Construction and Expression of pacA and gtfB-cat of Streptococcus Mutans Fused with ctxB in Prokaryotic Cells

目的:构建含变形链球菌表面蛋白A区编码基因(pacA)、葡糖基转移酶催化区编码基因(gtfB-cat)及霍乱毒素B亚单位编码基因(ctxB)的嵌合表达质粒并表达目的蛋白.方法:将目的基因pacA、gtfB-cat、ctxB克隆至原核克隆载体pET32-a(+)构建嵌合质粒pET-pacA-cat-ctxB,将其转入表达宿主菌E.coliBL21(DE3),并测量其表达情况.结果:构建的重组质粒经酶切、PCR鉴定及测序,证实目的基因均正确插入到载体pET-32a(+)中,插入的相位正确,未改变目的基因的阅读框架,经诱导后表达目的蛋白,分子质量大小与预期一致.结论:成功构建了嵌合质粒pET-pa-cA-cat-ctxB,且它们均在原核细胞内获得正确表达.     

酿脓链球菌对大环内酯类抗菌药物耐药表型与基因型研究

目的 研究酿脓链球菌对大环内酯类抗菌药物的耐药表型与基因型。方法 采用琼脂平板稀释法测定97株酿脓链球菌对红霉素、克林霉素、麦迪霉素、阿奇霉素、克拉霉素和青霉素的敏感性；用双纸片法检测酿脓链球菌耐药表型；用PCR方法检测耐大环内酯的酿脓链球菌携带的耐药基因。结果 97株酿脓链球菌中82株表现为对大环内酯类抗菌药物不敏感，其中42株表现为eMLS型耐药，37株为iMLS型耐药，3株细菌为主动外排M型耐药；82株对大环内酯不敏感的酿脓链球菌中77株检测到耐药基因，其中12株具有ermB基因，25株具有ermTR基因，2株具有mefA基因，21株同时具有ermB／ermTR基因，5株同时具有ermB／mefA基因，3株同时具有ermTR／mefA基因，9株同时具有ermB／ermTR／mefA基因，5株未能检测到三种耐药基因。结论 酿脓链球菌对大环内酯类抗菌药物的耐药率较高，耐药表型以cMLS和iMLS为主，耐药基因以ermB和ermTR多见。     

Tudor-SN蛋白TSN结构域亚结构片段重组质粒的构建与表达

目的:研究人类Tudor-SN蛋白TSN结构域4个亚片段的功能,构建重组质粒pEGFP-C2-Tudor-SN-TSN(Ⅰ~Ⅳ)。方法:以重组质粒pSG5-Tudor-SN-flag为模板,聚合酶链反应(PCR)扩增出目的基因,将双酶切后带有粘性末端的目的片段和pEGFP-C2载体连接,从而构建重组质粒pEGFP-C2-Tudor-SN-TSN(Ⅰ~Ⅳ)。将构建成功的重组质粒用脂质体法转染HeLa细胞,并在荧光显微镜下观察融合蛋白的荧光表达情况,Western印迹检测融合蛋白的表达。结果:对重组质粒进行双酶切鉴定可见Tudor-SN-TSN(Ⅰ~Ⅳ)的cDNA片段;脂质体转染重组质粒后可观察到绿色荧光蛋白的表达。Western印迹后可在相应位置检测到融合蛋白pEGFP-C2-Tudor-SN-TSN(Ⅰ~Ⅳ)。结论:真核pEGFP-C2-Tudor-SN-TSN(Ⅰ~Ⅳ)重组质粒构建及表达成功。     

大鼠Smad 7基因真核表达质粒的构建与鉴定

目的：构建并鉴定大鼠Smad7/pcDNA3.1（＋）真核表达质粒,为进一步研究Smad7的抗肝纤维化作用提供实验基础。方法：TRIzol法抽提大鼠肝组织总RNA,琼脂糖凝胶电泳检测其完整性,紫外分光核酸蛋白分析仪测定其浓度与纯度,两步法获取大鼠Smad7cDNA片段,CaCl2法制备感受态细胞,应用EcoRI及XhoI在pcDNA3.1（＋）多克隆位点处进行双酶切,切胶回收载体及目的片段酶切产物,将回收的线性化pcDNA3.1（＋）与Smad7cDNA连接,构建Smad7/pcDNA3.1（＋）重组质粒,转化DH5α大肠杆菌,测序鉴定双酶切证实的阳性克隆。结果：电泳检测RNA的完整性良好,28S约为18S的2倍,A260/A280=1.986,纯度较好,阳性克隆酶切后电泳检测在DNAMarker1.3kb处见Smad7目的片段,5.4kb处见线性化pcDNA3.1（＋）,与预期结果相符,质粒重组成功,并测序证实。结论：大鼠Smad7真核表达质粒构建成功,为进一步单独或联合其他质粒从TGF-β/SMAD信号传导的不同环节干预肝纤维化提供了实验基础。     

UNC5B基因靶向shRNA表达质粒的构建及体外RNA干扰

目的：探讨人UNC5B基因的双链RNA在体外对UNC5B表达的干扰作用及其规律。方法：构建两个能产生UNC5B的发夹状RNA（shRNA）的质粒载体Pgenesil—UNC581及Pgenesil—UNC582作为实验组，并构建无关序列shRNA表达质粒Pgenesil—NC作为阴性对照，将3种质粒分别转染脐静脉内皮细胞（HUVEC）。转染24h后，荧光倒置显微镜下观察质粒转染效率，用G418筛选得到稳定转染的细胞，通过逆转录聚合酶链反应（RT—PCR）检测UNC5B在HUVECs中的表达情况。结果：转染24h后，在荧光显微镜下可见绿色荧光，转染效率约为40％～50％。实验组经G418筛选后稳定转染的细胞UNC5BmRNA均受到抑制。两种UNC5B基因靶向shRNA表达质粒对HUVECs中UNC5B抑制率分别为88％和52％。结论：本研究所构建的UNC5BshRNA表达质粒可在体外高效特异地抑制UNC5B的表达，为进一步实验奠定了基础。     

Bcl-x基因shRNA表达质粒的构建和鉴定

目的:构建含人Bcl-x基因不同位点的一系列shRNA真核表达质粒,为以Bcl-x基因为靶点的基因治疗肿瘤研究奠定基础.方法:将人工合成的针对Bcl-x基因6个不同位点和一个混乱序列的正反链DNA序列经基因重组定向克隆插入到真核表达质粒载体pmU6qa,通过酶切检测确定重组结果,并进行测序加以鉴定.结果:各对DNA序列均按正确方向插入pmU6质粒.结论:成功构建了含人Bcl-X基因6个不同位点的shRNA真核表达质粒.     

Ezrin蛋白在鼻咽癌组织中的表达及其对鼻咽癌远处转移的影响

目的：探讨Ezrin蛋白在鼻咽癌组织中的表达情况及其对鼻咽癌远处转移的影响。方法采用免疫组织化学方法检测Ezrin蛋白在98例鼻咽癌患者（观察组）和37例慢性鼻咽炎患者（对照组）组织中的表达情况。并分析鼻咽癌患者的详细临床分期和病理特点,跟踪随访治疗过程中发生复发和转移的情况。结果观察组98例患者中,69例（70．4％）呈现Ezrin蛋白阳性表达;对照组37例患者中,仅有4例（10．8％）呈现Ezrin蛋白阳性表达;两组Ezrin蛋白阳性率差异有统计学意义（χ2＝38．42,P＝0．00）。通过对观察组中不同Ezrin蛋白表达强度患者的远处转移情况比较发现,Ezrin的强阳性（＋＋＋）与肿瘤的远处转移密切相关,Ezrin蛋白阳性（＋＋）、（＋＋＋）表达组与阴性（-）和/或弱阳性（＋）表达组患者比较,肿瘤转移率明显偏高（均P＜0.05）。结论 Ezrin蛋白在鼻咽癌患者组织中呈现高表达情况,并且Ezrin蛋白的阳性表达与鼻咽癌的远处转移有关。     

重组真核质粒pERFP-C1-hTudor-SN-SN(1～4)的构建和表达

目的:将人类Tudor-SN蛋白SN(1～4)基因片段分别定向连入pERFP-C1质粒,使Tudor-SN蛋白SN各功能片段与红色荧光蛋白在HeLa细胞内融合表达。方法:以重组质粒pSG5-Tudor-SN-flag为模板,PCR法扩增出目的基因,利用EcoRⅠ和BamHⅠ双酶切法将目的片段连接到pERFP-C1载体上,再将构建成功的pERFP-C1-Tudor-SN-SN(1～4)重组质粒转染入HeLa细胞内,在荧光显微镜下观察红色荧光蛋白的表达。结果:以单/双酶切及基因测序法鉴定构建的重组质粒均无误,荧光显微镜下观察到红色融合蛋白的表达。结论:重组pERFP-C1-h Tudor-SN-SN(1～4)质粒构建及表达成功。     

野生型DPP Ⅳ真核表达质粒的构建和鉴定

目的构建野生型DPP Ⅳ真核表达质粒。方法将野生型DPP Ⅳ基因定向克隆到真核表达质粒pcDNA3.1(+),构建成重组质粒pcDNA3 DPP Ⅳ;然后用限制性内切酶消化和DNA序列测定鉴定。结果经酶切和DNA序列测定鉴定证实重组质粒构建正确。结论真核表达质粒pcDNA3DPP Ⅳ构建成功,为进一步研究DPP Ⅳ基因在卵巢癌细胞中的表达和生物学作用奠定了基础。     

重组真核质粒pEGFP-C2-hG3BP-Domain(1～5)的构建及表达

目的:将人类G3BP(Ras-GTPase activating protein SH3 domain binding protein)蛋白Domain(1～5)基因片段分别定向连入pEGFP-C2质粒,使G3BP蛋白各功能片段与绿色荧光蛋白在HeLa细胞内融合表达。方法:以重组质粒pEGFP-C1-G3BP为模板,PCR法扩增出目的基因,利用EcoRⅠ和BamHⅠ双酶切法将目的片段连接到pEGFP-C2载体上,再将构建成功的pEGFP-C2-hG3BP-Domain(1～5)重组质粒转染入HeLa细胞内,以荧光显微镜及Western印迹法检测绿色荧光蛋白与目的蛋白的融合表达情况。结果:以单/双酶切及基因测序法鉴定构建的重组质粒均无误,荧光显微镜及Western印迹结果均检测到绿色融合蛋白的表达。结论:重组pEGFP-C2-hG3BP-Domain(1～5)质粒成功构建并表达。     

正义和反义β1,4-半乳糖基转移酶V表达质粒在星形胶质细胞瘤细胞中的表达与鉴定

目的 构建β1,4-半乳糖基转移酶V(β1,4-galactosyltransferase V, β-1,4-GalT-V)正、反义表达质粒,为探讨神经胶质瘤细胞表达β-1,4-GalT-V的生物学意义提供研究基础.方法 构建β-1,4-GalT-V表达质粒,并将其转染到人脑星形胶质细胞瘤细胞SHG-44中;用Western blot和Northern blot鉴定转染后基因表达情况.结果 通过酶切鉴定和测序分析证实,成功构建了β-1,4-GalT-V表达质粒.将构建的表达质粒转染到胶质细胞瘤细胞SHG-44中,正义表达质粒能增加胶质细胞瘤细胞SHG-44中的β-1,4-GalT-V表达量,而转染反义质粒则能降低细胞中β-1,4-GalT-V表达量.结论 正、反义β-1,4-GalT-V表达质粒在人脑星形胶质细胞瘤细胞SHG-44中的稳定转染和表达,对分析胶质瘤细胞表达β-1,4-GalT-V的意义以及对肿瘤细胞的增殖、迁移和黏附等的影响,提供了研究基础.     

防御素5和LL37真核重组质粒构建及转染人阴道上皮细胞的研究

目的:构建防御素5(HD5)和LL37的真核重组质粒并瞬时转染人阴道上皮细胞,以期探讨阴道上皮细胞抵抗微生物感染的机制.方法:(1)从人阴道上皮细胞中提取总RNA,经逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)扩增出HD5和LL37的cDNA,并将其插入真核表达载体pcDNA3.1 (+)-EGFP中、构建重组质粒pcDNA3.1 (+)/HD5-EGFP和pcDNA3.1(+ )/LL37-EGFP.(2)经组织块法原代培养入阴道上皮细胞并传代,将2种质粒分别或联合转染人阴道上皮细胞,转染6、12、24和48 h后,采用荧光显微镜检测细胞转染情况,ELISA方法测定细胞培养上清液中HD5及LL37的表达情况.结果:成功构建了pcDNA3.1( +)/HD5-EGFP和pc DN A3.1(+ )/LL37-EGFP真核表达载体,实现了HD5和LL37在阴道上皮细胞中表达,细胞培养上清中有HD5和LL37蛋白分子表达,且在转染24h时表达量最高.联合转染组的HD5和LL37水平高于单独转染组,单独转染组高于未转染组,差异均有统计学意义(均P＜0.001).LL37组和联合转染组的LL37水平,联合转染组的HD5水平均是6h时分泌最低,24h达高峰,然后呈下降趋势.HD5组的HD5水平随时间增加而呈增加趋势.结论:HD5和LL37成功转染人人阴道上皮细胞并成功表达,为研究重组HD5和LL37的抗菌功能及阴道上皮细胞先天免疫机制奠定了基础.     

mGM-CSF-mMIP-3α重组质粒的构建、表达及鉴定

目的:构建pCDNA3.1mGM-CSF-mMIP-3α重组质粒,为mGM-CSF-mMIP-3α基因治疗肿瘤的研究奠定基础.方法:利用本实验室保存的pCDNA3.1mGM-CSF和pCDNA3.1mMIP-3α质粒,采用分子生物学技术构建了pCDNA3.1mGM-CSF-mMIP-3α重组质粒.用PCR、酶切进行鉴定,然后用脂质体转染B16细胞,用G418筛选后通过ELISA和Western blot检测该融合蛋白.结果:重组质粒中含有mGM-CSF-mMIP-3α基因,转染B16细胞后,其表达产物能分泌到肿瘤细胞外,分泌到细胞外的产物用ELISA和Westernblot检测证明能与特异性mGM-CSF和mMIP-3α抗体结合.结论:成功构建含mGM-CSF-mMIP-3α真核表达重组质粒,有助于进一步研究其抗肿瘤作用.     

肝细胞生长因子、晚期糖基化终产物受体在妊娠期糖尿病胎盘中的表达及与母儿预后的关系

目的：探讨妊娠期糖尿病（ GDM）胎盘中肝细胞生长因子（ HGF）、晚期糖基化终产物受体（ RAGE）的表达及与母儿预后的关系。方法选择晚孕GDM孕妇63例，依据是否规律降血糖治疗分为治疗组40例，未治疗组23例，另选择同期产检并分娩的健康孕妇30例为对照组。采用免疫组织化学方法测定三组胎盘中HGF和RAGE的表达，并比较其母儿预后的差异。结果 HGF和RAGE在三组胎盘组织中均有表达，HGF在未治疗组、治疗组、对照组胎盘中表达逐渐增强，阳性单位（PU值）分别为（5．03±1．05）、（7．83±1．62）、（11．54±2．62），组间比较差异有统计学意义（F＝7．56，P＜0．05）；RAGE在未治疗组、治疗组、对照组胎盘组织中表达逐渐减弱，PU值分别为（14．56±2．70）、（12．87±2．63）、（8．39±1．56），组间比较差异有统计学意义（F＝11．62，P＜0．05）；未治疗组母、儿并发症发生率（178．26％、121.73％）均明显高于治疗组（65.00％、32.50％）和对照组（13．33％、3．33％），组间比较差异均有统计学意义（χ2＝7．34、13．21、9．75、6.67、15．23、12．53，均P＜0．05）。结论 HGF、RAGE可能参与了GDM的发生发展，与母儿预后关系密切，规律治疗可改善母儿预后。     

金合金和钴铬合金与变形链球菌黏附的关系

<正>牙科金合金、钴铬合金是口腔重要的修复材料,在临床上应用广泛。本研究旨在了解在菌斑形成中起关键作用的变形链球菌在表面粗糙度相同的2种冠修复体上的黏附情况。1材料和方法1.1仪器设备:TR200手持式粗糙度仪(时代集团公司),     

应急药品与基本药物及医疗保险药品的储备和供应嵌合模式探讨

目的：探讨建立高效率、低成本的应急药品储备和供应的新型管理模式。方法：比较我国应急药品、基本药物及医疗保险药品的储备和供应管理特点,分析三者嵌合的衔接方式。结果：274种应急药品,占国家基本药物品种的比例为21.54%,基本医疗保险药品品种的比例为8.42%;应急药品的储备和供应能嵌合入国家基本药物和基本医疗保险药品现行的模式中,主要通过共用中标的药品生产企业或经营企业来实现。国家通过事先与这些中标的医药企业签订合同,来储备、供应和配送应急药品,促进应急药品储备和供应的广覆盖和多元化。结论：应急药品应优先被列入基本药物及基本医疗保险药品的储备和供应目录,国家应采取措施,促进有效嵌合模式的实现。     

miR-100 表达与乳腺癌患者淋巴结转移及FZD-8表达的相关性研究

摘要： 目的 考察临床乳腺癌病理组织中 miR-100 和 Wnt 通路关键因子卷曲蛋白 （FZD） -8 表达之间的关系,并分析 miR-100 表达与乳腺癌患者淋巴结转移的关系。方法 选取中国医科大学附属第一医院乳腺外科术后的 50 例乳腺癌患者, 通过原位杂交检测乳腺癌患者病理组织及其配对的癌旁组织中 miR-100 的表达; 免疫组化检测 2 种组织中FZD-8的表达; 比较有无淋巴结转移患者癌组织中miR-100表达情况, 分析乳腺癌组织miR-100与FZD-8 表达的相关性。结果 miR-100 在乳腺癌组织中的表达明显低于其配对的癌旁组织[2.00 （1.00, 3.00）vs. 6.00 （3.50, 8.00） ]; 有淋巴结转移者癌组织中 miR-100 低表达[1.50 （1.00, 2.75）vs. 3.00 （2.00, 4.00） ]; 与癌旁组织相比, FZD-8 在乳腺癌组织中高表达[8.00 （6.00, 9.00）vs. 6.00 （3.75, 9.00） ], 且其表达水平与 miR-100 的表达呈负相关 （rs=-0.592, P < 0.001）。结论 miR-100作为抑癌 miRNA 参与乳腺癌转移的调节, 可能与其调控 FZD-8的表达有关。     

非小细胞肺癌EGFR突变与磷酸化信号传导蛋白表达的关系

目的:探讨非小细胞肺癌(NSCLC)患者表皮生长因子受体(EGFR)基因突变与其下游磷酸化信号通路蛋白表达的关系.方法:利用PCR和基因测序检测NSCLC患者EGFR第19和21外显子突变,辅以免疫组化染色检测下游信号传导蛋白p-Akt、p-ERK1/2和p-STAT3的表达.结果:66例NSCLC中有11例发生EGFR突变,女性和伴细支气管肺泡特征的腺癌突变率较高.p-Akt、p-ERK1/2和p-STAT3的表达阳性率分别为54.5%、25.8%和33.3%,EGFR突变患者p-Akt阳性率(81.8%)显著高于无突变者(49.1%,P<0.05),且在伴细支气管肺泡特征的腺癌中呈高表达,两者之间p-ERK1/2和p-STAT3表达差异无统计学意义;p-ERK1/2表达与患者年龄相关,P-STAT3在腺癌、小肿瘤(≤3 cm)和Ⅰ期NSCLC中的表达均显著上调(P<0.05).结论:EGFR突变后的下游信号传导主要以激活Akt途径为主,检测下游信号传导蛋白表达是EGFR基因检测的重要补充,对NSCLC基因分型、疗效监测及预后评估具有重要意义.     

MDM2基因真核表达质粒构建及对人乳腺癌MCF-7细胞运动与侵袭能力的影响

目的 构建MDM2的pcDNA3.1真核表达质粒(pcDNA3.1-MDM2),并将其转染至人乳腺癌MCF-7中,考察MDM2蛋白过表达对乳腺癌转移的影响。方法 采用PCR方法体外克隆MDM2基因全序列,并将其用同源重组技术连接到真核pcDNA3.1质粒载体上,构建真核表达质粒,并进行测序鉴定,利用脂质体法转染至MCF-7细胞中。通过G418抗生素筛选出单克隆高表达细胞系,使用免疫印迹法考察MDM2蛋白表达。同时,通过划痕试验及transwell法来检测细胞的运动与侵袭能力。结果 测序结果表明pcDNA3.1-MDM2基因序列准确无误,免疫印迹法表明稳定转染细胞系构建成功,划痕试验及transwell试验表明MDM2高表达细胞系的运动与侵袭能力增加。结论 成功构建了pcDNA3.1-MDM2真核表达质粒,转染MCF-7细胞后,可稳定表达,并促进了MCF-7细胞的运动及侵袭,为研究MDM2蛋白表达对人乳腺癌转移的分子机制及作为诊疗的生物标志物奠定了基础。     

重组人甲状旁腺激素相关蛋白1-141序列的克隆和表达载体构建

目的：构建人甲状旁腺激素相关蛋白1-141（hPTHrP1—141）基因的表达载体。方法：提取人基因组DNA，PCR扩增PTHrP1—141基因，将其克隆入原核表达载体pQE-30Xa，构建重组表达载体pQE-30Xa／hPTHrP1—141。结果：重组载体pQE-30Xa／hPTHrP1-141经限制性核酸内切酶Pvu Ⅱ酶切鉴定，得到符合预期大小的核酸片段。结论：表达载体pQE-30Xa／hPTHrP1—141构建成功。