结构域:AP2/(Ethylene-Responsive factors,ERF)(151-213aa和243-306aa)。亚细胞定位主要在细胞质(45.0%)中,少量分布于微体、线粒体基质间隙和溶酶体;进化树分析表明,芍药AP2基因与牡丹高度同源且亲缘关系最近;qPCR检测显示外瓣AP2表达量均极显著高于内瓣(P0.01)。克隆出芍药AP2全长cDNA序列,系统地揭示了plAP2蛋白基本结构、功能位点区域、细胞定位以及组织表达情况,为今后深入研究plAP2基因功能提供基础素材和理论参考。     

陆地棉GhCYP1基因的分离及其表达分析

应用SSH-PCR技术,在筛选到抗旱相关基因的EST序列基础上,采用RACE技术,分离克隆到全长为801bp,含编码序列(CDS)为522 bp的棉花抗旱相关基因GhCYP1.氨基酸序列比对发现,该基因与拟南芥、水稻、人等的亲环蛋白基因高度同源,都具有由11个连续氨基酸所组成的单结构域亲环蛋白典型结构,且在保守区都具有...     

甘蓝型油菜BnACP5基因克隆及表达分析

ACP5基因是参与植物体中脂肪酸代谢的重要基因之一,在甘蓝型油菜中该基因还未被深入研究。为了弄清楚BnACP5基因在甘蓝型油菜中的螺旋结构及功能,以湘油15为试材,采用同源克隆法得到一个与脂肪酸合成相关的基因BnACP5。BnACP5基因CDs序列长417 bp,共编码138个氨基酸。生物信息分析表明,BnACP5蛋白的相对分子质量15.25 ku,理论等电点(p I)为5.94,其不稳定参数为43.03,属于不稳定蛋白;其总疏水平均系数(GRAVY)为-0.148,是一种亲水性蛋白;不含跨膜结构,也不含信号肽序列;二级结构中含有59.42%的α螺旋、23.19%无规则卷曲、14.49%延伸链和2.90%β转角;其中18个可能是磷酸化位点;该蛋白位被定位在线粒体内;ACP氨基酸序列比对表明,植物ACP磷酸泛酰巯基乙胺结合位点周围的氨基酸序列高度保守;UPGMA聚类分析表明,BnACP5与白菜型油菜(XP_009111933.1)亲缘关系最近。荧光定量PCR结果显示,BnACP5基因的表达量在甘蓝型油菜种子发育的不同阶段呈一定规律变化,在授粉后15 d达到峰值,20 d呈下降趋势,25~35 d呈上升趋势,此后迅速下降,45 d表达量降到最低水平。由此分析得出,该基因可能与种子脂肪酸的合成有关。     

结球甘蓝花粉类钙调素蛋白基因BoCML49的克隆及表达分析

以结球甘蓝E1为材料,提取花粉萌发前和萌发后的混合花粉总蛋白,总蛋白双向电泳后通过MALDI-TOF-MS鉴定分析差异点,根据差异点分析结果,利用同源克隆得到甘蓝BoCML49基因707 bp的cDNA片段。通过对BoCML49基因的qPCR分析表明其表达量在花粉萌发前约为萌发后的2.73倍,表明BoCML49基因在花粉萌发后表达下调。通过5¢-Race和3¢-Race分别得到550 bp和721 bp大小cDNA片段,最终得到结球甘蓝BoCML49全长cDNA序列,开放阅读框位于125~
1 078 bp处,加尾信号(AATAAA)位于第1 222 bp处。通过cDNA推导得到的氨基酸序列分析表明,BoCML49编码317个氨基酸残基,预测分子量为33.51 kD,pI为6.93,经Smart-embl预测其含2个重要的EF-hand结构,分别位于序列第150~178和第216~244位氨基酸残基处,预测结果显示其含有7个α-螺旋和10个β-折叠结构。系统发育树表明结球甘蓝BoCML49与拟南芥AtCML49和AtCML50的亲缘关系较近。BoCML49基因的原核表达得到37.55 kD的融合蛋白。     

猪HK2基因的克隆及序列分析

为克隆猪己糖激酶2基因,分析其生物功能,采用已报道的人及小鼠HK2的cDNA序列为依据,利用电脑克隆策略获得的ESTs设计引物,扩增新的猪HK2基因cDNA序列。将PCR产物克隆测序,分析获得的核苷酸序列及其编码蛋白的特性,分离的开放阅读框全长2754bp,编码917个氨基酸,与人和小鼠的核苷酸序列同源率分别为90%和87%,与人和小鼠的氨基酸序列同源率分别为96%和94%,利用生物信息学软件分析出此蛋白的理化特性并预测了其蛋白结构,为进一步开展猪HK2基因的结构功能、表达调控的相关研究奠定了基础。     

马铃薯光敏色素作用因子基因PIF4的克隆及表达分析

本研究以栽培种马铃薯青薯9号为试验材料,利用同源克隆技术分离出一个光敏色素作用因子St PIF4基因,该基因开放阅读框长度为1 554 bp,编码517个氨基酸,含有HLH保守结构域;系统进化树分析表明,StPIF4与茄科植物聚为一类,和已测序的马铃薯DM亲缘关系最近。蛋白功能预测表明,StPIF4蛋白不具备信号肽位点和跨膜结构,其蛋白序列含有56个磷酸化位点,亚细胞定位于细胞核或细胞质中。RT-qPCR分析表明,StPIF4在根、茎、叶片、块茎和匍匐茎中均能表达,在叶片中相对表达量最高,根中较低。通过对StPIF4基因的克隆和表达分析,为深入马铃薯StPIF4的功能分析提供科学基础。     

谷子3-磷酸甘油醛脱氢酶基因的克隆与结构分析

3-磷酸甘油醛脱氢酶基因(GAPDH)在谷子盐旱胁迫早期高频率表达,为研究该基因在胁迫反应及其他代谢中的详细功能,本研究利用RACE技术克隆了谷子的GAPDH基因.该基因cDNA全长1328 bp,包括1008bp的开放阅读框,共编码338个氨基酸,肽段的分子量为35911.03Da,极性氨基酸占29.12%.序列比较分析发现,谷子的GAPDH同玉米的同源序列表现了最高的相似性,同水稻和小麦同源序列的相似性次之,同双子叶植物的同源序列则相差较远.