抗PSA/抗CD3两种双特异性单链抗体的活性研究

目的:研究并比较已成功构建的抗PSA/抗CD3两种双特异性单链抗体的生物学活性。方法:利用流式细胞仪和51Cr释放试验评价抗PSA/抗CD3双特异性单链抗体的抗原亲和活性和体外介导杀伤靶细胞的效果。建立前列腺癌裸鼠模型,分为非治疗组、对照组、双特异性单链抗体(BsAb)组和多价双特异性单链抗体(mBsAb)组,分析两种双特异性单链抗体在体内介导细胞毒T细胞对肿瘤细胞杀伤的能力。结果:流式细胞仪结果显示:BsAb与LNCaP细胞和Jurkat细胞的阳性结合率分别为56.3%和55.4%;mBsAb与LNCaP细胞和Jurkat细胞的阳性结合率分别为74.0%和83.0%。在体外,有细胞毒T细胞存在时两种抗体均可引起前列腺癌细胞的裂解,裂解效率分别与抗体浓度和T细胞与靶细胞比例呈正相关。与对照组比较,接种前列腺癌细胞的裸鼠在体内注射激活的细胞毒T细胞的同时分别接受两种抗体的治疗后,肿瘤生长均明显受到抑制(P<0.05)。在亲和力、体外杀伤和体内抑制肿瘤生长等方面,mBsAb的活性明显优于BsAb。结论:抗PSA/抗人CD3 BsAb及其四聚体均具有良好的生物学活性,单链抗体四聚体的形成可以明显改善抗体的生物学活性。     

抗前列腺特异抗原航CD3双特异性单链抗体四聚体的制备

本实验旨在构建人IgG3上游铰链区／p53四价功能域融合基因和抗前列腺特异抗原／抗CD3双特异性单链抗体的基础之上，进一步制备该双特异性单链抗体的四聚体。     

肿瘤细胞裂解物致敏的树突状细胞对结肠癌LoVo细胞的杀伤作用

目的 探讨肿瘤细胞裂解物致敏的树突状细胞(DC)作为佐剂对结肠癌LoVo细胞系的杀伤作用.方法 反复冻融法裂解培养的结肠癌LoVo细胞,提取细胞抗原并致敏DC,然后将后者与自身T淋巴细胞共同培养,观察其对自身T淋巴细胞增殖的影响以及活化的T淋巴细胞对LoVo细胞的杀伤作用.结果 结肠癌LoVo细胞裂解物致敏的DC能明显促进T淋巴细胞的增殖,后者对LoVo细胞的杀伤作用明显增强.结论 肿瘤细胞裂解物提取方法简单,易于临床实施,其作为细胞抗原致敏DC制备的肿瘤疫苗能有效活化并产生肿瘤特异性细胞毒T淋巴细胞,将有很好的临床应用前景.     

人源性抗前列腺特异性膜抗原单链抗体的基因构建、表达及鉴定

目的:分别构建人源性抗前列腺特异性膜抗原(PSMA)单链抗体(sc Fv)/鱼精蛋白截短体(tp)、sc Fv/弗林蛋白酶识别位点(Fdt)/流感病毒融合肽结构域(HA2)/tp融合蛋白基因。利用原核表达体系表达、纯化并检测sc Fv、sc Fv-tp、sc Fv-Fdt-HA2-tp融合蛋白的活性。方法:采用PCR的方法,扩增融合基因sc Fv、sc Fv-tp、sc Fv-Fdt-HA2-tp,将获得的基因克隆入原核表达载体p ET28,在大肠杆菌BL21中表达,表达产物经SDS-PAGE和Western印迹鉴定,通过Ni2+-NTA螯合层析纯化。ELISA分析融合蛋白抗原亲和活性。结果:成功构建了人源性抗PSMA融合基因,经IPTG诱导后在M15中以包涵体形式表达。表达的目的蛋白均能与PSMA抗原结合。结论:融合蛋白具有结合抗原的活性,为靶向递送siRNA的研究奠定了基础。     

采用单抗原微珠抗体检测肾移植受者体内供者特异性抗体

目的 总结应用单抗原微珠抗体检测肾移植受者体内供者特异性抗体(DSA)的经验,并探讨阳性DSA的处理方法及对移植肾功能的影响.方法 应用流式细胞微珠法检测亲属肾移植受者移植前后单抗原微珠抗体,并分析DSA与排斥反应、移植肾功能的关系.结果 30例患者,检测样本173份,其中移植前47份,移植后126份.移植前1例出现DSA,移植后8例出现DSA,应用硼替佐米及增加免疫抑制剂治疗.应用硼替佐米治疗者1例DSA免疫荧光强度下降至阴性水平,2例下降超过50％.出现DSA时与未出现DSA时的估算肾小球滤过滤分别为(1.50±0.59) ml/s与(1.23±0.38) ml/s,差异有统计学意义(P＜0.05).结论 采用单抗原微珠抗体动态检测DSA的效果好,DSA的出现影响了移植肾eGFR,应用硼替佐米治疗可使DSA免疫荧光滴度下降.     

应用结肠癌动物模型探讨CIK细胞的抗肿瘤活性和体内分布特点

目的：探讨细胞因子诱导的杀伤（CIK）细胞在活体内的分布规律和抗肿瘤活性。方法：以人结肠癌细胞HCT-8接种BALB／C裸鼠建立动物模型。体外培养CIK细胞后以同位素32P—adATP和荧光染料CM—DiI标记，经尾静脉注射入裸鼠体内。用放射性定量检测方法和荧光显微镜检测方法分析CIK细胞在各器官的动态分布。同时观察肿瘤的体积和重量变化。结果：CIK细胞输入裸鼠体内后，迅速分布至肝、脾、肾、肺、胃、肠等器官，其中肝、脾、肾的分布浓度最高。裸鼠皮下接种结肠癌细胞系HCT-8后，尾静脉注射CIK细胞可以明显抑制皮下移植肿瘤的生长。结论：CIK细胞可以明显抑制肿瘤的生长，同时其体内分布的广泛性表明它可以用于身体各部位恶性肿瘤的治疗。     

多价抗人精浆蛋白/抗CD3双特异性单链抗体的活性研究

目的探讨多价抗人精浆蛋白/抗CD3双特异性单链抗体的生物学活性.方法利用流式细胞仪和51Cr释放试验评价多价双特异性单链抗体的抗原亲和活性和体外介导杀伤靶细胞的效果.利用母性BALB/C裸鼠前列腺癌模型分析多价双特异性单链抗体在体内介导细胞毒T淋巴细胞对肿瘤细胞杀伤的能力.结果多价双特异性抗体可以特异性结合表达PSA的前列腺癌细胞和CD3阳性淋巴瘤细胞,阳性结合率分别为74%和83%.在体外,有细胞毒T淋巴细胞存在时多价抗体可引起前列腺癌细胞裂解.与对照组比较,接种前列腺癌细胞的裸鼠在注射激活的细胞毒T淋巴细胞的同时接受多价抗体治疗后,肿瘤生长明显受到抑制(P＜0.05).结论多价抗人精浆蛋白/抗CD3双特异性单链抗体具有良好的生物学活性,在体内外均可以介导细胞毒T淋巴细胞对靶细胞的杀伤.     

双抗靶向CIK细胞序贯PD-1抗体治疗老年原发性肝癌患者的护理

目的 探讨双抗靶向CIK细胞序贯PD-1抗体治疗在6例肝癌患者中的护理方法及效果。方法 6例患者在治疗过程中,给予针对性的心理护理、用药护理。其中2例出现不同程度的不良反应;1例免疫性腮腺炎,1例干燥综合征,均对症处理后得以缓解。结果 经过精心治疗与护理,6例均完成治疗,不良反应得到及时解决。随访至2021年8月,2例患者病情基本得到控制,无明显进展;3例患者接受微波消融治疗;1例患者去世。结论 双抗靶向CIK细胞序贯PD-1抗体治疗晚期肝癌患者的护理中,做好患者及家属的心理护理是前提,做好用药的安全护理及不良反应护理是关键和重点,治疗期间做好患者病情的追踪和记录是持续治疗的支持。     

树突状细胞与细胞因子诱导杀伤细胞共培养体外抗肾癌的效应

细胞因子诱导杀伤细胞（CIK）为非特异性杀伤免疫效应细胞，杀伤活性有待提高。树突状细胞（DC）是目前发现的功能最强的专职抗原提呈细胞（APC），可诱发抗原特异性免疫应答。本研究旨在探讨肾癌（RCC）肿瘤冻融抗原致敏的DC与CIK共培养后能否提高DC-CIK细胞对RCC的特异性杀伤活性。     

K-ras突变多肽负载的DC细胞增强CIK细胞对胰腺癌细胞的杀伤作用

目的：观察经K-ras（12-Val）突变多肽负载的树突状细胞（DC）与细胞因子诱导的杀伤细胞（CIK）共培养以后对胰腺癌PANC-1细胞的杀伤作用。 方法：取健康人外周血体外诱导分别扩增出DC和CIK;用K-ras突变体抗原表位肽负载DC（K-ras-DC）,将单纯DC或K-ras-DC与CIK共培养,获得DC-CIK或K-ras-DC-CIK。比较CIK与K-ras-DC-CIK的增殖活性;分别分析DC与K-ras-DC以及CIK与K-ras-DC-CIK的免疫表型差异;检测CIK、DC-CIK、K-ras-DC-CIK上清液中IFN-γ、IL-12的水平;检测K-ras-DC-CIK、DC-CIK、CIK对PANC-1细胞的体外杀伤力。 结果：K-ras-DC-CIK的增殖能力明显强于单纯CIK（P<0.05）;K-ras-DC的成熟表面分子CD1a、CD80、CD83、HLA-DR的表达明显高于单纯DC,而K-ras-DC-CIK细胞群的CD3+CD8+、CD3+CD56+表达率明显高于单纯CIK细胞群（均P<0.05）;上清液中IFN-γ、IL-12的水平以及对PANC-1细胞的杀伤力由高到低均依次为K-ras-DC-CIK、DC-CIK、单纯CIK（均P<0.05）。 结论：K-ras突变多肽负载后能促进DC的成熟,负载K-ras突变多肽后的DC能增加CIK的增殖及对胰腺癌细胞的杀伤作用。     

联合激动Toll样受体的树突细胞对小鼠结肠癌生长的影响

目的 观察联合激动Toll样受体(TLRs)的树突细胞对小鼠结肠癌的杀伤作用以及荷瘤小鼠的生存时间.方法 用转染人癌胚抗原(CEA)的MC38小鼠结肠癌细胞株(MC38-CEA)和MC38细胞株(1×106个/只)皮下注射人CEA转基因小鼠,7d后将不同的树突状细胞(DC)疫苗(1×106个/只)于对侧皮下注射小鼠,每周2次测量各组小鼠肿瘤的垂直直径,并记录小鼠的生存时间,绘制各组肿瘤生长曲线和小鼠生存曲线.结果 在预防性疫苗干预的MC38-CEA肿瘤模型中,第41天联合TLR且荷载CEA肽段的DC(TLR-DC+ CEA)组小鼠肿瘤平均体积(1091.20±226.12) mm3明显小于其余各组(P＜0.01),并且存活期明显优于其余各组(P＜0.01);在治疗性疫苗干预时,第41天TLR-DC+ CEA组小鼠肿瘤平均体积(6487.20±1024.47) mm3,小于磷酸盐缓冲液(PBS)对照组(9361.20±2654.64) mm3(P＜0.05),而与其余对照组差异无统计学意义(P＞0.05);在小鼠MC38肿瘤模型中,各组肿瘤平均体积差异无统计学意义(P＞0.05),且各组小鼠存活期差异无统计学意义(P＞0.05).结论 联合激动TLR的DC疫苗能抑制表达CEA的小鼠结肠癌生长并延长小鼠生存期.     

微创治疗联合自体CIK细胞输注对肝癌的疗效及安全性研究

【摘要】 目的 观察经导管肝动脉化疗栓塞+射频消融(TACE+RAF)微创治疗联合CIK细胞对肝癌的疗效及毒副反应。方法 根据纳入标准,共收集41例,随机分为2组,治疗组(TACE/RAF+CIK)20例,对照组(TACE/RAF)21例。评价两组的副反应、AFP的变化和生存率的差异。结果 应用CIK治疗未发现明显不良反应;CIK治疗后,在9个月内,患者AFP水平较对照组低,9个月后无统计学差异;无瘤生存率及1年生存率,治疗组优于对照组,3年生存率无明显差异。结论 CIK细胞治疗副作用小,可提高患者1年生存率,降低肿瘤的复发和转移。     

人源抗肝癌单链抗体的构建及鉴定

目的构建人源抗肝癌单链抗体。方法从肝癌患者外周血中分离淋巴细胞,利用噬菌体展示技术,构建人源抗肝癌噬菌体抗体库并筛选人源抗肝癌单链抗体,用ELISA方法检验该抗体与抗原结合活性。结果成功构建了库容为4.0×106的人源抗肝癌单链抗体库,初步筛选到与肝癌细胞特异性结合的单链抗体。结论成功构建人源抗肝癌单链抗体,为进一步临床应用奠定基础。     

树突状细胞疫苗联合胸腺肽α1对人源化免疫重建裸鼠结肠癌生长的抑制效应

目的观察胸腺肽αl（Ted）联合结肠癌细胞裂解物致敏树突状细胞（LyDCs）对人源化免疫重建裸鼠结肠癌的免疫治疗效应。方法常规DCs负载结肠癌细胞裂解物制备LyDCs疫苗，流式细胞仪（FCM）检测Tαl体外刺激前、后的LyDCs表型。HT-29结肠癌裸鼠模型成瘤后，经尾静脉注射人外周血T淋巴细胞6×10^6个／只，2d后，FCM检测裸鼠外周血人源性CD4^＋、CD8^＋T细胞；将人源化免疫重建裸鼠分为3组，分别用LyDCs＋Tctl、LyDCs和生理盐水皮下免疫注射治疗；治疗后7d，体外观察各组裸鼠脾脏淋巴细胞的肿瘤杀伤作用及IFN-γ、IL4分泌水平，实验结束时，观察LyDCs联合Tctl对荷瘤裸鼠的体内抑瘤作用。结果LyDCs的表型HLA．DR、CD80、CD86、CD83较刺激前明显上调；免疫重建裸鼠均检测到人源性CD4^＋、CD8^＋T细胞；LyDCs＋Tctl组裸鼠脾脏T淋巴细胞的肿瘤杀伤作用与LyDCs组比较差异有统计学意义（P〈0．01），LyDCs＋Ted组T细胞的IFN-γ分泌水平与LyDCs组比较差异有统计学意义（P〈0．01）；接种HT-29细胞58d后，LyDCs＋Tαl组、LyDCs组抑瘤率分别为60．41％、37．20％，两组之间抑瘤效应比较差异有统计学意义（P〈0．01），两组的抑瘤效应与对照组比较分别（P〈0．01）。结论Tαl能增强LyDCs诱导的CD4^＋，Th1细胞反应和CTLs杀伤效应，对DCs疫苗的抗癌免疫治疗功效具有明显的放大作用。     

The induction of cytotoxicity by a bispecific antibody against CEA positive cell line,in vitro

A mouse anti-human carcinoembryonic antigen (CEA) × anti-human CD3 bispecific antibody, AB5C10*UCHT1, was developed. This antibody-heteroconjugate was chemically prepared by cross-linking the AB5C10 monoclonal antibody reactive with human CEA with the monoclonal antibody, UCHT1, which binds to CD3 on human T-lymphocytes. The AB5C10*UCHT1 recognized both CEA expressed on the KATOIII cell line and CD3 expressed on T-lymphocytes, as determined using flowcytometry. Next, AB5C10*UCHT1-mediated cytolysis was analyzed by ⁵¹Cr-release assay. When ⁵¹Cr-labeled target KATOIII cells were incubated for 6 h with effector cells that had been pretreated with AB5C10*UCHT1 for 60 min at 4°C, the percentage specific lysis was significantly increased compared to that of untreated effector cells. Using peripheral blood mononuclear cells (PBMC) and lymphokine-activated killer (LAK) cells pretreated with AB5C10*UCHT1 for effector cells, the percentage specific lysis was determined to be 16.3% and 57.4% at effector:target (E:T) ratios of 100:1 and 12.5:1, respectively. On the other hand, the percentage specific lysis of untreated PBMC and LAK cells determined to be 3.0% and 35.8% at E:T ratios of 100:1 and 12.5:1, respectively. The minimum effective dose of AB5C10*UCHT1 required for antibody-mediated cytotoxicity was 0.1 g/ml. The results of this study suggest that AB5C10*UCHT1 could be useful for augmenting the cytotoxicity of CD3-positive T-cells against CEA-positive target cells in vitro.     

FasL、抗DR5单克隆抗体对结肠癌细胞株HT29的杀伤作用及其机制

目的 探讨FasL、抗DR5单克隆抗体(Anti-DR5 mAb)对结肠癌细胞株HT29的杀伤作用及机制.方法 采用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)、噻唑蓝(MTT)比色法、DNA倍体分析,Western blot等.结果 HT29细胞表面Fas mRNA的表达低于DIL5 mRNA的表达.50 mg/L FasL和Anti-DR5 mAb对HT29细胞的杀伤率分别为(25.49±0.90)%和(48.90±3.15)%,这种作用呈剂量依赖性.流式细胞术分析细胞周期和凋亡实验表明FasL和Anti-DR5 mAb能够抑制HT29细胞的生长,并且诱导它的凋亡.25 mg/L FasL和Anti-DR5 mAb对HT29细胞的凋亡指数分别为(13.8±1.5)%和(22.6±1.1)%.FasL和Anti-DR5 mAb作用HT29细胞后,Caspase-3蛋白表达上升,bcl-2蛋白表达水平下降.结论 FasL、Anti-DR5 mAb能不同程度的诱导结肠癌细胞株HT29凋亡,其机制与其受体和Caspase-3、bcl-2的表达有关.     

共刺激人外周血淋巴细胞对大肠癌细胞的杀伤作用

目的探讨CD28单克隆抗体与CD80共刺激活化的人外周血淋巴细胞(PBLs)在体外对大肠癌细胞株HT-29杀伤强度及杀伤作用机制,为大肠癌的过继免疫治疗提供参考。方法获得PBLs；共刺激；检测活化细胞的体外淋巴细胞毒作用,并用电子显微镜观察效应细胞杀伤的大肠癌细胞超微结构,用流式细胞仪检测大肠癌细胞的凋亡指数。结果共刺激PBLs对肿瘤细胞杀伤作用较强,达到(69．35±1．17)%。电镜结果显示,效应细胞作用12h肿瘤细胞出现坏死,部分可见凋亡。流式细胞仪检测效应细胞凋亡指数为24 h 19．6%,48 h效应细胞凋亡指数为12．1%。结论活化的淋巴细胞杀伤大肠癌细胞是通过坏死及凋亡两条途径来实现的。     

趋化因子RANTES快速募集DCs及DCs疫苗的抗结肠癌作用

目的 观察RANTES促进小鼠外周血Des前体细胞动员及DCs疫苗对结肠癌细胞的体外杀伤作用.方法 C57BL/6J(B6)小鼠静脉注射RANTES,不同时间间隔(0、4、8、16、24、48、72 h)采集外周血分离单个核细胞(PBMNCs),通过流式细胞仪分选出F4/80-B220-CD11c+细胞并其进行检测.反复冻融法制备结肠癌可溶性抗原,将其与RANTES动员的DCs共同培养,制备成DCs疫苗以激活T细胞,MTT法检测活化的T细胞在体外对结肠癌细胞的杀伤作用.γ干扰素(IFNγ)酶联免疫吸附试验(ELISA)试剂盒检测IFNγ的分泌情况.结果 B6小鼠外周血中F4/80-B220-CD11c+细胞数量随着注射时间的延长逐渐增多,大约在24 h达到高峰,占PBMNCs(13.45±1.25)%.新鲜分离的F4/80-B220-CD11c+细胞为DCs前体细胞.负载结肠癌抗原的DCs激活的T细胞表现出对结肠癌细胞的特异性杀伤作用,产生高水平的IFNγ(1595.00±38.03)ng/L,而对B16黑色素瘤细胞没有杀伤作用,不产生高水平的IFNγ(175.44±6.55)ng/L.结论 RANTES动员的DCs在体外可以诱导出针对结肠癌细胞的特异性杀伤作用.     

抗人膀胱癌/抗VEGF双功能基因抗体对膀胱癌生物学行为的影响

目的:探讨抗人膀胱癌/抗VEGF双功能基因抗体对人膀胱癌生长及转移的影响。方法:通过构建人膀胱癌裸鼠皮下移植瘤模型并注射双功能抗体,观察肿瘤生长及盆腔淋巴结转移情况,同时采用免疫组化法检测肿瘤微血管密度值及凋亡的肿瘤细胞指数。结果:肿瘤大小:双抗组为(19.50±4.51)mm2,对照组为(57.62±8.31)mm2,两组比较P<0.01;肿瘤微血管密度双抗组为(2351±207)个,对照组(4356±548)个,两组相比P<0.05;凋亡指数双抗组为19.25,对照组为9.31,两者比较P<0.05;双抗组无一只发生盆腔转移,而对照组为75.0%,两组比较P<0.05。以上各项组间差异均有统计学意义。结论:抗人膀胱癌/抗VEGF双功能基因抗体对人膀胱癌具有良好的靶向性,能够通过抑制肿瘤微血管形成和加速肿瘤细胞凋亡,遏制实验性人膀胱癌的生长转移,为该抗体用于临床膀胱癌的治疗提供了一定的实验基础。     

脐血源性CIK细胞的体外增殖及其对人胆囊癌细胞株GBC-SD杀伤活性的实验研究

目的探讨脐血CIK细胞的体外增殖活性及其对人胆囊癌细胞株GBC-SD的杀伤作用。方法通过在脐血单个核细胞中加入IFN-γ、IL-2和CD3单克隆抗体进行细胞培养,获得多种细胞因子诱导的杀伤细胞(cytokine inducde killer cells)即脐血CIK细胞。用流式细胞仪对细胞作动态表型分析,用MTT法测定其抗肿瘤活性,并与CD3AK作对比分析。结果脐血CIK细胞在培养2周左右获得大量增殖,CD3~-、CD56~ 双阳性细胞大量增殖达1000倍以上;CIK细胞及其培养上清抗人胆囊癌细胞株GBC-SD活性明显优于CD3AK细胞,其抑瘤率为85%与62.8%(P<0.05),早期培养过程中加入G-CSF可以显著提高CIK细胞的增殖活性。结论脐血CIK细胞是一种新型、高效的免疫杀伤活性细胞,其对人胆囊癌细胞株GBC-SD具有明显的细胞毒作用,研究脐血CIK细胞对胆囊癌的过继性免疫治疗具有重要的临床意义。