多聚赖氨酸对双亚基肌酸酶表面的修饰

利用多聚赖氨酸(poly-lysine)对同源二聚体肌酸酶进行化学修饰,研究该法对酶稳定性的影响。选用L_9(3~4)正交试验方案,研究不同修饰条件对修饰酶的催化效率和热稳定性的影响,确定多聚赖氨酸修饰肌酸酶(CRE)的最佳条件为CRE-COOH与poly-lysine-NH_2、EDC的摩尔比分别为1∶100和1∶10,pH为7.0。通过SDS-PAGE鉴定,探测多聚赖氨酸可在酶分子表面产生共价结合。修饰酶的催化动力学参数Km和kcat分别为4.75×10~(-2)mol/L和2.50×10~2S~(-1)。与游离酶相比,修饰酶的热稳定性和pH稳定性均明显提高。修饰酶比游离酶的Tm值高了2.07℃,当pH值为4.0和10.0时,修饰酶的酶活力仍保留在50%以上,而游离酶活性几乎丧失。进一步优化研究表明,多聚赖氨酸表面修饰法有可能成为有效提高肌酸酶稳定性的一种方法。     

磷脂酶的CC-mPEG化学修饰对其稳定性的影响

采用氰尿酰氯活化的单甲氧基聚乙二醇(CC-mPEG)为修饰剂,对磷脂酶A1(PLA1)进行化学修饰,以期提高其稳定性和催化效率。结果表明,当CC-mPEG与PLA1的摩尔比为10,修饰酶(MPLA1)的修饰率为14%时,MPLA1的热稳定性、p H稳定性、贮藏稳定性和催化效率较PLA1均有提高。     

响应面法优化木聚糖酶的修饰工艺

探究化学修饰对木聚糖酶(XY)相对活性的影响,以XY相对活性为指标,利用丁二酸酐、乙酸酐、马来酸酐(MA)和邻苯二甲酸酐对XY进行化学修饰。采用单因素试验筛选出最优酸酐修饰剂,并进行响应面法优化酸酐修饰条件。结果表明：MA为最优修饰酸酐,最佳修饰条件为修饰温度14℃、修饰时间4 h、pH 7.0、MA添加量40%(以XY质量计)。在此条件下,马来酸酐修饰木聚糖酶(MA-XY)的相对活性为154.62%±1.24%。     

3α-羟类固醇脱氢酶的亲和纯化及化学修饰提高酶稳定性

研究了3α-羟类固醇脱氢酶(3α-HSD)经化学修饰后的稳定性变化。已构建的基因工程菌E.coli BL21(DE3)/p ET28a-hsd经诱导表达、镍柱亲和纯化得到电泳纯的3α-HSD酶,酶蛋白得率是16.5%,活性回收率为64.7%,纯化倍数约为3.8,15%SDS-PAGE结果显示3α-HSD酶为单一条带,相对分子质量在28 000左右。采用邻苯二甲酸酐(PA)作为修饰剂,对3α-HSD纯酶进行化学修饰,与对照组相比,修饰酶抵抗p H波动的能力有所增强,50℃水浴10 min后酶的热稳定性明显提高,37℃贮藏40 h后修饰酶的贮藏稳定性比原酶提高9倍。     

葡聚糖修饰米根霉脂肪酶条件优化及其稳定性研究

采用经高碘酸钠活化的葡聚糖修饰米根霉脂肪酶,以获得具有较高酸解催化活性的脂肪酶。研究反应时间、反应pH值、还原剂浓度及葡聚糖质量分数对化学修饰效果的影响,并利用Box-Behnken设计法及响应面优化法对米根霉脂肪酶的化学修饰条件进行优化,当反应pH值为7.63、反应时间为15.53 h、还原剂浓度为0.20 mol/L、葡聚糖质量分数为0.3%时,脂肪酶酸解率可达到最高值37.28%。在40 ℃最适温度条件下,修饰酶的活性是原酶的2.2 倍,且经化学修饰后脂肪酶的稳定性有显著提高。     

化学修饰提高谷氨酰胺转胺酶活性与热稳定性

谷氨酰胺转氨酶(EC 2.3.2.13,简称TGase)是一种催化转酰基反应,导致蛋白质分子间发生交联的酶,广泛应用于食品、纺织、皮革、医药等领域。为提高TGase比活力与热稳定性,作者以邻苯二甲酸酐为修饰剂,对重组吸水链霉菌(Streptomyces hygroscopicus)TGase分子赖氨酸残基进行化学修饰。确定最佳修饰条件为:p H 8.0、20℃修饰反应2 h、TGase表面氨基与PA摩尔比为1∶2。无胱胺(TGase的竞争性抑制剂)存在时,PA修饰使TGase比活力提高48.3%;10mmol/L胱胺存在时,PA修饰使TGase热稳定性提高31.3%。晶体模拟结构显示,21个赖氨酸残基位于S.hygroscopicus TGase分子表面,其中5个位于催化活性中心附近区域。表面疏水性分析发现,不同条件的PA修饰使TGase分子表面疏水度降低9.46%~21.13%。因此,PA可能通过改变TGase分子不同区域的疏水性来提高其比活力和热稳定性的。上述结果表明,PA修饰是一种改进TGase酶学性质的有效策略,为其后续的分子改造提供了一定的理论参考。     

枝链霉菌L2001木聚糖酶的化学修饰及其活性中心

分别用多种化学修饰剂,如NBS、WRK对枝链霉菌L2001木聚糖酶进行化学修饰,结果表明,作用于色氨酸的试剂NBS能使酶活明显降低,而作用于谷氨酸、半胱氨酸、赖氨酸、精氨酸、丝氨酸及组氨酸残基的试剂对酶活力影响明显。为了进一步研究色氨酸对酶活力的影响作用,通过测定修饰酶的假一级常数,得到至少有一个色氨酸残基在枝链霉菌L2001木聚糖酶的活性中心,并通过底物对化学修饰的保护试验得到,色氨酸残基处在酶与底物的结合位点。结合荧光光谱再次确定色氨酸处于该酶的活性部位,是保持酶活性的必需基团。     

草酸脱羧酶的修饰及其对草酸钙的吸附研究

为了提高草酸脱羧酶(OXDC)的适用性及其对草酸钙的吸附性能,本实验采用乙二胺四乙酸二酐(EDTAD)对草酸脱羧酶进行了化学修饰,通过高效液相色谱-质谱联用仪(UPLC-MS)测定其修饰位点,并研究和对比了酶在修饰前后对草酸钙的吸附差异,采用动力学和热力学吸附模型对吸附实验的结果进行拟合分析。实验结果表明,EDTAD成功修饰在草酸脱羧酶上,修饰位点位于肽N端的α-氨基上;且修饰酶(EDTAD-OXDC)对草酸钙的吸附作用,在酶初始浓度为5 mg/m L,p H为7.0,温度为37℃的条件下,比原酶(OXDC)提高了53.37%。结论:经EDTAD修饰后的草酸脱羧酶,其稳定性和吸附性能均有所提高。     

草菇木聚糖酶的纯化提取和酶学性质

草菇产胞外木聚糖酶通过各级浓缩和纯化,获得接近电泳纯蛋白.通过SDS PAGE测得相对分子质量为24500.木聚糖酶为糖基化修饰的蛋白,含有质量分数20.24%的糖.O 糖基化能增加木聚糖酶的活性,O 和N 糖基化都能提高木聚糖酶的稳定性.5min反应,草菇木聚糖酶在60℃和pH值5.65时活性最高.在此条件下,该酶的Km值为3.87mg/mL,Vmax为1250IU/mg.纯酶的稳定pH值为6.54,57℃时半衰期为1h.     

壳寡糖修饰多聚半乳糖醛酸酶优化条件研究

以水溶性低分子量壳寡糖作为修饰剂对已纯化的多聚半乳糖醛酸酶进行化学修饰,通过单因素试验和正交试验探讨pH值、温度、修饰时间、壳寡糖的用量等因素对修饰效果的影响和最佳修饰条件的优化筛选.结果表明,通过正交试验筛选出最佳修饰反应条件为:80 mg活化的多聚半乳糖醛酸酶,反应体系中pH为4.0,反应温度为3℃,反应时间为12h,壳寡糖用量为150 mg,修饰效果最佳.利用此条件对多聚半乳糖醛酸酶进行化学修饰具有显著的激活作用,修饰后酶的比活力是340.10 U/mg protein,比修饰前提高了153.42％.     

N-糖基化对重组木聚糖酶XynA酶学特性的影响

为实现木聚糖酶的高效表达,扩大实际生产应用,本实验将木聚糖酶基因xynA在毕赤酵母中进行重组表达,同时采用糖基化抑制剂衣霉素处理毕赤酵母细胞,以此来探讨N-糖基化对木聚糖酶XynA酶学性质的影响。结果表明,SDS-PAGE电泳图谱显示木聚糖酶XynA发生了N-糖基化修饰,分子量约为45 kDa,酶活为406.6 U/mL,最适pH及反应温度分别为5.0和65 ℃;而添加不同浓度衣霉素处理后的木聚糖酶最适pH不变,最适反应温度下降5 ℃,随着衣霉素浓度的增加,去糖基化的木聚糖酶酶活力、分泌量及温度稳定性均有所下降,且当衣霉素添加浓度为15 μg/mL时,剩余酶活为53.6%。去糖基化的木聚糖酶耐受胃蛋白酶的能力较糖基化的有所增强,Na+、K+、Li+、Ca2+、Al3+、EDTA相对于糖基化的木聚糖酶表现出了一定的激活作用。以上结果说明N-糖基化作为一种重要的翻译后修饰对木聚糖酶XynA的分泌及热稳定性有促进作用。     

F/10木聚糖酶研究进展

木聚糖酶广泛应用在食品加工、纸浆漂白、饲料添加剂、工业乙醇的生产,生物转化等领域.相对于G/11木聚糖酶,F/10家族在稳定性、耐酸性和耐碱性方面更有优越性,本文综述了该家族木聚糖酶的相关基因,酶分子空间结构及催化机理等基本特性,特别对热稳定性属性及基因工程改造其稳定方面进行了详细说明,为进一步进行酶分子改造和应用提供借鉴.     

木聚糖酶融合基因的构建及其在大肠杆菌中的表达

以来源于Aspergillus usamii E001的高比活木聚糖酶XynⅡ为亲本,采用"中心模板法"将耐高温木聚糖酶TfxA的前31个氨基酸连接在XynⅡ的N端,构建出融合木聚糖酶TPL。将TPL在大肠杆菌BL21 (DE3)中进行表达,并对表达条件进行了优化,对表达产物的酶学性质进行了分析。结果表明,融合酶TPL最适pH为4.6,最适温度为45℃,和XynⅡ保持一致,但热稳定性有一定提高,在50℃处理10min,TPL和XynⅡ的残余酶活分别为15.72%和6.92%。     

利用玉米芯木聚糖酶法制备低聚木糖的研究

该文采用源于Thermotoga maritima的木聚糖酶基因工程菌JMl09(DE3)／pET-20b-xynB制备木聚糖酶液，试验结果表明，工程菌产木聚糖酶的最佳诱导条件：诱导剂乳糖浓度为25mmol／L；诱导时间为6h。酶法制备低聚木糖时，采用3％～5％的底物浓度和11．25U／g的酶用量较为适宜。TLC检测海栖热袍菌木聚糖酶水解玉米芯木聚糖的酶解产物主要为木二糖和木三糖。     

高产木聚糖酶嗜热子囊菌固体发酵条件与酶学性质

以本实验室从土壤中分离筛选到的一株高产木聚糖酶的嗜热子囊菌QS7-2-4为生产菌种,进行固体发酵产木聚糖酶的发酵条件研究,结果表明最佳产酶条件为:玉米芯:麸皮为7:3(w/w);最佳氮源为酵母膏和胰蛋白胨的混合氮源,添加量为1.5%;吐温-80添加量为0.5%,初始pH为7.2,培养基含水量为80%,250mL三角瓶装料量为8g,发酵温度50℃,发酵时间72h,该条件下木聚糖酶产量达27952U/g干基。该酶最适反应温度为75℃,最适反应pH为4.5,在70℃以下具有良好的稳定性,在室温下储藏150d仍然保留87%的活性。     

常压室温等离子体诱变选育木聚糖酶高产菌及其酶学性质研究

利用常压室温等离子体（ARTP）技术对黑曲霉（Aspergillus niger）FXY进行诱变处理,并对菌株的遗传稳定性及所产木聚糖酶的酶学性质进行了研究。结果表明,筛得一株高产木聚糖酶且能稳定遗传的菌株ARTP-82,其所产木聚糖酶酶活为175.33 U/mL,较出发菌株提高了120.8%。酶活的提高与酶比活力增加有关、与菌株生物量增加无关;该木聚糖酶的最适温度为45.0 ℃、最适pH值为7.0,在该温度和pH值条件下酶的稳定性良好。     

木聚糖酶产生菌的筛选、发酵及酶学性质

该研究对木论自然保护区土壤中高产木聚糖酶的菌株进行了分离,经菌落形态观察、ITS基因序列分析对菌株进行了鉴定,并通过单因素固态发酵实验确定最佳产酶条件。结果表明,筛选到1株高产木聚糖酶菌株,并鉴定为黑曲霉（Aspergillus niger）。其最佳产酶培养基配方：玉米芯与麸皮质量比为1∶7、氮源为硫酸铵（添加量1.4 g/L）、初始pH值为5.0、料水比为1∶3.5（g∶mL）,接种量为7.5%。在此优化条件下,木聚糖酶酶活最高可达10 801.3 IU/g。酶学性质研究表明,木聚糖酶的最适作用pH值为5.5、最适作用温度为37 ℃。     

极端耐热木聚糖酶基因在大肠杆菌中的高效表达

海栖热袍菌Thermotogamaritima为嗜极端高温的厌氧细菌 ,其产生的极耐热性木聚糖酶B具有非常可观的工业应用前景。但编码该酶的基因xynB在大肠杆菌中的表达较困难。文中利用PCR技术将xynB克隆至原核表达载体pET 2 0b ,并与组氨酸标签进行融合构建成重组质粒 pET 2 0 xynB。研究发现 ,pET 2 0 xynB在稀有密码子AGA ,AGG和AUA得到加强的大肠杆菌宿主菌株BL2 1 CodonPlus(DE3 ) RIL中 ,木聚糖酶基因的表达水平远远高于在其他菌株中的表达。结合对重组菌的诱导条件的优化 ,使得重组蛋白表达量达到11 5 % ,比酶活达到 2 5 69U/mg ,比常规基因工程菌株提高 12 5倍。     

木聚糖酶对馒头品质的影响及抑制回生的机理研究

本试验主要研究木聚糖酶对馒头品质的影响,结果表明:添加30 mg/kg(以小麦粉为基准)木聚糖酶对馒头的改善效果较好,馒头的综合评分最高,达93分;馒头的硬度为1 658 g,胶着性为1 439,咀嚼性为1 391,分别比对照降低了48%、46%和44%;RVA分析表明,与对照相比,馒头皮黏度降低了344cP,馒头芯部黏度降低168 cP,说明添加木聚糖酶增大了馒头表皮和芯部的糊化程度;馒头贮藏过程中DSC分析表明,馒头的结晶熔融焓值由对照的3.05 J/g降低为1.99 J/g,说明木聚糖酶可以抑制馒头回生。相关性分析表明,馒头芯部糊化程度与贮存期间馒头的回生性质呈负相关。而RVA和DSC研究结果表明,添加木聚糖酶后小麦粉糊化温度降低,热焓值降低,小麦粉更易糊化,阐明了木聚糖酶能够抑制馒头回生的机理。     

酶法改性对马铃薯渣膳食纤维单糖组分及理化性质的影响

采用纤维素酶、木聚糖酶、纤维素-木聚糖复合酶分别对马铃薯渣膳食纤维进行改性,研究酶法改性对膳食纤维理化性质和单糖组分的影响。单糖测定结果表明,3种酶法改性后膳食纤维中均含有葡萄糖、半乳糖、半乳糖醛酸、阿拉伯糖、木糖5种单糖,但不同酶法改性膳食纤维各单糖含量有显著差异(p<0.05)。理化性质测定结果表明,不同酶法改性后膳食纤维的持水力、结合水力、溶解度强弱次序均为复合酶改性>木聚糖酶改性>纤维素酶改性;持油力和阳离子交换力的强弱次序均为复合酶改性>纤维素酶改性>木聚糖酶改性,复合酶改性后膳食纤维理化性质明显优于其他酶法改性。复合酶改性后膳食纤维持水力、持油力、结合水力、溶解度、阳离子交换力分别为6.29 g/g、2.89 g/g、5.99 g/g、32.28%、0.60 mL/g,与原膳食纤维相比较分别提高了115.22%、16.73%、27.18%、45.27%、173.18%。马铃薯渣膳食纤维改性前后均具有糖类特征官能团,在某些波长处出现相似吸收峰,吸收峰的强度和面积发生了改变。