TGF-β1对肝癌细胞系Hep3B中干性相关基因表达的影响

有研究表明TGF-β1可以诱导诸多上皮来源的癌细胞和正常细胞发生EMT并使其功能发生改变。实验就TGF-β1对肝癌细胞系Hep3B的作用展开研究:通过CCK8检测TGF-β1对Hep3B细胞增殖的影响,RT-PCR实验检测TGF-β1处理后细胞中EMT及干性相关基因的表达变化。结果表明:TGF-β1对Hep3B细胞的增殖无抑制作用;TGF-β1处理Hep3B细胞6d后EMT相关基因的mRNA表达水平并无显著改变,但TGF-β1可上调Hep3B细胞干性基因Oct-4,Klf-4,Nanog,C-myc的表达,并下调分化基因albumin的表达。结果提示TGF-β1一定程度上影响肝癌细胞系的干性基因表达,但并不一定是以发生EMT为前提的。     

携带EGFP报告系统的五型腺病毒对肝癌干细胞的感染效率

利用携带EGFP报告系统的五型腺病毒（Ad5-EGFP）作为工具,以发生上皮-间质转化（epithelial—mes—enchymaltransition,EMT）前后的肝癌细胞系Huh7为研究对象,采用流式细胞仪、荧光定量PCR等技术开展腺病毒对发生EMT前后的肝癌细胞系Huh7的感染效率的对比研究。实验结果表明：Ad5-EGFP对上皮生产因子β1（TGF-β1）处理前的Huh7细胞系感染率比TGF-β1处理后的细胞系感染率更高。同时Ad5-EGFP的主要受体-CAR在肝癌细胞系Huh7发生EMT后表达有所降低。证实了肿瘤干细胞更难被腺病毒侵染,为了适应临床治疗的需要,腺病毒作为基因治疗的载体需要进一步被改造。     

雷公藤红素对人肝癌细胞Hep3B中HIF-1α表达的影响

为探讨雷公藤红素对人体肝癌细胞Hep3B中缺氧诱导因子（HIF-1a）活化的影响,利用氯化钴（CoCl2）模拟肝癌细胞缺氧模式,采用双荧光素酶报告基因法检测雷公藤红素对HIF-1α的转录活性,蛋白免疫印迹实验检测雷公藤红素对HIF-1α蛋白质的表达水平,RT-PCR检测雷公藤红素对HIF-1α下游靶基因血管内皮生长因子（VEGF）mRNA的表达水平,电泳泳动度移动分析（EMSA）检测雷公藤红素对HIF-1αDNA的结合能力.结果显示：雷公藤红素呈剂量依赖性抑制了HIF-1α蛋白质的表达水平,降低了肝癌细胞中VEGFmRNA的表达水平并有效抑制了HIF-1α蛋白的DNA结合能力.这表明,雷公藤红素可以抑制肝癌细胞中HIF-1α的活性,这可能是其抗肿瘤的机理之一.     

蛋白酶体抑制剂MG132诱导肝癌细胞Hep3B凋亡的机制

研究探讨蛋白酶体抑制剂MG132(Z-Leu-leu-leu-CHO)诱导肝癌细胞Hep3B凋亡的作用与机制.实验采用不同浓度梯度和时间梯度,通过荧光显微镜、Hoechst33342染色、MTT检测和Western 印迹分别检测MG132 对Hep3B细胞的形态、凋亡小体形成、细胞存活率、细胞凋亡相关蛋白表达的影响.结果表明,MG132能够选择性抑制肝癌细胞生长,对正常肝细胞没有明显影响.此外,MG132可以通过内质网应激途径诱导肝癌细胞Hep3B凋亡,呈现剂量和时间的双重依赖性.提示通过抑制蛋白酶体来达到诱导肿瘤细胞凋亡的方法是可行的,MG132此类药物的研究与应用将为肿瘤治疗提供新的选择.     

增殖型溶瘤腺病毒SG511-pHSP70-IL24体外杀伤肝癌细胞的研究

研究溶瘤腺病毒SG511携带由热激蛋白70(hsp70)启动子调控IL-24构成的增殖型溶瘤腺病毒SG511-pHSP70-IL24对人肝癌细胞株的体外杀伤效果.实验采用ELISA法检测不同MOI值感染肝癌细胞SMMC-7721和Hep3B细胞3 d后IL-24的表达;MTT法检测SG511、Ad11-IL24以及SG511-pHSP70-IL24对肝癌细胞株SMMC-7721、Hep3B以及人正常成纤维细胞株MRC-5及BJ增殖的抑制作用;并通过结晶紫实验检测进一步证明联合用药对肿瘤细胞的杀伤情况.ELISA检测到SG511-pHSP70-IL24感染SMMC-7721和Hep3B细胞后,IL-24有明显表达;MTT实验结果表明SG511-pHSP70-IL24对肿瘤细胞的杀伤能力比SG511和Ad-IL24更强.同时结晶紫实验也证明了SG511-pHSP70-IL24对肿瘤细胞的杀伤能力比SG511和Ad-IL24更强.增殖型溶瘤腺病毒SG511-pHSP70-IL24相比腺病毒Ad11-IL24以及SG511,对肝癌细胞有较明显的生长抑制和凋亡诱导作用.     

组蛋白去乙酰化酶抑制剂SAHA联合ZD55-TRAIL溶瘤腺病毒对肝癌细胞杀伤作用的研究

研究组蛋白去乙酰化抑制剂SAHA(suberoylanilide hydroxamic acid)联合ZD55-TRAIL对人肝癌细胞株的体外杀伤效果,实验采用MTT法检测SAHA、ZD55-TRAIL以及二者联合对肝癌细胞株Huh-7、Bel-7404、Hep3B以及人正常肝细胞株QSG-7701增殖的抑制作用;利用Hoechst33342染色对联合处理的细胞进行凋亡形态学观察;通过结晶紫实验进一步检测联合用药对肿瘤细胞的杀伤情况;通过Western blot实验在蛋白水平上检测一些凋亡相关蛋白表达情况的变化.实验结果表明:SAHA联合ZD55-TRAIL处理3d后对肝癌细胞株Huh-7的增殖抑制率达到50％,对Hep3B、Bel-7404也达到近40％的杀伤效率,并且联合治疗后对人正常细胞株QSG-7701未见明显的毒副作用.同时结晶紫实验也证明联合治疗对肿瘤细胞的杀伤力强于用SAHA或ZD55-TRAIL单独使用.Western blot实验证明了药物和病毒的联合作用使促凋亡蛋白Bcl-2,Bcl-xL的表达量明显减少,caspase-8和caspase-9蛋白也有相应剪切现象的发生.流式细胞仪同样检测出SAHA和ZD55-TRAIL联合作用对肝癌细胞有很好的杀伤作用.     

肝癌细胞系Huh7中肿瘤干细胞分离及鉴定

利用肿瘤干细胞具有自我更新能力的特点,首次采用悬浮培养技术从Huh7细胞系中得到肝癌（干）细胞球,并通过RT-PCR、流式细胞术和免疫荧光等方法检测它们的干细胞标记和分化标记.结果显示Huh7（干）细胞球的干性相关基因表达上调;分化相关基因表达下调;流式细胞仪检测结果表明88.82％的Huh7（干）细胞球表达EpCAM基因,与正常Huh7细胞相比表达上调.表明该方法具有富集肝癌干细胞的效果,为以后肝癌干细胞建立更高效的分离方法提供了一种新的技术方法.     

稳定下调SIRT1基因表达的肝癌细胞系的构建

SIRT1(silent information regulator 1)与多种肿瘤的发病过程关系密切,但是其在肝癌中的作用尚不明确。为了研究SIRT1与肝癌的关系,通过构建慢病毒载体,病毒转染和包装,嘌呤霉素的筛选等实验方法,成功构建能稳定下调SIRT1基因表达的肝癌细胞系Hep3B和PLC/PRF/5,为后期进一步研究SIRT1在肝癌发病过程中的功能奠定了基础。     

以干细胞特异性转录因子诱导小鼠肝癌细胞Hepa1—6重新编程的研究

利用逆转录病毒携带小鼠Oct4、Klf4、SOx2和c-Myc基因介导Hepa1-6小鼠肝癌细胞系重新编程,得到一团自律性跳动的细胞团,及一群形态学上明显类似于小鼠胚胎干细胞的克隆样细胞团。经长期传代,克隆样细胞能保持其形态。检测证实,这些克隆样细胞团表达Oct4、Sox2蛋白。证实,Hepa1-6小鼠肝癌细胞可以被携带Oct4、KK4、SOX2和cMyc基因的逆转录病毒感染的方法诱导重新编程。     

以干细胞特异性转录因子诱导小鼠肝癌细胞Hepa1-6重新编程的研究

利用逆转录病毒携带小鼠Oct4、Klf4、Sox2和c-Myc基因介导Hepa1-6小鼠肝癌细胞系重新编程,得到一团自律性跳动的细胞团,及一群形态学上明显类似于小鼠胚胎干细胞的克隆样细胞团。经长期传代,克隆样细胞能保持其形态。检测证实,这些克隆样细胞团表达Oct4、Sox2蛋白。证实,Hepa1-6小鼠肝癌细胞可以被携带Oct4、Klf4、Sox2和c-Myc基因的逆转录病毒感染的方法诱导重新编程。     

RT-PCR法检测污染物甲基汞对调钙质基因表达的抑制

应用RT -PCR方法 ,通过用不同浓度的甲基汞对Hep2B细胞株进行不同时间长短的处理 ,检测其调钙质的mRNA表达水平 ,发现微量的甲基汞处理就可以引起细胞株细胞损伤 ,同时抑制调钙质mRNA的表达 ,进一步证实了在肝脏损伤的病理状态下调钙质基因的表达减少 ,从而为检测环境中甲基汞的含量提供了一个可能的分子生物学手段 .     

结直肠癌中原癌基因DEK与IMP3/Ezrin通路的相关性

前期研究表明:IMP3/Ezrin基因是上皮细胞-间质细胞转换(EMT)中的主要构成基因,DEK可以影响结直肠癌细胞的迁移、粘附和侵犯等生物学行为。为了进一步研究DEK与IMP3/Ezrin在结直肠癌中的相关性,首先分析检测了255例结直肠癌和120例癌旁组织蜡块中DEK与IMP3/Ezrin的蛋白水平表达及15例结直肠癌及其癌旁新鲜组织中DEK与IMP3/Ezrin的mRNA水平表达,继而检测结直肠癌细胞中DEK基因敲除前后DEK/IMP3/Ezrin蛋白和mRNA水平变化。结果显示:DEK、IMP3/Ezrin蛋白在255例结直肠癌组织与120例癌旁良性组织中的阳性表达率有明显差异,而15例结直肠癌及癌旁新鲜组织中三种基因mRNA水平以及结直肠癌细胞系中三种基因的蛋白水平也呈现相近的趋势。利用RNAi将DEK进行敲除结果显示:DEK敲除后4种结直肠癌细胞系中的IMP3 mRNA均明显下调,而Ezrin mRNA均明显上调。由此推测,DEK可能通过调节IMP3/Ezrin信号通路相关蛋白促进结直肠癌的演进。     

融合蛋白EGFP-PPA原核表达及标记肿瘤细胞研究

肿瘤细胞糖基化改变是非常普遍的现象,与恶性肿瘤的发生发展有着密切的关系。掌叶半夏凝集素(Pinellia pedatisecta agglutinin,PPA)是一种甘露糖特异性结合凝集素,与增强型绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescent protein EGFP),通过基因工程技术形成融合基因,并在大肠杆菌中表达纯化了EGFP-PPA融合蛋白。实验结果表明,此融合蛋白可以识别实体肿瘤细胞表面的一部分标志,如Hep3B、Hu7、PLC、BEL-7404以及A549,而不能识别肝正常细胞L02,提示实体瘤细胞表面显露的甘露糖残基被此融合蛋白所识别,说明PPA识别具有甘露糖表型的实体瘤细胞表面的一部分,这些实验结果为进一步阐明甘露糖显露细胞在肿瘤发生发展中的作用提供了新的研究手段。     

大黄素通过调节体外扩增NK细胞杀伤肺癌A549细胞的实验研究

为了探讨大黄素增强体外扩增NK细胞抗肺癌A549细胞杀伤效力的相关机制,体外培养A549肺癌细胞系和体外扩增NK细胞,将大黄素分对照组、低、中、高浓度组(0、1、12. 5、25μg/m L),通过MTT检测不同浓度大黄素在不同作用时间对A549细胞生长的抑制作用;通过钙黄绿素释放实验检测经不同浓度大黄素处理的NK细胞对A549细胞的杀伤效力;通过流式细胞仪检测经不同浓度大黄素处理的NK细胞特异性配体MIC A/B、HLA-ABC的表达。结果显示,大黄素能有效抑制A549细胞生长,增强NK细胞对A549细胞的杀伤效力,上调NK细胞活化性受体相关配体MIC A/B的表达,下调NK细胞抑制性受体相关配体HLA-ABC表达。因此,大黄素可以通过调节MIC A/B、HLA-ABC分子表达,增强体外扩增NK细胞对A549细胞的杀伤效力,为中药单体调节免疫细胞抗肿瘤在临床应用方面提供实验室依据。     

纳米磷灰石对肝癌癌基因表达的影响

研究纳米磷灰石体外对人肝癌细胞系Bel-7402的作用机理。应用均相共沉淀法室温下合成纳米磷灰石，用透射电镜和电位粒度仪进行表征；利用透射电镜、原位杂交细胞化学检测其对人肝癌细胞系Bel-7402 c-myc和p53基因表达的影响。纳米磷灰石呈均匀分散的针状颗粒．粒径范围在67．5～88．3nm之间。可使肝癌细胞体积增大，胞质空泡化，线粒体肿胀；部分细胞核内染色质分散，凝集在核膜周围，呈团块状，核膜间隙不等，胞浆溶解。抑制c-myc和增强p53基因的表达。纳米磷灰石在体外通过下调c-myc和上调p53基因的表达，致肝癌细胞胀亡。     

乙酰肝素酶-1/多配体蛋白聚糖-1轴对肝癌细胞侵袭能力的影响

乙酰肝素酶-1(Heparanase-1,HPA-1)/多配体蛋白聚糖-1(Syndecan-1,SDC-1)轴调控多种肿瘤细胞的转移。肿瘤细胞侵袭能力的改变是导致肿瘤脱离原发组织,进而向远隔器官转移的关键启动因素。为了检测Heparanase-1/Syndecan-1轴在肝癌细胞中是否存在及其对肝癌细胞侵袭能力的影响,我们利用SDC-1小干扰RNA及重组HPA-1(rHPA-1)分别处理肝癌细胞Hepa1-6,再通过反转录PCR(RT-PCR)、Western-blot及免疫细胞化学检测SDC-1表达,应用体外基质胶侵袭实验观察细胞侵袭能力的改变。结果显示:SDC-1小干扰RNA明显抑制SDC-1表达;r HPA-1处理显著下调SDC-1蛋白的分子量,但没有改变SDC-1的mRNA表达;SDC-1表达下调及rHPA-1处理均促进Hepa1-6细胞的侵袭。因此得出结论:HPA-1通过作用于SDC-1蛋白,即形成Heparanase-1/Syndecan-1轴启动肝癌细胞转移。     

PBAE 447的合成鉴定及其基因传递效率

PBAE 447是一种能够携带负电DNA进入细胞进行表达的阳离子聚合物。通过4-氨基-1-丁醇和1,4-丁二醇二丙烯酸酯进行加成反应,并加入1-(3-氨丙基)-4-甲基哌嗪封端合成PBAE 447,所得产物数均分子量大小为17586,并使用ICP4、LoVo、B16R,CT-26做为转染用细胞系,绿色荧光蛋白(GFP)为报告基因。结果表明,PBAE447能够携带基因进入多种肿瘤细胞系进行表达。     

多配体蛋白聚糖-1细胞定位对人肝癌细胞侵袭的影响

为研究SDC-1的细胞定位对人肝癌细胞侵袭能力的影响,利用HPSE小干扰RNA和HPSE抑制剂低分子量肝素处理高转移人肝癌细胞MHCC97-H,通过实时定量PCR方法检测HPSE的mRNA表达,应用免疫细胞化学方法分析SDC-1的细胞定位,通过基质胶侵袭实验观察细胞侵袭性的改变.结果显示:HPSE小干扰RNA能够显著干...     

壳聚糖GFP质粒纳米粒对肿瘤细胞的转染效率研究

用绿色荧光蛋白（GFP）基因做报告基因，制备壳聚糖GFP质粒纳米粒，体外转染人肝癌细胞Hep G2和肺癌细胞3.549，定性评价纳米粒的转染效率和细胞毒性。结果表明壳聚糖GFP质粒纳米粒能转染两种细胞并在表达GFP，但两种细胞的转染效率不同，且该纳米粒能抑制两种细胞生长。     

纳米磷灰石对人肝癌细胞端粒酶基因表达的影响

利用原位杂交细胞化学的方法对纳米磷灰石作用 4 h后的人肝癌细胞进行端粒酶基因的检测来研究纳米磷灰石对人肝癌细胞端粒酶基因的影响 ,探讨纳米磷灰石抗癌的机制。结果显示人肝癌 Bel- 74 0 2组的端粒酶阳性细胞率为 88.4 9% ,顺铂组的端粒酶活性为 2 5 .6 % ,纳米磷灰石组为 6 3.6 % ,二者与 Bel- 74 0 2组端粒酶活性相比呈明显下降 ,并存在明显的差异性 (p<0 .0 1)。表明纳米磷灰石对人肝癌细胞端粒酶基因的表达具有明显的抑制作用