荧光PCR检测副溶血性弧菌致病基因方法的建立

建立一种准确、快速、特异地检测副溶血性弧菌(Vibrio parahaemolyticus,VP)致病基因的荧光PCR方法。方法 用7株已知其致病基因的VP标准菌株和检出菌分别对6种VP致病基因荧光PCR检测文献方法和本文建立的方法进行验证比较,并用6种常见食源性病原菌对新建方法的特异性进行检验。结果 所建方法能够同时检测VP的3种溶血素,其检测结果与菌株的溯源结果及普通PCR结果完全一致,且与常见食源性病原菌无交叉反应。结论 本文建立的荧光PCR体系能够准确、快速、特异地检测VP的致病基因,具有较好的实用性。     

水产品中副溶血性弧菌实时荧光PCR检测方法

建立了一种特异、灵敏、稳定的副溶血性弧菌(Vibrio parahemolyticus,VP)致病基因的检测方法。对已建立的副溶血性弧菌致病基因tdh、trh和tlh荧光PCR方法的特异性、灵敏度和重复性进行检测,以验证该方法的有效性。该方法与副溶血性弧菌反应良好,与其他弧菌属和非弧菌属的6株常见食源性致病菌无交叉反应;检测了6株副溶血性弧菌标准菌株和分离株,3种致病基因检出限分别为tlh 6～43 CFU/mL,tdh 97～1 700 CFU/mL,trh 1 100～4 000 CFU/mL;3种致病基因20次重复组内变异系数在0.96%～1.50%,组间变异系数在2.70%～4.10%。该方法操作简便,特异性强,灵敏度高,能够准确、快速、灵敏地检测水产品中副溶血性弧菌。     

GNM C7-8实时荧光定量PCR同时快速检测8种食源性致病菌

目的基于GNM C7-8实时荧光定量PCR系统实现对8种常见食源性病原菌的同时快速检测。方法以建立的8种常见食源性致病菌的基于内参系统的实时荧光PCR检测方法为参照,基于GNM C7-8实时荧光定量PCR系统,对上述病原菌进行同一时间点和不同时间点的同时快速检测,并将检测结果同常见的ABI7500和罗氏荧光定量PCR仪检测结果进行比较。结果基于八模块设计的GNM C7-8实时荧光定量PCR系统能够在同一时间点和不同时间点启动运行,并实现对8种病原菌的同时快速检测;不同病原体的检测体系独立运行,互不干扰,不易发生交叉污染;与其他2种荧光定量PCR仪相比,扩增结果一致,但是完成检测所需时间更短。结论对于食物中毒和疫病爆发等突发性重大公共卫生事件的应急处置,GNM C7-8实时荧光定量PCR系统将可以提供强有力的设备支持。     

通用多重不对称PCR结合寡核苷酸芯片检测7种食源性致病菌

应用通用多重不对称聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)和寡核酸芯片技术建立一种同时检测7种常见食源性致病菌的方法。每种致病菌上游或下游引物5’端连接一段异源的共有序列。以荧光标记的该共有序列作为通用引物,与限制性特异引物经一步多重不对称PCR同时获得所有目标菌的单链标记靶序列,可被芯片上固定的特异性寡核苷酸探针捕获。通过芯片扫描、分析荧光信号完成检测。标准菌株检测结果证实,该方法可特异地检测单一和混合感染的目标菌,基因组DNA的检测灵敏度为0.1~1 pg。95份模拟污染和零售食品样本芯片检测结果与常规的分离与生化鉴定及荧光定量PCR结果一致。建立的寡核苷酸芯片方法可为快速、特异、灵敏及高通量地鉴定食源性致病菌提供一种有效的检测手段。     

食源性MRSA双色荧光PCR检测方法建立

目的建立快速检测食源性耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(methicillin-resistant Staphylococcus aureus,MRSA)Taqman探针双色荧光PCR方法。方法根据金黄色葡萄球菌种属鉴定nuc基因和MRSA决定因子mec A基因,设计合成引物探针,建立双色荧光PCR扩增体系。利用所建立的方法检测特异性及灵敏度。将金黄色葡萄球菌依次传代培养,检测不同代次的菌株验证方法的稳定性,并对实际样品分离株进行检测验证方法的可行性与实用性。结果该方法可准确并特异性检测出MRSA和甲氧西林敏感金黄色葡萄球菌(methicillin-susceptible Staphylococcus aureus,MSSA),检测MRSA的nuc基因和mec A基因的灵敏度可达2.7×103 CFU/m L,不同代次的菌株的检测结果一致。结论本实验所建立的双色荧光PCR检测方法具有良好的特异性、灵敏度及稳定性,可用于快速检测食源性MRSA。     

定量PCR技术在食源性致病微生物检测中的应用

食源性致病微生物是影响食品质量和安全的主要因素之一,建立和完善食品中致病微生物快速定量检测技术具有重要的现实意义。定量PCR能快速、敏感、特异而准确定量,深入有效地利用该技术,必将有力促进食源性致病微生物快速检测工作的发展。     

实时荧光定量PCR检测食品中常见食源性致病菌

建立一种快速、准确检测食品中常见食源性致病菌的方法。通过对食品样品提取基因组DNA和实时荧光定量PCR(Real-time Fluorescent Quantitative)条件的优化,建立了沙门氏菌、单核细胞增生性李斯特菌、金黄色葡萄球菌、志贺氏菌、蜡样芽孢杆菌和副溶血弧菌这六种食源性致病菌的实时荧光定量PCR检测方法。通过食品样品的检测,同时进行了传统方法验证。研究建立的实时荧光定量PCR鉴定方法具有良好的重复性和准确性,能够2d出具检测报告,具有较强的实际应用价值,可广泛应用于食品快速检测,具有很好的推广应用前景。     

PCR技术在食源性致病微生物快速检测中的应用

PCR(Polymerase Chain Reaction)即聚合酶链式反应,是一种体外快速扩增基因或DNA序列的方法。食源性致病微生物是影响食品质量和安全的主要因素之一,建立和完善食品中致病微生物快速检测技术具有重要的现实意义。PCR技术以其自身的灵敏度高、特异性强、速度快等优点作为食源性致病微生物检测的关键技术在食品中得到广泛的应用。本文简要介绍PCR技术的基本原理,及其在几种食源性致病微生物如沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、单核细胞增生李斯特氏杆菌、致病性大肠杆菌及其他一些有害微生物检测中的应用,并分析了PCR技术在食源性致病菌检测的实际应用中存在的一些问题及对此项技术的展望,这将有力促进我们今后更好地研究应用PCR技术检测食品中食源性致病微生物。     

2种食源性致病菌多重荧光PCR检测方法的建立

文章旨在建立一种可同时快速检测食品中沙门氏菌和副溶血弧菌的TaqMan双重荧光定量聚合酶链式反应(Polymerase chain reaction, PCR)检测方法。分别针对沙门氏菌的inv A基因和副溶血弧菌的tlh基因序列的保守片段,设计了特异性检测引物和探针,并优化其使用浓度及反应退火温度,建立双重荧光定量PCR检测体系,并对方法的灵敏度、特异性及稳定性进行评估。结果显示：建立的双重荧光定量PCR检测法可特异性扩增沙门氏菌和副溶血弧菌,其他菌株无扩增。沙门氏菌检测灵敏度最低检测值可达1 copies/μL,副溶血弧菌检测灵敏度为10 copies/μL。批内批间变异系数均<2%,重复性和稳定性较好,与传统方法检测结果一致,检测时长大幅度缩短。综上表明,建立的双重荧光PCR检测方法能够快速、准确地检测出食品中沙门氏菌和副溶血弧菌,为食品中食源性致病菌的快速检测提供技术支持。     

食源性金黄色葡萄球菌青霉素类药物耐药基因型的分析

目的 建立多重PCR方法检测青霉素酶基因和mecA基因,了解食源性金黄色葡萄球菌两种β-内酰胺类药物耐药基因的分布情况,为金黄色葡萄球菌引起食源性疾病的防治提供参考数据.方法 建立多重PCR技术检测金黄色葡萄球菌青霉素酶基因、mecA基因和16S rDNA;多重PCR方法测定食品来源的171株金黄色葡萄球菌对青霉素类药物的耐药基因型.结果 165株菌携带有青霉素酶基因(96.5％),9株菌携带有mecA基因(5.3％).结论 建立的多重PCR检测方法快速、简便、准确,可满足高通量筛选菌株的需求;食源性金黄色葡萄球菌具有很高的青霉素酶基因携带率,并存在耐甲氧西林的菌株.     

基于纳米探针检测食源性肠炎沙门氏菌技术初探

目的建立纳米探针快速、准确检测食源性肠炎沙门氏菌的方法。方法利用二氧化硅磁纳米材料与肠炎沙门氏菌抗体制备纳米探针,将制备后的探针与经过荧光染色的肠炎沙门氏菌结合,并通过荧光显微镜和流式细胞仪对探针捕获的细菌进行检测,并比较2种方法的优劣。结果本方法设计合成了肠炎沙门氏菌纳米探针,通过荧光显微镜可以观察到复合纳米探针结合的5′106 CFU/mL和5′107 CFU/mL浓度的肠炎沙门氏菌,在放大400倍的显微镜视野中成倍递增,该探针结合流式细胞术可以检测到5′105 CFU/mL浓度的肠炎沙门氏菌。结论纳米探针技术结合荧光显微镜、流式细胞术可以更加快速、准确、灵敏地用于食源性肠炎沙门氏菌的定性检测,并有望通过进一步实验实现食源性致病菌的定量检测。     

实时荧光PCR方法检测副溶血性弧菌的研究

建立了一种快速检测副溶血性弧菌（vibrio parahaemolyticus,VP）的荧光PCR（Real time polymerase chain re-action）方法。首先,从GenBank中获得副溶血性弧菌种特异性基因不耐热溶血毒素基因tl和直接耐热溶血素毒素基因tdh,用Primer Express2.0设计引物和Taqman荧光探针,在Roche荧光PCR上进行荧光PCR扩增,荧光曲线表明该荧光PCR可特异性地检测副溶血性弧菌,而大肠杆菌等其他14种细菌和空白对照都是阴性;检测方法灵敏度达10cfu/reaction。本研究建立的荧光PCR检测副溶血性弧菌的方法快速、特异性强,灵敏度高,稳定性好,可检测出总的和带tdh毒力基因的副溶血性弧菌,适合于大批量样品的检验,可广泛用于出入境检疫和动物防疫监督部门的疫情监测。     

肉制品中牛源性成分多重实时荧光PCR检测 方法的建立及初步应用

目的建立肉制品中牛源性成分的荧光PCR检测方法。方法根据牛特异性线粒体DNA片段,设计合成两对引物,以生、熟牛肉及超市牛肉加工品为材料,建立肉制品中牛源性成分的多重实时荧光PCR检测方法,并用该法与国标法同时对市售的25份肉制品同时进行检测,通过对其他种类的肉源DNA进行扩增验证方法的特异性;对含有不同比例牛肉成分的DNA样本进行检测确定检出限。结果该方法可成功检测出肉制品中的牛源性成分。在25份肉制品检测中,与国标法检测结果一致。该法的特异性为100%,灵敏度检测线为1%。结论本研究成功建立牛源性肉制品的检测方法,该方法快速简便,且具有较高的特异性和灵敏度,可用于市售肉制品中牛源性成分的鉴定。     

Establishment of a method for the simultaneous detection of four foodborne pathogens using high-throughput suspension array xTAG technology

The purpose of this study is to establish a rapid and accurate method based on multiplex polymerase chain reaction (PCR) combined with suspension array xTAG (Flexible Sequence-tagged, xTAG) technology to simultaneously detect Salmonella Typhimurium, Brucella spp., Bacillus cereus and Shigella spp. in raw milk. The primers were designed based on the specific target gene of the four pathogenic bacteria, and then the TAG sequence was used to modify the primers. First, the products of PCR were hybridised with microspheres labelled with anti-TAG, and then they were conjugated to streptavidin phycoerythrin. Finally, the products were detected on a Luminex 200 analyser. The results showed that the detection of milk samples demonstrated 100% specificity. The hybridisation conditions were successfully optimised. We successfully constructed a rapid, simple and high-throughput method to detect four foodborne pathogens. In conclusion, the established xTAG detection method provides a highly specific and reliable way to detect four kinds of foodborne pathogens in milk products.     

TaqMan实时荧光PCR对沙门氏菌能力验证样品的快速检测与鉴定

本研究依据GB 4789.4-2016标准对沙门氏菌ACAS-PT526能力验证样品进行常规培养法检测,同时使用TaqMan实时荧光聚合酶链反应（polymerase chain reaction,PCR）技术对预增菌培养物进行快速检测和鉴定。本研究首先以沙门氏菌特异性基因hut基因为靶基因,设计合成特异性引物和探针,提取各类食源性菌种的核酸DNA进行实时荧光PCR反应,仅沙门氏菌属出现阳性扩增,非沙门氏菌属、阴性对照和空白对照均无扩增信号,验证设计合成的引物探针具有较高的特异性。其次将能力验证样品和加标样品经预增菌、增菌、分离、纯化、生化试验和血清学鉴定,同时将预增菌培养物经实时荧光PCR测定后,18-D319和加标样品有显著的S型扩增曲线,Ct值分别为24.34和26.21,为沙门氏菌阳性,18-M906无显著荧光信号,Ct值>40.00,为沙门氏菌阴性。经API20E试剂条鉴定,18-D319为猪霍乱沙门菌亚利桑那亚种,鉴定百分率为99.90%,T值为0.97,18-M906为大肠埃希氏菌,鉴定百分率为99.80%,T值为0.94。实时荧光PCR检测结果与常规培养法检测结果一致,且更为简单快速,从预增菌到结果判定仅需12 h,结果准确度高,一批次可检测多个样品,可用于大量样品中沙门氏菌的快速筛查和对能力验证样品的检测验证。     

食源性副溶血性弧菌的检测方法研究进展

副溶血性弧菌(Vibrio parahaemolyticus,VP)是一种食源性致病菌,由其引发的食品安全事件已跃居我国食源性致病菌中毒数量首位。目前检测食品中致病微生物的方法主要有:传统生化培养方法、以抗原抗体反应为基础的免疫学检测方法、以PCR为基础的DNA分子检测方法等。本文总结了当前VP主要检测方法,包括免疫磁珠分离、酶联免疫吸附反应、免疫层析测试、免疫传感器、PCR技术、环介导等温扩增技术、DNA适配体传感器、DNA杂交技术等,以期为VP的快速检测方法提供借鉴和参考。     

酶底物法快速测定食品中金黄色葡萄球菌

目的 建立酶底物法快速测定食品中金黄色葡萄球菌含量的分析方法。方法 参照GB 478910-2016将食品进行前处理后, 放入加有新型酶底物的金黄色葡萄球菌培养基中, 将培养基置入恒温箱或食源性致病菌快速检测仪中, 进行8 h培养。当食品中含有金黄色葡萄球菌, 会与新型酶底物反应过程中释放出绿色物质或者荧光基团。结果 在市场上购买50份样品使用新型培养基进行培养检测, 并与GB 478910-2016检测结果对比。所使用的新型培养基与国标方法得出的检测结果符合率为99.4%, 结果基本一致。结论 新型酶底物培养基与食源性致病菌同步快速检测仪配合使用结果准确, 并且检测时间相比传统方法也大幅度的缩短, 为食品卫生质量监管提供技术手段。     

PCR-焦磷酸测序检测副溶血性弧菌研究

目的：建立用DNA碱基序列检测副溶血性弧菌(Vibrio parahaemolyticus,VP )的方法。方法：根据副溶血性弧菌toxR基因设计扩增引物和测序引物,先用PCR特异性地扩增目的片段,再制备单链模版在测序引物引导下用焦磷酸测序法检测DNA碱基序列,检测的序列为CCAA GGATTCACAGCAGAAGCCACAGGTGCTTTT,则判断为副溶血性弧菌。结果：扩增引物和测序引物表现出良好的特异性,PCR扩增结果,20株VP均扩增出大小137bp的DNA片段,而创伤弧菌等对照菌株未扩增出DNA条带。焦磷酸测序结果,20株副溶血性弧菌均测出与预期相符的DNA碱基序列,而其他对照菌株未测出DNA 碱基序列或检测结果与测序引物后的序列不匹配。VP标准菌株ATCC 17802试验菌株发生A-T突变,密码子CCU变成CCA,而两个密码子都是脯氨酸的密码子。结论：建立的方法特异性高, 整个试验可在21h-27h完成,是快速检测VP有效手段。