人骨髓基质干细胞体外诱导向软骨细胞分化

目的:探讨应用壳聚糖支架三维立体培养人骨髓基质干细胞(mesenchymalstemcells,MSCs),体外诱导其分化成为软骨细胞的可行性。方法:实验于2004-02/11在中山大学附属第三医院中心实验室完成。相分离法制备三维多孔壳聚糖支架,检测支架的孔隙率、孔径。抽取人骨髓,密度梯度离心法分离纯化,体外培养扩增。将第3代MSCs复合于支架中培养,应用无血清诱导液诱导细胞向软骨细胞分化,通过组织学染色及扫描电镜观察细胞的形态、增殖及功能的改变。结果:通过相分离法可制备出高孔隙率的三维壳聚糖支架,孔隙率达86.5%,孔隙分布均匀且相互连通,平均孔径182μm。诱导分化的MSCs在支架中贴附良好,呈现典型的软骨细胞形态,并有细胞外基质分泌。结论:人MSCs在三维立体培养环境下可诱导分化为软骨细胞,作为种子细胞在组织工程软骨的构建及软骨损伤的修复中有良好的应用价值。     

骨髓间充质干细胞向纤维软骨细胞表型的诱导分化

背景:半月板损伤后自行修复能力有限,组织工程技术为半月板损伤后修复开辟了一条新的途径.骨髓间充质干细胞具有多向分化潜能,有可能成为半月板组织工程理想的种子细胞.目的:观察体外培养的猪骨髓间充质干细胞在诱导培养液作用下向纤维软骨细胞表型分化的可行性.方法:采用全骨髓培养法分离培养猪骨髓间充质干细胞.取第3代的骨髓间充质干细胞,实验组以2.0×10~4/cm~2细胞密度接种于24孔板,在含有转化生长因子β1、胰岛素样生长因子Ⅰ、地塞米松及抗坏血酸的DMEM-LG完全培养液中诱导分化,对照组以2.0×10~4/cm~2细胞密度接种于24孔板,加入不含诱导因子的DMEM-LG完全培养液.在诱导第7,14,21天分别行甲苯胺蓝染色、免疫细胞化学染色检测其分化结果.结果与结论:①第2代骨髓间充质干细胞的群体倍增时间最短约为2 d,第4代以后相对延长,为5～9 d.②诱导后的骨髓间充质干细胞由梭形向多角形、多边形转变.③实验组可见胞浆呈明显的紫蓝色,尤其细胞密集生长的区域蓝染较深,染色强度随诱导时间延长而增强.对照组的骨髓间充质干细胞只有核蓝染.④实验组和对照组Ⅰ型胶原免疫细胞化学染色均阳性,各期染色无明显差异.对照组未见Ⅱ型胶原表达,实验组诱导14 d后可见Ⅱ型胶原能稳定的表达.提示骨髓间充质干细胞在体外诱导培养下可分泌纤维软骨细胞特征性细胞外基质,作为半月板组织工程种子细胞来源可行.     

兔骨髓基质干细胞诱导分化为软骨细胞的体外实验研究

目的:在体外分离获得兔骨髓基质干细胞(bonemarrow-derivedmesenchymalstemcells,BMSCs)的基础上探索诱导该细胞向软骨细胞方向分化的转化生长因子-β1(transforminggrowthfactor-β1,TGF-β1)的适宜浓度。方法:第3代BMSCs分别用TGF-β15ng/mL、10ng/mL和20ng/mL诱导2周,通过倒置相差显微镜、MTT法、甲苯胺蓝染色和Ⅱ型胶原免疫细胞化学等方法,观察细胞的生物学特性。结果:骨髓中分离获得的BMSCs在体外增殖旺盛,TGF-β1诱导后细胞生长明显减缓。与对照组相比,经过诱导2周后的BMSCs在48h时5ng/mLTGF-β1组的MTT光密度值差异无显著性(P>0.05),而10ng/mL组和20ng/mL组差异有显著性(P<0.05),但在72h时3个诱导组与对照组比较差异均有显著性(P<0.05),而3个诱导组间差异无显著性(P>0.05)。5ng/mLTGF-β1体外诱导BMSCs2周后,细胞甲苯胺蓝异染明显,Ⅱ型胶原免疫组织化学染色阳性,表现为软骨细胞生物学特性。结论:5ng/mLTGF-β1诱导BMSCs向软骨细胞...     

鹿茸多肽诱导骨髓间充质干细胞体外向软骨表型的分化

背景：实验证实鹿茸多肽可以促进体外培养软骨细胞的增殖和细胞外基质糖胺多糖、Ⅱ型胶原、Aggrecan蛋白的表达。目的：通过对体外培养的兔骨髓间充质干细胞在特定培养液作用下向软骨细胞表型分化的研究,探讨鹿茸多肽对其软骨分化的影响。方法：将第3代兔骨髓间充质干细胞随机分为空白对照组、诱导组、鹿茸多肽组,分别采用普通培养液、诱导培养液、含10mg/L鹿茸多肽的诱导培养液于离心管内进行培养;并取兔的关节软骨细胞作为关节软骨组。分别于1,2,3周后取材,通过组织学、生物化学和RT-PCR技术,对离心管内构建的软骨组织进行形态学和细胞功能状态的观察。结果与结论：空白对照组培养2周后,细胞团块逐渐崩解,无法进行苏木精-伊红染色。诱导组、鹿茸多肽组细胞团块除有轻度收缩外,呈白色半透明状;苏木精-伊红染色发现部分细胞为圆形或卵圆形,表层细胞密度大;诱导组、鹿茸多肽组糖胺多糖含量及Ⅱ型胶原mRNA表达随培养时间延长而增多,各时间点诱导组、鹿茸多肽组含量均高于空白对照组（P〈0.05）;各时间点鹿茸多肽组糖胺多糖含量及Ⅱ型胶原mRNA表达均高于诱导组,但低于关节软骨组（P〈0.05）。提示骨髓间充质干细胞在特定培养条件下能向软骨细胞表型分化,且鹿茸多肽对其定向软骨分化有明显促进作用。虽然在体外可以构建出软骨组织,但其与关节软骨质量相比仍有很大差距。     

鹿茸多肽诱导骨髓间充质干细胞体外向软骨表型的分化

背景:实验证实鹿茸多肽可以促进体外培养软骨细胞的增殖和细胞外基质糖胺多糖、Ⅱ型胶原、Aggrecan蛋白的表达.目的:通过对体外培养的兔骨髓间充质干细胞在特定培养液作用下向软骨细胞表型分化的研究,探讨鹿茸多肽对其软骨分化的影响.方法:将第3代兔骨髓间充质干细胞随机分为空白对照组、诱导组、鹿茸多肽组,分别采用普通培养液、诱导培养液、含10 mg/L鹿茸多肽的诱导培养液于离心管内进行培养;并取兔的关节软骨细胞作为关节软骨组.分别于1,2,3周后取材,通过组织学、生物化学和RT-PCR技术,对离心管内构建的软骨组织进行形态学和细胞功能状态的观察.结果与结论:空白对照组培养2周后,细胞团块逐渐崩解,无法进行苏木精-伊红染色.诱导组、鹿茸多肽组细胞团块除有轻度收缩外,呈白色半透明状;苏木精-伊红染色发现部分细胞为圆形或卵圆形,表层细胞密度大;诱导组、鹿茸多肽组糖胺多糖含量及Ⅱ型胶原mRNA表达随培养时间延长而增多,各时间点诱导组、鹿茸多肽组含量均高于空白对照组(P < 0.05);各时间点鹿茸多肽组糖胺多糖含量及Ⅱ型胶原mRNA表达均高于诱导组,但低于关节软骨组 (P < 0.05).提示骨髓间充质干细胞在特定培养条件下能向软骨细胞表型分化,且鹿茸多肽对其定向软骨分化有明显促进作用.虽然在体外可以构建出软骨组织,但其与关节软骨质量相比仍有很大差距.     

生长分化因子5真核表达质粒转染小鼠骨髓基质干细胞体外诱导向软骨细胞分化

背景:生长分化因子5是软骨与骨组织形成、发育的重要调解因子,在诱导软骨形成,促进骨、软骨、肌健韧带损伤修复方面发挥重要作用.目的:小鼠骨髓基质干细胞体外转染真核表达质粒pcDNA 3.1(+),生长分化因子5,检测与软骨形成分化相关的细胞外基质及蛋白多糖的表达.设计、时间及地点:细胞学体外观察,于2008-03/12在武汉协和医院中心实验室完成.材料:雄性昆明种小鼠20只,由华中科技大学同济医学院实验动物中心提供.生长分化因子5真核表达质粒pCDNA 3.1(+)/生长分化因子5为自备.方法:全骨髓贴壁法体外分离培养小鼠骨髓基质干细胞,取传至第3代细胞接种到6孔板,在细胞生长到90%融合时开始转染.设立3组:转染组采用Lipofectamine<'TM>2000进行脂质体介导pcDNA3.1(+)/生长分化因子5重组质粒瞬时转染;空质粒组转染窄质粒pcDNA 3.1(+);空白对照组只加入等量脂质体,其余步骤相同.主要观察指标:转染后72 h通过RT-PCR及免疫细胞化学检测生长分化因子5基因与蛋白的表达鉴定转染是否成功,同法检测软骨基质Ⅱ型胶原的表达,转染后14 d阿尔辛蓝染色检测蛋白聚糖的表达.结果:转染组有一大小为219 bp的特异性扩增条带,骨髓基质干细胞胞浆内呈棕色阳性染色;而空质粒组、空白对照组均未发生生长分化因子5基因转录,无特异性扩增条带,且细胞胞浆未见明显染色.转染组町检测到Ⅱ型胶原基因的表达,基因大小225 bp,Ⅱ型胶原细胞胞浆中可见棕黄色染色;空质粒组、空白对照组均未检测到Ⅱ型胶原基因的表达,SP染色均无明显染色.阿尔辛蓝染色后转染组细胞呈蓝染,空质粒组、空白对照组均未见明显异染性着色.结论:pcDNA3.1(+)/生长分化因子5转染骨髓基质干细胞能显著增加Ⅱ型胶原及蛋白聚糖的表达,促进骨髓基质干细胞向软骨细胞方向分化.     

骨髓间充质干细胞体外诱导分化软骨细胞表型的可行性

目的:探讨在体外特定培养条件下诱导绵羊骨髓间充质干细胞定向分化为软骨细胞表型的可行性。方法:实验于2005-09/2006-02在首都医科大学细胞与遗传实验室完成。选择1岁龄骨骼成熟的健康绵羊,雌雄不拘,体质量20～30kg。①采用Percoll分离液,经密度梯度离心法自成年绵羊髂骨骨髓分离得到间充质干细胞,体外培养至第3代时,将骨髓间充质干细胞分为2组,实验组细胞贴壁后更换培养液,以无血清H-DMEM特定培养液诱导(内含转化生长因子β310μg/L、地塞米松10-7mol/L、胰岛素样生长因子I10μg/L、维生素C50mg/L),对照组加含10%胎牛血清的L-DMEM培养液,3d换液一次。②在相差显微镜和透射电镜下观察细胞形态和超微结构,分别在诱导后的第7天、14天取出玻片,进行细胞形态学、组织化学和免疫组织化学分析,甲苯胺蓝染色和Ⅱ型胶原免疫组化鉴定间充质干细胞诱导后的软骨细胞表型。结果:①相差显微镜观察实验组诱导14d后,细胞形态由梭形逐渐向多角形、多边形转变,并出现聚集成堆现象,而对照组细胞仍保持均一的梭形,增殖能力非常旺盛。②透射电镜可见实验组诱导14d后的骨髓间充质干细胞周边绒毛增多,胞浆内富含粗面内质网、高尔基体和线粒体,表明细胞合成代谢旺盛。而对照组的骨髓间充质干细胞的细胞壁较光滑,胞核呈条状,核壁有许多皱襞和突起,细胞器也比较丰富。③免疫组织化学观察实验组诱导14d后甲苯胺蓝染色和Ⅱ型胶原染色阳性。而对照组诱导14d后甲苯胺蓝染色阳性,Ⅱ型胶原免疫组化染色则为阴性。结论:骨髓间充质干细胞在特定的诱导条件下能够分化为软骨细胞表型,可为软骨组织工程提供较为理想的种子细胞来源。     

诱导骨髓间充质干细胞向成骨细胞和成软骨细胞分化

目的：探讨小香猪骨髓间充质干细胞（MSC）向成骨细胞和成软骨细胞诱导分化的能力。方法：选用早期贴壁培养的小香猪骨髓MSC，在传代两三次后加入条件培养基，观察了细胞的形态学变化，同时检测碱性磷酸酶、钙盐沉积以及细胞外基质和Ⅱ型胶原的表达。结果：MSC在骨形成蛋白（BMP）、地塞米松和β－磷酸甘钠的作用下，两三天细胞从梭形变为圆形或类圆形，细胞体积增大，12－15d时细胞集落的表面可见有颗粒状物质分泌，碱性磷酸酶染色为阳性，20－25d时，分泌颗粒更加明显，核固红染色为阳性，表现出成骨细胞的特点，在培养体系中加入地塞米松和转化生长因子－β1后两三，可见细胞由类成纤维状变为圆形成椭圆形状，有的呈肾性，体积增大，10d后可见细胞周围有基质分泌，Ⅱ型胶原染色为阳性，表现为软骨细胞分化的特点。结论：在一定培养条件下成功诱导小香猪骨髓MSC向成骨细胞和成软骨细胞分化，为我们进一步的研究打下基础。     

骨髓间充质干细胞体外诱导分化软骨细胞表型的可行性

目的：探讨在体外特定培养条件下诱导绵羊骨髓间充质干细胞定向分化为软骨细胞表型的可行性。 方法：实验于2005—09／2006—02在首都医科大学细胞与遗传实验室完成。选择1岁龄骨骼成熟的健康绵羊，雌雄不拘，体质量20—30kg。①采用Percoll分离液，经密度梯度离心法自成年绵羊髂骨骨髓分离得到间充质干细胞，体外培养至第3代时，将骨髓间充质干细胞分为2组，实验组细胞贴壁后更换培养液，以无血清H—DMEM特定培养液诱导（内含转化生长因子β3 10μg/L、地塞米松10^-7mol／L、胰岛素样生长因子I10μg/L、维生索C50mg／L），对照组加含10％胎牛血清的L—DMEM培养液，3d换液一次。②在相差显微镜和透射电镜下观察细胞形态和超微结构，分别在诱导后的第7天、14天取出玻片，进行细胞形态学、组织化学和免疫组织化学分析，甲苯胺蓝染色和Ⅱ型胶原免疫组化鉴定间充质干细胞诱导后的软骨细胞表型。 结果：①相差显微镜观察实验组诱导14d后，细胞形态由梭形逐渐向多角形、多边形转变。并出现聚集成堆现象，而对照组细胞仍保持均一的梭形，增殖能力非常旺盛。②透射电镜可见实验组诱导14d后的骨髓间充质干细胞周边绒毛增多，胞浆内富含粗面内质网、高尔基体和线粒体，表明细胞合成代谢旺盛。而对照组的骨髓间充质干细胞的细胞壁较光滑，胞核呈条状，核壁有许多皱裴和突起，细胞器也比较丰富。③免疫组织化学观察实验组诱导14d后甲苯胺蓝染色和Ⅱ型胶原染色阳性。而对照组诱导14d后甲苯胺蓝染色阳性，Ⅱ型胶原免疫组化染色则为阴性。 结论：骨髓间充质干细胞在特定的诱导条件下能够分化为软骨细胞表型．可为软骨组织工程提供较为理想的种子细胞来源。     

共培养诱导人脐血间充质干细胞向软骨细胞分化

背景：研究发现共培养可诱导人源干细胞向特定细胞分化,但如何控制两种细胞间比例以最大效率获得目的细胞是研究中的难题。目的：观察人脐血问充质干细胞与兔软骨细胞按不同比例共培养后向软骨细胞分化的情况。方法：复苏人脐血间充质干细胞并进行传代,将经流式细胞仪鉴定的人脐血间充质干细胞与体外分离的兔软骨细胞按照2：1或3：1的比例共培养,并用100pg／L的胰岛素样生长因子1进行诱导。在共培养14d,提取细胞RNA和蛋白质,实时定量PCR检测聚集蛋白多糖和Ⅱ型胶原mRNA的表达,Westernblot检测聚集蛋白多糖和Ⅱ型胶原蛋白的表达。结果与结论：人脐血间充质干细胞与兔软骨细胞共培养14d,共培养的细胞聚集蛋白多糖和Ⅱ型胶原mRNA及蛋白的表达高于单纯胰岛素样生长因子1诱导的细胞。在人脐血间充质干细胞与软骨细胞比例相同时,加入胰岛素样生长因子1可提高细胞聚集蛋白多糖和Ⅱ型胶原mRNA及蛋白的表达。同时人脐血间充质干细胞与兔软骨细胞按3：1共培养更能促进细胞Ⅱ型胶原mRNA和蛋白及聚集蛋白多糖蛋白的表达;而按2：1共培养时,细胞聚集蛋白多糖mRNA表达更多。可见人脐血问充质干细胞与兔软骨细胞共培养后可诱导人脐血间充质干细胞向软骨细胞分化,且按3：1的比例共培养可获得更多的软骨细胞。     

体外诱导人骨髓间充质干细胞分化为软骨细胞

背景：自体软骨细胞来源困难是束缚软骨细胞移植和软骨工程学发展的主要问题之一。骨髓间充质干细胞具有多向分化潜能，在不同诱导条件下，骨髓间充质干细胞能分化形成多种组织细胞，如软骨细胞、成骨细胞、成肌细胞及神经细胞等。胰岛素样生长因子-Ⅰ是一种对肢体和软骨的形成及发育起重要调控作用的生长因子。 目的：观察胰岛素样生长因子-Ⅰ和软骨细胞培养液是否能在体外诱导骨髓间充质干细胞向软骨细胞分化。 设计：开放性实验。 单位：中山大学附属第二医院骨科和医学研究中心。 材料：实验于2003-03／11在中山大学附属第二医院医学研究中心完成。人骨髓间充质干细胞取自因健康原因需终止妊娠的4～6月龄水囊引产的胚胎。 方法：采用Percoll分离液分离培养人胚骨髓间充质干细胞，体外扩增，用流式细胞仪测定骨髓间充质干细胞的CD44，CD71，CD34, CD45表达；在第4代骨髓间充质干细胞的培养基中加入100μg／L胰岛素样生长因子-Ⅰ和软骨细胞培养液，采用倒置显微镜观察、Ⅱ型胶原免疫组织化学、细胞内蛋白多糖含量测定等方法判断诱导细胞的形态变化和表达软骨基质的能力。 主要观察指标：通过检测细胞CD34，CD44，CD45的表达，进行骨髓间充质干细胞表型鉴定。通过观测诱导后细胞Ⅱ型胶原免疫组织化学及细胞分泌蛋白多糖能力的变化判断其是否向软骨细胞分化。 结果：①倒置显微镜观察结果：体外培养的骨髓间充质干细胞呈现成纤维细胞形态。②骨髓间充质干细胞表面抗原鉴定：流式细胞仪结果显示细胞均一性较好，第4代骨髓间充质干细胞阳性表达CD44，阴性表达CD34，CD45，说明分离获得的细胞符合骨髓间充质干细胞的特点：③光镜下观察骨髓间充质干细胞诱导为软骨细胞的形态变化：加入软骨细胞条件培养液和胰岛素样生长因子-Ⅰ共培养，在培养过程中见骨髓间充质干细胞逐渐变圆，15d后可见部分细胞呈短梭形或多角形．突起短，呈现软骨细胞的特征。④Ⅱ型胶原免疫组织化学染色：胰岛素样生长因子组细胞在培养后第15天约72．5%的细胞可见棕黄色的颗粒分布于胞浆内，呈弱阳性或较强阳性。对照组骨髓间充质干细胞第15天的Ⅱ型胶原免疫组织化学为阴性。⑤蛋白多糖含量测定：胰岛素样生长因子-Ⅰ和软骨细胞培养液共培养组培养15d后，细胞内蛋白多糖含量为[8．92&;#177;0．91）μg／L，高于单纯骨髓间充质干细胞培养组Ⅰ（2．56&;#177;0．26）μg／L，P〈0．05]，但低于软骨细胞组[（13．69&;#177;1．51）μg／L，P〈0．05]。 结论：胰岛素样生长因子-Ⅰ和软骨细胞培养液能诱导骨髓间充质干细胞向软骨细胞分化。     

甲状腺素诱导人脐血间充质干细胞向软骨细胞分化中的作用

背景：研究发现共培养可诱导人源干细胞向特定细胞分化,但如何获得更多的组织工程所需的种子细胞是研究中的难题。目的：探讨不同浓度甲状腺素在人脐血间充质干细胞向兔软骨细胞分化中的作用。方法：将人脐血间充质干细胞与兔软骨细胞按照2∶1比例共培养,并用含有不同浓度甲状腺素(0,0.01,0.1,1,10μmol/L)的培养基分组刺激,共培养14 d后分别观察各组细胞形态,并提取细胞RNA和蛋白质,Real-time PCR检测聚集蛋白多糖mRNA及Ⅱ型胶原mRNA表达量,Western blotting技术检测Ⅱ型胶原及聚集蛋白多糖蛋白表达水平。结果与结论：加入0.01,0.1,1,10μmol/L的甲状腺素干预后,聚集蛋白多糖、Ⅱ型胶原mRNA和蛋白的表达水平均随甲状腺素浓度增加而增强,与单纯共培养组比较差异有显著性意义(P <0.05)。实验证明高浓度甲状腺素可增强人脐血间充质干细胞与兔软骨细胞共培养后向软骨细胞分化的能力。     

体外诱导人骨髓间充质干细胞分化为软骨细胞

背景:自体软骨细胞来源困难是束缚软骨细胞移植和软骨工程学发展的主要问题之一。骨髓间充质干细胞具有多向分化潜能,在不同诱导条件下,骨髓间充质干细胞能分化形成多种组织细胞,如软骨细胞、成骨细胞、成肌细胞及神经细胞等。胰岛素样生长因子-I是一种对肢体和软骨的形成及发育起重要调控作用的生长因子。目的:观察胰岛素样生长因子-I和软骨细胞培养液是否能在体外诱导骨髓间充质干细胞向软骨细胞分化。设计:开放性实验。单位:中山大学附属第二医院骨科和医学研究中心。材料:实验于2003-03/11在中山大学附属第二医院医学研究中心完成。人骨髓间充质干细胞取自因健康原因需终止妊娠的4～6月龄水囊引产的胚胎。方法:采用Percoll分离液分离培养人胚骨髓间充质干细胞,体外扩增,用流式细胞仪测定骨髓间充质干细胞的CD44,CD71,CD34,CD45表达;在第4代骨髓间充质干细胞的培养基中加入100μg/L胰岛素样生长因子-I和软骨细胞培养液,采用倒置显微镜观察、Ⅱ型胶原免疫组织化学、细胞内蛋白多糖含量测定等方法判断诱导细胞的形态变化和表达软骨基质的能力。主要观察指标:通过检测细胞CD34,CD44,CD45的表达,进行骨髓间充质干细胞表型鉴定。通过观测诱导后细胞Ⅱ型胶原免疫组织化学及细胞分泌蛋白多糖能力的变化判断其是否向软骨细胞分化。结果:①倒置显微镜观察结果:体外培养的骨髓间充质干细胞呈现成纤维细胞形态。②骨髓间充质干细胞表面抗原鉴定:流式细胞仪结果显示细胞均一性较好,第4代骨髓间充质干细胞阳性表达CD44,阴性表达CD34,CD45,说明分离获得的细胞符合骨髓间充质干细胞的特点。③光镜下观察骨髓间充质干细胞诱导为软骨细胞的形态变化:加入软骨细胞条件培养液和胰岛素样生长因子-I共培养,在培养过程中见骨髓间充质干细胞逐渐变圆,15d后可见部分细胞呈短梭形或多角形,突起短,呈现软骨细胞的特征。④Ⅱ型胶原免疫组织化学染色:胰岛素样生长因子组细胞在培养后第15天约72.5%的细胞可见棕黄色的颗粒分布于胞浆内,呈弱阳性或较强阳性。对照组骨髓间充质干细胞第15天的Ⅱ型胶原免疫组织化学为阴性。⑤蛋白多糖含量测定:胰岛素样生长因子-I和软骨细胞培养液共培养组培养15d后,细胞内蛋白多糖含量为(8.92±0.91)μg/L,高于单纯骨髓间充质干细胞培养组[(2.56±0.26)μg/L,P<0.05],但低于软骨细胞组[(13.69±1.51)μg/L,P<0.05]。结论:胰岛素样生长因子-I和软骨细胞培养液能诱导骨髓间充质干细胞向软骨细胞分化。     

肝细胞生长因子诱导前软骨干细胞向软骨细胞的分化

目的:探讨肝细胞生长因子诱导前软骨干细胞向软骨细胞分化的机制。方法:实验于2005-12/2006-03在河南省正骨研究院完成。①实验材料:普通级新生兔10只,平均体质量3kg。②实验干预:采用免疫磁珠分离技术分离新生兔长骨干骺端前软骨干细胞。利用肝细胞生长因子(浓度分别为0.5,1,2,4μg/L)作用前软骨干细胞;另以2μg/L肝细胞生长因子作用前软骨干细胞,对照用相同剂量的培养基,检测前软骨干细胞Ⅱ型胶原及Ⅱ型胶原mRNA的表达。③实验评估:采用光学显微镜观察前软骨干细胞形态及生长情况;四甲基偶氮唑盐比色法检测前软骨干细胞的增殖;免疫荧光检测Ⅱ型胶原表达;反转录-聚合酶链反应检测Ⅱ型胶原mRNA的表达。结果:①前软骨干细胞形态及生长情况:分离纯化的前软骨干细胞贴壁稳定,在光学显微镜下呈多角和梭形,生长旺盛,曲光度好。②前软骨干细胞增殖情况:细胞增殖率上升,在24,48,72h内呈时间浓度依赖。③Ⅱ型胶原表达:肝细胞生长因子作用第5天前软骨干细胞出现Ⅱ型胶原蛋白的表达。④Ⅱ型胶原mRNA的表达:在肝细胞生长因子刺激3d开始出现表达,并且5d,7d逐渐增加。结论:肝细胞生长因子作用前软骨干细胞后,出现软骨特征标志抗原Ⅱ型胶原的表达,细胞增殖活性上升,表明肝细胞生长因子能诱导前软骨干细胞向软骨细胞方向分化。其机制可能是前软骨干细胞也存在肝细胞生长因子受体。     

犬骨髓基质干细胞体外定向分化为软骨细胞

背景:骨髓基质干细胞的多向分化性不利于向软骨细胞单一方向分化,植入体内后成骨系细胞分泌的骨形态发生蛋白作用于非定向分化的前体细胞,使其向成骨细胞分化,而已定向分化的细胞则不受骨形态发生蛋白的影响,形成相应的组织.目的:体外诱导犬骨髓基质干细胞定向分化为软骨细胞,探讨体外诱导成软骨的方法和条件.设计、时间及地点:单一样本观察,于2005-03/2006-01在中山大学组织工程实验室完成.材料:选取4个月龄雄性家犬1只,骨髓基质干细胞取自犬肋骨.方法:自犬肋骨取骨髓2.0～3.0mL行体外原代骨髓基质干细胞分离培养.8～11d细胞接近融合时,加入胰酶消化,用含体积分数10%胎牛血清的L-DMEM合成培养液终止消化,收集细胞悬液,离心后,用培养液悬浮细胞,按1:3接种传代.取第3代细胞培养扩增,换液时加入10μg/L碱性成纤维细胞生长因子2mL,换液2次后,再加入1mg/L转化生长因β1 2mL诱导骨髓基质干细胞向软骨细胞分化.主要观察指标:行甲苯胺蓝、阿新蓝染色检测软骨基质的分泌,免疫组织化学染色检测软骨特异性Ⅱ型胶原表达.结果:骨髓基质干细胞体外行原代和传代培养至P4代生长良好,经碱性成纤维细胞生长因子和转化生长因β1扩增诱导的细胞甲苯氨蓝异染性、阿新蓝染色阳性;Ⅱ型胶原免疫组织化学检测阳性,显示被诱导的骨髓基质干细胞具备软骨细胞特性.结论:应用碱性成纤维细胞生长因子和转化生长因β1体外可以诱导犬骨髓基质干细胞分化为软骨细胞,诱导的软骨细胞可作为软骨组织工程较理想的种子细胞.     

透骨消痛颗粒含药血清诱导骨髓基质干细胞向软骨细胞分化

背景：骨髓基质干细胞根据环境而有不同的分化路径,在特定的环境中有分化为透明软骨细胞的趋势,可能为治疗骨性关节炎提供新思路。目的：观察透骨消痛颗粒含药血清对骨髓基质干细胞向软骨分化的影响。方法：取SD大鼠四肢建立体外培养的骨髓基质干细胞,取第3代骨髓基质干细胞进行干预,分为生理盐水血清组、透骨消痛颗粒水提物血清组、透骨消痛颗粒醇提物血清组、诱导软骨剂组、透骨消痛颗粒水提物血清＋诱导软骨剂组、透骨消痛颗粒醇提物血清＋诱导软骨剂组。Real time PCR及Western Blot检测Sox9、collagenⅡ、collagenⅩ mRNA及蛋白表达。结果与结论：含药血清干预14d后,Sox9、collagenⅡ、collagenⅩ mRNA及蛋白表达水平,透骨消痛颗粒水提物血清组、透骨消痛颗粒醇提物血清组、诱导软骨组、透骨消痛颗粒水提物血清＋诱导软骨剂组、透骨消痛颗粒醇提物血清＋诱导软骨剂组明显高于生理盐水血清组（P〈0.05,P〈0.01）,诱导软骨组、透骨消痛颗粒水提物血清＋诱导软骨剂组、透骨消痛颗粒醇提物血清＋诱导软骨剂组明显高于透骨消痛颗粒水提物血清组、透骨消痛颗粒醇提物血清组（P〈0.01）,其中Sox9表达透骨消痛颗粒水提物血清＋诱导软骨剂组高于诱导软骨。说明透骨消痛颗粒含药血清通过上调Sox9的表达,加速骨髓基质干细胞细胞向软骨细胞分化。     

定向诱导骨关节炎患者骨髓间充质干细胞向软骨细胞的分化

背景:近年来有关影响软骨和软骨下骨组织再生的炎症因子、生长因子以及力学负荷已有许多报道,但对骨关节炎整体发生机制还欠缺全面地了解。目的:探讨骨关节炎患者骨髓间充质干细胞功能状态与病情进展的相关性。方法:抽取股骨颈骨折患者、轻度及重度骨性关节患者股骨骨髓,贴壁法分离培养出骨髓间充质干细胞,采用CCK-8法检测各组患者骨髓间充质干细胞的增殖能力,取第3代骨髓间充质干细胞成软骨诱导培养2周后进行甲苯胺蓝染色。结果与结论:从各组患者骨髓中均培养出骨髓间充质干细胞,对照组细胞的增殖能力明显高于轻度骨性关节炎组、重度骨性关节炎组;成软骨诱导分化后骨髓间充质干细胞形态发生明显改变,由长梭形逐渐变为类圆形或多角形,核浆比例明显减小,诱导细胞甲苯胺蓝染色阳性。重度骨性关节炎组诱导出的软骨细胞的数量少于对照组,但细胞形态差异不大。结果表明骨性关节炎的发生与自身的骨髓间质干细胞的功能形态呈现负相关趋势。     

人脂肪干细胞体外培养特性及成脂成软骨分化

目的:观察人脂肪组织间充质干细胞体外分离培养及成脂、成软骨诱导分化的生物学性状,探讨其作为软骨组织工程种子细胞的可行性。方法:实验于2006-08/2007-03在吉林大学中日联谊医院前列腺疾病防治研究中心完成主要工作。实验方法:①人脂肪组织来源于健康成年女性腹部吸脂术,酶消化法分离出脂肪间充质干细胞,接种于含体积分数为0.10胎牛血清的高糖DMEM培养基进行原代培养。②取第3代脂肪间充质干细胞,采用细胞计数法测定细胞生长曲线,流式细胞仪测定CD13、CD34抗原的表达,免疫荧光法测定CD34抗原的表达。③取第3代脂肪间充质干细胞,用含体积分数为0.10胎牛血清、0.5mmol/LIBMX、1μmol/L地塞米松、10μmol/L胰岛素的成脂诱导培养基和含体积分数为0.01胎牛血清、10μg/L转化生长因子β1、50nmol/L抗坏血酸、6.25mg/L胰岛素的成软骨诱导培养基分别诱导分化。④每天用倒置显微镜观察细胞形态及增殖变化,油红"O"、AB-PSA染色和Ⅱ型胶原免疫细胞化学染色检测成脂、成软骨分化情况。结果:①体外培养的脂肪间充质干细胞呈扁平的长梭形,细胞形态均一,传代稳定。间质细胞相关标志CD13和干细胞相关标志CD34表达阳性。②定向诱导后表现出脂肪细胞和软骨细胞特性。经成脂诱导,细胞内出现空泡,油红"O"染色呈红色;经成软骨染色,AB-PSA染色呈紫红色,Ⅱ型胶原免疫细胞化学染色胞浆呈棕黄色。结论:脂肪干细胞能向软骨细胞方向诱导分化,可作为软骨组织工程种子细胞。     

转化生长因子β1联合骨形态发生蛋白2诱导骨髓间充质干细胞体外向软骨细胞的分化

背景:国内外许多学者成功利用转化生长因子β1诱导骨髓间充质干细胞向软骨细胞分化报道较多,而对骨形态发生蛋白2作为诱导因子诱导骨髓间充质干细胞向软骨细胞分化的报道较少.目的:观察验证转化生长因子β1和骨形态发生蛋白2诱导骨髓间充质干细胞下向软骨细胞表型转化的可能性及相互作用.方法:取健康Wistar大鼠骨髓,采用贴壁法筛选获得骨髓间充质干细胞.按添加生长因子的不同分为4组:转化生长因子β1+骨形态发生蛋白2组,转化生长因子β1组,骨形态发生蛋白2组,对照组不添加任何生长因子.于诱导14 d后,分别进行阿利新蓝染色和二甲基亚甲蓝比色法定性定量检测糖胺聚糖的分泌表达,免疫组织化学法检测软骨特异性Ⅱ型胶原的表达.结果与结论:3个加入细胞因子的实验组在阿利新蓝染色和软骨特异性Ⅱ型胶原疫组化法检测中均有不同程度的阳性表达,糖胺聚糖的定量检测中,转化生长因子β1+骨形态发生蛋白2联合应用组的糖胺聚糖含量明显高于其他组(P<0.05).结果提示转化生长因子β1、骨形态发生蛋白2联合作用更能促进骨髓间充质干细胞向软骨细胞诱导分化,分泌软骨特异性基质,有可能成为软骨组织工程较理想的种子细胞来源.     

与软骨细胞共培养和条件培养液诱导骨髓间充质干细胞向软骨细胞分化的比较

背景:骨髓间充质干细胞体外转化很大程度上依赖于合适的培养条件。目的:比较与软骨细胞共培养和条件培养液2种不同的诱导方案诱导骨髓间充质干细胞向软骨细胞分化的特点。方法:分离培养大鼠骨髓间充质干细胞和耳软骨细胞,采用骨髓间充质干细胞与软骨细胞共培养及条件培养液诱导成软骨的方法,诱导骨髓间充质干细胞向软骨细胞分化。以MTT法及流式细胞仪检测细胞活性及周期,糖胺多糖、甲苯胺蓝以及免疫组化染色检测细胞生物学特性,以RT-PCR法检测诱导后的软骨细胞Ⅱ型胶原RNA表达情况。结果与结论:采用共培养方式诱导的软骨细胞,其生物学特性与采用条件培养液诱导的软骨细胞相比,前者优于后者,如分泌糖胺多糖的能力以及基质分泌量均较高。提示共培养方式诱导的软骨细胞更接近正常软骨细胞,更有利于作为组织工程软骨的种子细胞。