DNA甲基转移酶3A siRNA 真核表达载体的构建和鉴定

目的:构建DNA甲基转移酶3A(DNA methyltransferases 3A,DNMT3A)siRNA重组质粒稳定表达载体,为进一步探讨DNMT3A在多种生物学过程及肿瘤发生发展中的机制提供工具.方法:依据DNMT3A基因的cDNA序列,利用siDESIGN软件获得RNAi靶位点后设计出对应的siRNA寡核苷酸模板,体外合成寡核苷酸片段经退火形成短双链,克隆到真核表达载体pSUPER-EGFP1中,构建DNMT3A siRNA重组质粒载体,经酶切鉴定后转染人肝癌细胞系SMMC-7721,荧光实时定量PCR初步分析DNMT3A经RNA干涉后的沉默效应.结果:成功构建了靶向DNMT3A基因的siRNA重组稳定表达载体,此载体有效地降低了肝癌细胞系中DNMT3A基因的表达水平.结论:通过该方法初步确定了沉默DNMT3A基因的较佳靶点.     

DNA甲基转移酶3b催化区保守序列shRNA真核表达载体构建

目的构建针对基因DNA甲基转移酶3bmRNA催化区保守序列的shRNA真核表达载体,并对其克隆进行鉴定。方法以DNMT3bmRNA序列为靶基因设计3条shRNA和一条阴性对照HK,应用基因重组技术将其克隆到真核表达载体PGensil-1中,构建真核表达载体P-DNMT3b-shRNA1、P-DNMT3b-shRNA2、P-DNMT3b-shRNA3、P-HK。将重组质粒转化到大肠杆菌DH5α中,接种于LB平板后分别挑取5个单克隆菌落进行扩增,经筛选后对提取质粒进行测序鉴定。结果重组质粒经SalI酶切鉴定得到大小2个基因片段,大片段约为4．55kb,小片段约为440bp,与设计相同;四组重组质粒经测序鉴定显示插入完全正确。结论成功构建了P-DNMT3b-shRNA（1、2、3）及HK真核表达载体,为下一步实验奠定了基础。     

杆状病毒介导的靶向DNA甲基转移酶1 siRNA表达载体的构建

目的:构建携带DNA甲基转移酶1(DNA methyltransferase 1,DNMT1)RNAi基因的重组杆状病毒载体,以进一步研究DNMT1对胰腺癌相关基因的影响方法:首先将带有BglⅡ和Hind Ⅲ酶切黏性末端的60 bp正义和反义寡核苷酸退火,与用BglⅡ和Hind Ⅲ双酶切后的线性化载体pSUPER连接构...     

宫颈癌组织中DNA甲基转移酶1、3A和3B mRNA的表达

目的探讨DNA甲基转移酶1、3A和3B在宫颈癌发生发展中的作用。方法应用real-time PCR技术检测10例宫颈癌、10例宫颈上皮内瘤变和10例正常宫颈组织DNMT1、3A和3BmRNA的表达。结果宫颈癌组织、宫颈上皮内瘤变和正常宫颈中DNMT 1mRNA对GAPDH mRNA的相对丰度值分别是0.30±0.1、0.26±0.12和0.10±0.04,宫颈癌组织组织中与正常宫颈中DNMT 1表达有显著差异（P〈0.05）;宫颈癌组织、宫颈上皮内瘤变和正常宫颈中DNMT3A mRNA对GAPDH mRNA的相对丰度值分别是0.94±0.27、0.51±0.24和0.13±0.04,三组相比较有显著性差异（P〈0.05）;宫颈癌组织、宫颈上皮内瘤变和正常宫颈中DNMT 3B mRNA对GAPDH mR-NA的相对丰度值分别是0.30±0.09、0.28±0.11和0.11±0.04,宫颈癌组织组织中与正常宫颈中DNMT 3B表达有显著差异（P〈0.05）。结论 DNMT1、3A和3B参与了宫颈癌的发生,并在宫颈上皮内瘤变时就已经起了一定作用。     

靶向DNA甲基转移酶1的siRNA表达载体的构建与筛选

目的:构建针对DNA甲基转移酶(dnmt1)基因的小干扰RNA(small interference RNA,siRNA)表达载体,以用于后续的RNA干扰研究.方法:针对人dnmt1的mRNA序列,设计并合成6条编码siRNA的寡核苷酸片段,经退火成互补双链,克隆至载体pSilencer3.1-H1中构建3个重组体,分别命名为pshRNA-dnmt1-A、pshRNA-dnmt1-B和pshRNA-dnmt1-C.并进行测序鉴定.再利用无内毒素的大提质粒试剂盒制备无内毒素的pshRNA-dnmt1-A、B和C,分别通过脂质体介导转染宫颈癌HeLa细胞,以未转染和转染空载体者为对照.采用RT-PCR和Western blot检测转染细胞dnmt1 mRNA及蛋白表达情况.结果:成功构建了表达靶向dnmt1的siRNA重组载体;转染pshRNA-dnmt1-C对HeLa细胞dnmt1基因的表达几乎尤影响.pshRNA-dnmt1-A、B均能有效沉默HeLa细胞中dnmt1基因的表达,其dnmt1 mRNA表达的抑制率分别为21.8%和69.7%,蛋白表达的抑制率分别为27.9%和73.2%.以pshRNA-dnmt1-B的十扰效果最佳.结论:成功构建并筛选出了有效的dnmt1 siRNA表达载体.     

DNA聚合酶β靶向siRNA真核表达载体的构建和鉴定

目的：构建DNA聚合酶β（polβ）靶向的小干扰RNA（siRNA）真核表达载体。方法：根据GenBank中人DNApolβ基因（M13140）的全长序列,利用设计分析软件设计2个DNApolβ靶向发卡样siRNA结构,退火后形成双链,克隆入表达载体pslience2.0-GFP,得到重组质粒pslience2.0-GFP-sipolβ1和pslience2.0-GFP-sipolβ2。通过限制性核酸内切酶酶切和DNA序列测定对重组质粒进行鉴定。结果：经酶切鉴定寡核苷酸已成功插入表达载体pslience2.0-GFP,DNA序列分析表明插入片段序列与合成的siRNA序列相同。结论：成功构建了靶向DNApolβsiRNA真核表达载体。     

人DNA甲基化转移酶3B1真核表达载体的构建和鉴定

目的:构建人DNA甲基化转移酶3B1(DNMT3B1)真核表达载体pCMV-DNMT3B1.方法:根据Genebank中人DNMT3B1 cDNA序列设计并合成特异性引物,提取HCT116细胞总RNA,利用PCR技术扩增出DNMT 3B1,并将扩增产物克隆到真核表达载体pCMV-2B中.结果:PCR扩增得到人DNMT3B1的cDNA片段大小为2.6 kb,重组子利用限制性内切酶进行酶切、PCR鉴定和DNA序列分析得到真核表达载体pCMV-DNMT3B1.结论:成功构建了人DNMT3B1真核表达载体,为进一步研究DNMT3B1提供了条件.     

G156A六氧甲基鸟嘌呤-DNA-甲基转移酶原核表达载体的构建和表达

目的：构建原核表达载体pPROEX HTb-G156A MGMT，观察突变型G156A MGMT在大肠杆菌中的表达情况。方法：通过基因重组技术将G156AMGMT亚克隆至pPROEX HTb原核表达载体，在大肠杆菌DH5α中经异丙基硫代-β-D半乳糖苷(IPTG)诱导表达。结果：经PCR及酶切分析证实，成功构建了pPROEX HTb-G156A MGMT原核表达载体，经SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS—PAGE)显示重组克隆化基因pPROEX HTb-G156A MGMT在大肠杆菌DH5α中有表达。结论：G156A MGMT在大肠杆菌DH5α中有表达，为获取突变型MGMT工程蛋白奠定了基础。     

MGMT反义RNA真核表达载体的构建与鉴定

目的：探讨反义ＲＮＡ逆转胶质瘤细胞耐药的可能性，构建ＭＧＭＴ反义ＲＮＡ的真核表达载体。方法：以ＸｈｏⅠ和ＰｖｕⅡ双酶切质粒ｐＨＭ１４，回收１７８ｂｐ的片段，定向插入以ＨｐａⅠ和ＸｈｏⅠ双酶切ｐＬＸＳＮ所获得的线性化载体，构建针对ＭＧＭＴｍＲＮＡ５＇端的反义表达载体ｐＬａＭＴ５ＳＮ；以ＥｃｏＲⅠ单酶切ｐＨＭ１４，回收７７９ｂｐ的片段，插入以ＥｃｏＲⅠ单酶切ｐＬＸＳＮ并经ＣＩＡＰ去磷酸化的线性载体，构建针对ＭＧＭＴｍＲＮＡ全长序列的反义表达载体ｐＬａＭＴＳＮ。结果：ｐＬａＭＴ５ＳＮ经ＨｉｎｄⅢ酶切可见３７０ｂｐ的片段；ｐＬａＭＴＳＮ经ＰＣＲ扩增证明目的片段反向插入ｐＬＸＳＮ，鉴定结果表明构建成功。结论：成功构建了两个ＭＧＭＴ反义ＲＮＡ的真核表达载体，为研究ＭＧＭＴ反义ＲＮＡ逆转胶质瘤耐药细胞的耐药表型提供了良好的实验材料。     

NS特异性siRNA真核表达载体的构建

目的：构建nucleostemin(核干细胞因子，NS)特异性siRNA真核表达载体。方法：以小鼠组织基因组DNA为模板，PCR方法克隆小鼠编码U6 snRNA基因的启动于，将NS—siRNA表达序列、PolⅢ识别的终止信号与U6启动于连接起来，并将其插入pcDNA4／C载体中。结果：(1)从小鼠基因组DNA中克隆到编码U6 snRNA基因的启动子，(2)构建了含有U6启动子、NS—siRNA表达序列和PolⅢ识别终止信号的NS—siRNA表达的片段，(3)将NS—siRNA表达片段插入了pcDNA4／C真核表达载体。结论：构建了针对NS特异性的siRNA真核表达载体pcDNA4／C—NS—Silencer。     

DNMT1、DNMT3b siRNA重组质粒的构建及鉴定

目的:构建DNA甲基转移酶(DNMT1)、DNMT3b微干扰RNA(siRNA)重组质粒,并鉴定其正确性。方法:构建DNMT1siRNA重组质粒和DNMT3b siRNA重组质粒各4种,分别用BamHⅠ和PstⅠ酶切、测序、鉴定。结果:用BamHⅠ和PstⅠ进行双酶切后所有质粒均为阳性重组载体,每一种载体选择两个克隆进行测序鉴定,测序结果与插入的寡核苷酸的序列完全相符。结论:DNMT1 siRNA重组质粒和DNMT3b siRNA重组质粒正确,可用于后续实验。     

Osteopontin特异性siRNA真核表达载体的构建及其在GC9811胃癌细胞中沉默效应的鉴定

目的：构建骨桥蛋白(OPN)特异性siRNA(small interfere RNA)真核表达载体,体外观察对OPN基因的沉默作用．方法：采用基因克隆技术,将合成的特异性OPNRNA干扰寡核苷酸序列插入真核表达载体mU6pro,构建OPN siRNA真核表达载体．以脂质体法将mU6pro空载体和2个(mU6pro／OPN—siRNA1和mU6pro／OPN—siRNA2)重组质粒分别导入具有高转移特性的GC9811胃癌细胞系．72h后用RT—PCR和Western blotting技术检测各实验组胃癌细胞内OPN mRNA及蛋白水平的表达情况．结果：成功构建OPN siRNA真核表达载体．转染OPN—siRNA的胃癌细胞,72h后OPN mRNA及蛋白表达下调,而以mU6pro／OPN-siRNA1的抑制效果更为明显．结论：构建的RNA干扰真核表达载体能明显干扰OPN mRNA及蛋白的表达,为将其进一步应用于胃癌的治疗研究奠定了基础。     

人DNMT 3B7真核表达载体的构建和鉴定

目的构建人DNMT3B7真核表达载体pCMV-DNMT3B7。方法据Genebank中人DNMT3B7cDNA序列设计并合成特异性引物,以人DNMT3B1为模板,利用PCR技术扩增出DNMT3B7,并将扩增产物克隆到真核表达载体pCMV-2B中。结果 PCR扩增得到人DNMT3B7的cDNA片段大小为1.1kb,重组子利用限制性内切酶进行酶切、PCR鉴定和DNA序列分析得到真核表达载体pCMV-DNMT3B7。结论成功构建了人DNMT3B7真核表达载体,为进一步研究DNMT3B异构体提供了条件。     

重组脂联素真核表达质粒的构建与鉴定

目的构建重组人脂联素(ADPN)真核表达质粒,为进一步研究ADPN的功能提供实验基础.方法应用限制性内切酶双酶切载有人脂联素cDNA的重组克隆质粒pMD 18-T和真核表达质粒pcDNA 3.1 ,回收目的基因片段与线性化的真核表达质粒,经连接、转化大肠杆菌JM109,筛选阳性克隆,经酶切和核苷酸序列测定鉴定.结果重组真核表达质粒经HindⅢ、EcoRⅠ酶切后获得5.4 kb和800 bp两个片段,大小与理论值一致,并经核苷酸序列测定证实.结论成功地构建了人重组脂联素真核表达质粒.     

Construction and identification of a vector expressing TRAM siRNA in mammalian cells

Objective：To construct and identify a vector expressing TRAM siRNA in mammalian cells.Methods :It was constructed that the vector named R-pSUPER-EGFP used to transcribe functional TRAM siRNA. Two of pair 64 nt TRAM gene specific target sequences were inserted into the downstream of the H1 promoter. The recombinants were transformed into E. coli JM109, and finally their veracity was confirmed by double cutting with the enzymes and sequencing. R-pSUPER-EGFP was transfected into RAW264. 7 cell by using LipofectamineTM2000, and the expression of TRAM was detected by Western blotting. Results .. Two different recombinant plasmids containing corresponding TRAM gene specific target sequences were constructed, transfected into RAW264.7 cell line successively, which can specifically restrain expression of TRAM protein. Conclusion :The optimizing method in constructing the recombinant vector serves other plasmid-based RNA interference research. Therefore, the recombinant vectors establish the basis for research on the function of TRAM gene.     

大鼠基质金属蛋白酶抑制因子-1 pRNAT-U6.2 小干扰RNA表达载体的构建

目的:构建大鼠基质金属蛋白酶抑制因子-1(TIMP-1)小干扰RNA的真核表达质粒pRNAT-U6.2 siRNA.方法: 依据siRNA设计原则确定以序列447～465 nt、522～540 nt、142～160 nt为TIMP-1 siRNA靶序列, 体外分别合成两端含BamH Ⅰ和Xho Ⅰ酶切位点的编码短发夹RNA序列的DNA单链,退火后克隆于pGEM-T载体, T7和SP6为引物进行PCR鉴定;双酶切pGEM-T将其定向克隆到siRNA表达载体pRNAT-U6.2,用pRNAT-U6.2的插入鉴定引物进行PCR鉴定,阳性重组质粒测序.结果:DNA测序证实合成的并被克隆入真核表达载体pRNAT-U6.2的siRNA插入序列与设计完全符合.结论:TIMP-1 siRNA表达载体构建成功, 为后期研究TIMP-1 pRNAT-U6.2 siRNA作用、意义及效果奠定了实验基础.     

PTPN1基因siRNA表达载体的构建和鉴定

目的构建可沉默PTPN1基因的siRNA（siRNA）表达载体,并鉴定它对大鼠心肌细胞PTPN1基因的沉默率。方法合成3对发夹siRNA模版寡核苷酸链,退火形成双链后插入pSilencer载体,构建成可沉默PTPN1基因的siRNA表达载体,通过酶切和测序鉴定构建的siRNA表达载体,并导入培养的大鼠心肌细胞,通过实时荧光定量逆转录-聚合酶链反应和免疫印迹分析导入了siRNA表达载体的大鼠心肌细胞PTP1B的表达水平。结果酶切鉴定和测序结果证实构建的3个siRNA表达载体构建正确。实时荧光定量逆转录-聚合酶链反应检测显示构建的3个siRNA表达载体的干扰率分别为73.2%、84.7%及32.5%。它们的干扰效果被免疫印迹分析所证实。结论干扰率为84.7%的表达载体为构建成功的siRNA表达载体,可用于心肌细胞PTPN1基因的功能研究。     

磷脂酰肌醇激酶-3小干扰RNA真核表达载体的构建和鉴定

目的：构建和鉴定靶向磷脂酰肌醇激酶-3（PI3K） 亚单位编码基因PI3Kcb （catalytic,beta polypeptide）基因的小干扰RNA真核表达载体.方法：根据siRNA设计原则,在PI3Kcb mRNA序列中选择1个特异性靶序列,体外合成对应发卡样DNA片段,经退火后,将其定向克隆入siRNA载体pDC316-EGFP-U6,重组后获得siRNA载体质粒pDC316-PI3Kcb siRNA-EGFP,采用PCR检测和DNA测序以保证siRNA的方向和序列正确.结果：得到阳性重组克隆pDC316-PI3Kcb siRNA,经过PCR鉴定和测序,结果正确.结论：成功构建靶向PI3Kcb基因的siRNA载体pDC316-PI3Kcb siRNA-EGFP,为PI3Kcb的基因沉默研究奠定了可靠的基础.     

大鼠iNOS基因siRNA表达体系的构建及鉴定

目的:构建大鼠iNOS基因的siRNA表达体系,为建立RNAi干扰技术平台打下基础。方法:应用siR-NA设计软件在大鼠iNOS的mRNA上寻找特异性的短核苷酸序列,设计合成两条互补的小发夹结构的DNA序列,经退火后形成双链DNA片段,将其克隆到线性的pSilencerTM1.0-U6载体中,转化DH5α大肠杆菌,提取质粒,酶切鉴定后进行测序分析。结果:酶切和序列测定结果表明,大鼠iNOS基因的siRNA表达载体构建成功。结论:成功构建了大鼠iNOS基因的siRNA表达体系,为今后借助RNA干扰技术调节iNOS基因的表达、研究iNOS基因与其它因子的关系奠定了基础。