鸡卵煮沸对菌痢和轮状病毒特异性IgY活性的影响

目的探讨鸡卵煮沸对特异性IgY活性的影响,为食用特异性IgY防治消化道传染病奠定基础。方法用福氏志贺痢疾菌及轮状病毒Wa株免疫母鸡,制备特异性IgY。将含特异性IgY的鸡卵煮沸不同时间,观察卵清及卵黄性状;提取煮沸4min、6min和4℃对照的鸡卵特异性IgY,采用凝集试验、乳鼠抑菌试验及ELISA,检测鸡卵特异性IgY的活性。结果含特异性IgY的鸡卵煮沸4min,卵清与卵黄容易分离,与4℃保存的鸡卵特异性IgY活性差异无统计学意义;但煮沸6min时,卵清完全凝固,特异性IgY活性明显下降。结论鸡卵煮沸4min,对特异性IgY活性无明显影响,可直接食用煮沸4min的鸡卵,用于消化道疾病的防治。     

福氏2a志贺菌O-特异性多糖蛋白结合物的制备及其免疫原性

目的制备福氏2a志贺菌O-特异性多糖蛋白结合物,并检测其免疫原性。方法水解的福氏2a志贺菌O-特异性多糖在碳二亚胺[1-(3-dimethylaminopropyl)-3-ethylcarbodiimide hydrochloride,EDAC]的介导下,与己二酰二肼(adipic acid dihydrazide,ADH)缩合,制备衍生物,再与破伤风类毒素(tetanus toxoid,TT)结合制备福氏2a志贺菌O-特异性多糖蛋白结合物(以下简称结合物),并检测各项生化指标。分别用多糖、本实验制备结合物、氰基活化法和氨还原法制备的结合物免疫小鼠,0.2 ml/只(含2μg多糖),共免疫3次,每次免疫2周后检测小鼠血清抗体滴度,并计算抗体几何平均滴度(GMT)。结果结合物游离多糖和游离蛋白含量均较低,内毒素含量合格,KD值由约0.85(多糖)降至0.02(结合物)。各结合物均可诱导小鼠产生特异性抗体,且各组间GMT差异无统计学意义(P0.05),各针次间GMT均有显著提高(P0.05)。结论本实验制备的福氏2a志贺菌O-特异性多糖蛋白结合物具有良好的免疫原性,且制备方法步骤简单,反应条件温和,适合用于规模化生产。     

表达轮状病毒VP4抗原的重组腺病毒对新生小鼠的被动免疫保护作用

目的探讨表达轮状病毒VP4抗原的重组腺病毒(Ad5/VP4)对新生小鼠的被动免疫保护作用。方法在293细胞上扩增表达猴轮状病毒SA11株VP4抗原的重组腺病毒并纯化。将轮状病毒抗体阴性的小鼠交配后的雌性小鼠,分别通过肌肉注射、滴鼻和口服免疫纯化后的重组腺病毒,生产后第7天和第8天,用轮状病毒SA11(1·0×106PFU)口服攻击乳鼠2次,观察出现腹泻症状的乳鼠的比例,并用ELISA检测母鼠的血清以及乳鼠胃囊乳块中的轮状病毒特异性抗体。同时以含有部分E1区基因的腺病毒5型载体(Ad5)作为对照。结果经3种不同途径免疫母鼠后,在血清和乳汁中均能检测到轮状病毒VP4特异性抗体。经滴鼻免疫的母鼠喂养的乳鼠,经攻击后保护率为100%(11/11);经肌肉注射免疫的母鼠喂养的乳鼠,经攻击后保护率为30%(3/10);经口服免疫的母鼠喂养的乳鼠,经轮状病毒攻击后保护率为80%(8/10)。对照组的小鼠全部出现了腹泻症状。结论表达轮状病毒VP4抗原的重组腺病毒经滴鼻免疫母鼠后,能在乳汁中产生特异性的IgA和IgG抗体,并能保护新生小鼠对抗轮状病毒的攻击,保护率达100%。     

HpaA-VacA IgY对小鼠胃内感染幽门螺杆菌的预防作用

目的 研究HpaA-VacA IgY对小鼠幽门螺杆菌(Helicobacter pylori,H.pylori)胃内定植及引起炎症的预防作用,为制备集预防和治疗H.pylori感染为一体的IgY制剂奠定基础。方法将BALB/c小鼠随机分为阳性对照组、阴性对照组、感染预防组和炎症预防组,阳性对照组灌喂含108 cfu/ml H.pylori的菌液;阴性对照组灌喂布氏肉汤代替H.pylori菌液;感染预防组灌喂不同剂量的IgY后,再灌喂同等剂量的菌液;炎症预防组灌喂同等剂量的菌液后,再灌喂不同剂量的IgY。通过胃黏膜H.pylori培养和组织切片染色镜检观察H.pylori定植及炎症反应程度。结果 HpaA-VacA IgY剂量为6 mg/只时,对H.pylori感染的预防率为88.9%,预防效果较好,当HpaA-VacA IgY的剂量为8 mg/只时,能完全预防H.pylori感染及其所引起的胃黏膜炎症。结论小鼠口服HpaA-VacA IgY具有预防和治疗H.pylori感染的作用,可用于制备防治H.pylori感染的口服制剂。     

重组(酵母)乙型肝炎疫苗接种母鸡的体液免疫应答

<正>近年来,对鸡抗体研究较多,现已证明用病原体免疫母鸡可诱发机体产生特异性抗体,但用重组酵母乙肝疫苗刺激母鸡诱发免疫应答的研究还未见报道。为此本实验采用重组酵母乙肝疫苗免疫母鸡,观察其血清特异性抗体变化及其诱发体液免疫应答水平及免疫应答持久性。 首次免疫用乙肝疫苗10μg/只鸡（美国海南鸡）加福氏完全佐剂,经背部皮下多点及鸡翅下注射,后用同剂量疫苗加福氏不完全佐剂加强,每次免疫间隔2～3周,共加强免疫4     

抗咽喉炎常见菌IgY抗体的制备及其特性的研究

目的制备抗β-溶血性链球菌、G簇溶血性链球菌、金黄色葡萄球菌3种咽喉炎常见菌IgY抗体,并分析其特性。方法采用超声波破碎法将3种咽喉菌制备成可溶性抗原液,免疫产蛋母鸡,从鸡蛋黄中提取IgY抗体,应用免疫电泳、ELISA、SDS-PAGE检测抗3种咽喉菌IgY抗体的特性及热稳定性。结果抗原免疫母鸡10d后,鸡蛋黄中即有抗3种咽喉菌的IgY抗体产生,60d时抗体滴度高达1∶102400,IgY抗体滴度在室温可保持5~6个月不变。结论制备的抗3种咽喉菌IgY抗体滴度高,特异性强,稳定性好。     

旋毛虫iRNA对BALB/c小鼠体内SP2/0肿瘤细胞的抑制作用

目的观察旋毛虫免疫核糖核酸(iRNA)对BALB/c小鼠体内SP2/0肿瘤细胞的抑制作用。方法以不同剂量旋毛虫肌幼虫可溶性抗原免疫ICR小鼠、家兔和山羊,ELISA检测抗体效价达1:1024的最低免疫剂量确定为最佳免疫剂量,同时取各实验动物肝、脾和淋巴结,制备旋毛虫iRNA,并进行鉴定。以不同剂量iRNA接种BALB/c小鼠,并在不同时间接种SP2/0肿瘤细胞(试验分为先荷瘤和后荷瘤进行)。在荷瘤20d时,处死小鼠,测量肿瘤体积和重量,并检测脾脏T淋巴细胞亚群的变化。结果旋毛虫肌幼虫可溶性抗原的最佳免疫剂量分别为:ICR小鼠:300μg/只;家兔:2mg/只;山羊:20mg/只。制备的旋毛虫iRNA各项指标均合格。各试验组小鼠肿瘤体积和重量均小于相应的对照组,且差异均有统计学意义;各试验组小鼠的CD3+、CD4+及CD4+/CD8+比值较相应的对照组均有不同程度的增高。在后荷瘤试验组中,1mg组抑瘤效果最好;在先荷瘤试验组中,4mg组抑瘤效果最好。结论旋毛虫iRNA对BALB/c小鼠体内SP2/0肿瘤细胞的生长具有较强的抑制作用。     

CA16疫苗候选株特异性免疫血清保护性的初步评价

目的评价CA16 K168/8疫苗候选株免疫血清对不同CA16毒株的交叉中和能力及对致乳鼠麻痹CA16临床分离株的体内中和保护能力。方法将CA16 K168/8疫苗候选株病毒纯化液辅以弗氏佐剂经背部及侧腹部皮下多点注射免疫新西兰大白兔,制备高效价免疫血清。采用微量细胞病变法检测中和抗体效价;用中和抗体效价终浓度为32 U的特异性免疫血清对18株不同CA16临床分离毒株及15株EV71毒株进行交叉中和指数检测;选取中和抗体效价为16、32、64、128、256 U的特异性免疫血清对可致乳鼠产生明显麻痹作用的CA16 FY-18株进行体内中和保护水平检测。结果获得的兔抗CA16 K168/8血清对14株CA16毒株的中和效价为1∶1 024~1∶6 144,GMT值为1∶3 153;可于体外完全中和18株不同CA16毒株,中和指数为100~5 623.4,平均值为794.1,而对15株EV71临床分离株中和指数仅为0.32~5.62,平均值为2.2;体内中和保护水平随抗体效价升高而增加,呈量-效关系,当中和抗体效价达128 U时,可完全保护乳鼠不发生临床麻痹反应。结论 CA16 K168/8疫苗候选株特异性免疫血清体内、外试验结果表明其具有良好的免疫保护性。     

抗氯霉素卵黄抗体的制备及其分离纯化

将合成的氯霉素(CAP)与牛血清白蛋白(BSA)的偶联物(CAP-BSA)作为免疫抗原注射到母鸡体内得到氯霉素卵黄抗体(IgY). 比较了不同的提取方法,用优化的辛酸-硫酸铵沉淀法从卵黄液中初步提取卵黄抗体. 选用3,3￠-二氨丙基亚胺(DADPA)作为亲和凝胶与配基氯霉素之间的"间隔臂",合成了分离纯化抗氯霉素特异性IgY的亲和层析柱. 将IgY粗品经过亲和层析柱,得到的特异性IgY的抗体活性提高了10倍,收率约为3.3%.     

川葵精油的制备及杀菌性能研究

以同时蒸馏法提取川葵精油,经GC-MS分析检测得川葵挥发精油的主要成分为异硫氰酸酯类(ITCs);采用滤纸片法和肉汤稀释法研究其抑菌作用,结果表明,川葵精油对金黄色葡萄球菌、白色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、铜绿假单胞杆菌、沙门氏菌、宋内志贺氏菌、大肠杆菌、青霉菌表现出有不同强度的抑制作用,对8种供试菌的最小抑菌浓度为64～256 mg/mL,川葵精油具有一定的杀菌效果。     

抗轮状病毒IgY的研制

目的用鸡卵黄制备抗轮状病毒（ＲＶ）免疫球蛋白,预防和治疗婴幼儿ＲＶ感染。方法制备ＲＶ 抗原,通过不同途径免疫母鸡,几种纯化方法联合应用从鸡卵中提取特异性鸡卵黄抗体（ＩｇＹ）,进行理化学检定及动 物效力实验。结果免疫母鸡均可产生特异性ＩｇＹ,纯度可达９１％以上,产量为４４ｍｇ／蛋;可保护乳鼠兔受ＲＶ攻击; ＩｇＹ耐热、耐酸,室温保存半年、４℃两年效价不变。结论已成功地应用ＲＶ免疫母鸡制备出高效价特异性抗ＲＶ－ＩｇＹ。     

母牛分枝杆菌制剂对流感特异性Ig产生的影响

目的观察母牛分枝杆菌制剂(商品名微卡)单独或与流感疫苗联合接种后,对小鼠血清中流感病毒特异性Ig产生的影响。方法将不同剂量微卡(11.25、22.5和45.0μg/只)与流感疫苗(11.25μg/只)联合接种BALB/c小鼠,或接种微卡22.5μg/只后,感染流感病毒(2LD50),检测小鼠血清中流感病毒特异性IgM、IgG、IgG1、IgG2a和IgA产生的时间和水平。结果微卡与流感疫苗联合首次接种后4d,小鼠血清中流感病毒特异性IgG与IgG2a水平较流感疫苗组均明显升高,接种后13d差异无显著意义,对IgM和IgG1的产生无明显影响。45.0μg和22.5μg剂量与11.25μg剂量微卡+流感疫苗组IgG、IgG1、IgG2a和IgM水平比较,差异均无显著意义。接种微卡的小鼠,在感染流感病毒后10d,血清中流感病毒特异性IgA水平显著升高。结论微卡单独或与流感疫苗联合接种,对流感病毒特异性IgG、IgG2a和IgA的产生均有促进作用。     

幽门螺杆菌重组VacA蛋黄抗体的制备

目的研制高效价、高特异性的抗细胞空泡毒素VacA的鸡蛋黄抗体(IgY),为研制幽门螺杆菌(H.pylori)治疗性抗体奠定基础。方法用纯化的重组细胞空泡毒素抗原免疫22周龄洛曼产蛋母鸡,取免后所产鸡蛋,将蛋黄稀释、离心,收集上清,加硫酸铵沉淀。以ELISA间接法检测抗体效价,Bradford法检测蛋白含量,SDS-PAGE法检测相对分子质量及纯度。结果母鸡初次免疫后76d,抗体效价达到1∶6400,最高可达1∶12800。蛋黄抗体经纯化浓缩后,用SDS-PAGE分析,出现2条蛋白带,纯度可达80%以上,其含量为25·66mg/ml。结论已成功制备了抗重组细胞空泡毒素的特异性蛋黄抗体。     

猪胸膜肺炎放线杆菌血清1和5型交叉免疫保护研究

目的探讨猪胸膜肺炎放线杆菌(APP)不同血清型间交叉免疫保护的关系。方法以1型和5型APP参考菌株为实验对象,分别测定半数致死量(LD50),制备灭活细菌抗原和活菌抗原,免疫昆明小鼠,检测ELISA抗体水平及交叉免疫反应,并分别以10LD501型和5型APP菌进行攻击,观察小鼠保护力。结果1型和5型APP菌对小鼠的半数致死量分别为8.0×105.3和5.1×103.83CFU/LD50,死菌抗原和活菌抗原免疫小鼠均可产生高滴度抗体,且1型与5型间存在较强的交叉免疫反应。死菌抗原和活菌抗原免疫小鼠均能对本型APP菌攻击产生保护,保护率在80%以上。1型活菌免疫小鼠对5型菌攻击保护率为70%,5型活菌免疫小鼠对1型菌攻击保护率为90%,1型、5型死菌免疫小鼠对5型、1型菌交叉攻击均无保护作用。结论1型、5型APP活菌和死菌免疫小鼠均可对本型菌攻击产生保护,两型间存在较强的交叉免疫反应,但只有活菌免疫可以产生较好的交叉免疫保护,死菌免疫不能产生交叉免疫保护。     

乙肝乙脑麻疹多表位噬菌体疫苗的构建及其免疫原性

目的构建乙肝乙脑麻疹多表位噬菌体疫苗,并检测其免疫原性。方法将PCR方法合成的乙肝乙脑麻疹多表位基因COM插入T7噬菌体基因组中,使其与噬菌体10B蛋白融合,展示在T7噬菌体表面,构建成多表位噬菌体疫苗COM/T7。分别以1010pfu/只和1012pfu/只两种剂量,通过腹腔、皮下和鼻腔3种途径免疫昆明小鼠,ELISA检测小鼠特异性抗体水平。结果重组噬菌体COM/T7经PCR鉴定证明构建正确。乙肝乙脑麻疹多表位噬菌体疫苗能诱导小鼠产生针对各表位的特异性IgG抗体。在3种免疫途径中,腹腔免疫效果最好。免疫剂量与诱导的抗体水平在一定范围内呈正相关。多表位噬菌体疫苗诱导的抗-HBs和抗-JEV水平高于常规疫苗,而抗-MV水平低于常规疫苗。结论构建的乙肝乙脑麻疹多表位噬菌体疫苗具有良好的免疫原性。     

肺炎链球菌补体结合蛋白C3-BP的纯化及其免疫效果

目的对9V型肺炎链球菌补体结合蛋白C3-BP进行纯化及免疫效果分析。方法通过三氧醋酸沉淀、离子交换层析、凝胶过滤层析和亲和层析等方法,从9V型肺炎链球菌培养上清中提取C3-BP,Lowry法检测其浓度,SDS-PAGE检测其纯度及大小,Western blot检测其补体C3结合活性。将纯化蛋白免疫NIH小鼠,ELISA法测定小鼠血清IgG抗体,MTT法测定小鼠脾淋巴细胞增殖情况,活菌攻击,检测其交叉保护效果。结果经纯化的表面蛋白C3-BP,其相对分子质量约为90 000,为单链蛋白,浓度为0.21 mg/ml,纯度为90.7%,具有与补体C3结合的特性。免疫小鼠后,抗体滴度达到1∶38 802。免疫组小鼠脾脏与胸腺淋巴细胞代谢活性明显增强,与对照组相比,二者刺激指数之间差异有显著意义。9V型C3-BP免疫小鼠后,不仅对9V型肺炎链球菌株有保护作用,对2型、6B型和14型肺炎链球菌菌株也有保护作用。结论摸索出了一种纯化肺炎链球菌表面蛋白C3-BP的方法,纯化的C3-BP具有不依赖血清型的交叉保护作用,而且体液免疫及细胞免疫效果良好。     

内源性危险信号低分子量硫酸乙酰肝素的免疫佐剂作用

目的 研究内源性危险信号低分子量硫酸乙酰肝素(Heparan sulfate,HS)的免疫佐剂作用。方法按照HS的免疫剂量、免疫途径和免疫程序将ICR小鼠分组,同时设HBsAg对照组和铝佐剂对照组,分别于末次免疫后4、8、12、16、20和24周,采用ELISA法检测小鼠血清中的特异性IgG抗体水平;选择体液免疫效果最佳的剂量组免疫BALB/c小鼠,同时设空白对照组、抗原对照组和铝佐剂对照组,于末次免疫后8周,采用乳酸脱氢酶(LDH)法检测细胞杀伤活性。结果空白对照组小鼠在各检测时间点均未见IgG抗体产生。除第4组外,各实验组抗体滴度均在末次免疫后第8周达峰值,随着时间的推移,抗体水平呈下降趋势。第43组抗体水平升高快,峰值高,持续时间长;在实验剂量范围内,随着HS剂量的增加,针对HBsAg的特异性抗体水平也增加;HS的最佳剂量为100μg;皮下注射HS的免疫增强作用最佳,优于肌肉和鼻腔免疫;免疫程序对HS的佐剂作用影响不大。HS能诱导小鼠产生特异性的CTL细胞免疫效应,细胞杀伤活性显著高于空白对照组、抗原对照组及铝佐剂对照组(P﹤0.001)。结论 HS具有免疫佐剂作用,既能有效增强特异性体液免疫应答,又能显著诱导CTL细胞免疫效应,是一种优于铝佐剂的潜在人用疫苗佐剂。     

质粒剂量和免疫次数对基因枪免疫DNA疫苗免疫反应的影响

目的研究质粒剂量和免疫次数对基因枪免疫DNA疫苗免疫反应的影响。方法构建携带HIV-1 Env gp145基因的DNA疫苗质粒p1.0-Env,分别采用肌肉注射和基因枪方法免疫BALB/c小鼠。其中,基因枪免疫采用不同剂量或不同次数。ELISA法检测小鼠体内Env特异性抗体水平。结果基因枪免疫小鼠诱导的抗体水平显著高于肌肉注射免疫。在0.1～2.25μg剂量范围内,基因枪免疫小鼠体内的Env特异性抗体水平随疫苗剂量的增加不断提高。加大免疫剂量至5μg和10μg,不能提高体液免疫反应水平。基因枪免疫1次和2次所诱导的特异性抗体水平很弱,免疫3次可诱导高水平的抗体应答。结论基因枪免疫能有效提高DNA疫苗所诱导的抗体应答,小鼠的最适免疫剂量约为2.25μg,2.25μg免疫3次可诱导较强的体液免疫反应。     

HPV16 MuE6/E7嵌合蛋白的原核表达、纯化及其免疫效果

目的表达HPV16型MuE6/E7嵌合蛋白,并检测其免疫原性及抗肿瘤活性。方法将构建的重组MuE6/E7蛋白的表达载体转化大肠杆菌BL21(λDE3)进行诱导表达,表达的包涵体蛋白经分离、纯化、变性及复性后,通过离子交换和分子筛层析进行纯化。纯化蛋白经SDS-PAGE、Western blot、HPLC和质谱分析鉴定,并免疫C57BL/6小鼠,检测其免疫原性和抗肿瘤活性。结果重组MuE6/E7蛋白相对分子质量约为21 000,表达量约为23.06%,表达形式为包涵体,经复性、纯化后,纯度达97.17%。免疫3针后,小鼠可产生高滴度的HPV特异性抗体,并且与注射剂量呈正相关。免疫小鼠能抵抗TC-1肿瘤细胞的攻击,并可延长TC-1致瘤小鼠的存活期。结论已表达并纯化了重组MuE6/E7蛋白,其对TC-1致瘤小鼠具有一定的免疫治疗作用,为进一步研制HPV治疗性疫苗奠定了基础。