鸡传染性支气管炎病毒变异株(793/B)M基因的克隆与序列分析

根据GenBank已发表的传染性支气管炎病毒(IBV)全基因组序列设计引物,对793/B型IBV分离毒株TA03M基因进行克隆与序列分析.结果表明,793/B型IBV的M基因由669 bp组成,与GenBank已发表的15株IBV的M基因相比较,793/B型IBV的M基因在第4～15位发生了3～12个核苷酸的缺失,对应1～4个氨基酸的缺失,共有30多处点突变.与其他各毒株M基因的核苷酸同源性为84.2%～93.6%,氨基酸同源性为82.1%～96.0%;进化分析显示TA03株与H52和IBN毒株之间的亲缘关系较近.该研究为进一步探讨793/B型IBV M基因(蛋白)在遗传变异和免疫等方面的作用奠定了理论基础.     

鸡传染性支气管炎病毒变异株ZZ2004 RT-PCR检测方法的建立及应用

根据GenBank已发表的鸡传染性支气管炎病毒(Infectious bronchitis virus,IBV) ZZ2004 3a、3b及E基因序列,设计1对引物,扩增540 bp特异性核酸片段,建立了检测IBV ZZ2004的RT-PCR方法.特异性试验结果表明,IBV ZZ2004能扩增出540 bp的核酸片段,而IBV M41、H120、H52毒株以及新城疫病毒(NDV)、禽流感病毒(AIV)、传染性腔上囊病病毒(IBDV)均无特异性条带出现.敏感性试验结果表明,该方法的最低检出量为1.525 pg的模板.上述结果表明,本试验所建立的RT-PCR方法敏感性高、特异性强.利用建立的RT-PCR方法对从河南省分离的6株疑似鸡IBVZZ2004进行检测,结果5株为阳性.该方法的建立为IBV ZZ2004的诊断及流行病学调查提供了可靠的方法.     

鸡传染性支气管炎病毒RT-PCR检测方法的初步建立

鸡传染性支气管炎(Avian Infectious Bronchitis,IB)是由鸡传染性支气管炎病毒(Infectious Bronchi-tis Virus,IBV)引起的一种急性、高度接触传染性呼吸道疾病。该病给养禽业造成了巨大的经济损失,使感染的肉鸡被淘汰,产蛋鸡产量下降。该病在流行病学、临床症状、病理变化等方面与新城疫等禽病存在着一些相似的地方,有时会给临床诊断带来了一定的困难。目前使用传统方法(如病原分离及血清学方法)进行实验室诊断不仅耗时     

检测鸡新城疫病毒和鸡传染性支气管炎病毒双重RT-PCR的建立与初步应用

为了快速检测临床样品中新城疫病毒(NDV)和鸡传染性支气管炎病毒(IBV)的混合感染,根据NDV的F基因和IBV的N基因保守序列分别设计了2对特异性引物,优化双重RT-PCR反应条件,建立了可同时检测NDV和IBV的快速双重反转录PCR(RT-PCR)诊断方法。敏感性试验表明,此方法对NDV和IBV的RNA最小检出量分别为0.014 3和0.013 6ng;NDV的扩增片段大小为459bp,IBV的扩增片段为282bp。对其他病毒如IBDV、AIV和EDSV的检测结果均为阴性,表明此方法具有较好的特异性。对58份临床疑似样品进行检测,NDV和IBV的阳性率分别为44.82%和31.03%,NDV和IBV混合感染率为20.68%,表明本研究建立的NDV与IBV双重RT-PCR检测方法,可用于临床发病病料中NDV和IBV混合感染的快速鉴别诊断。     

核酸探针检测鸡传染性支气管炎病毒方法的建立及应用

以地高辛(DIG)标记鸡传染性支气管炎病毒(IBV)pol基因的保守片段制成核酸探针,与IBV参考株、新城疫病毒、传染性法氏囊病病毒、禽流感病毒、正常鸡胚尿囊液及正常鸡肾组织等的RT-PCR产物进行斑点杂交,以检测探针的特异性,结果该探针仅与IBV毒株的RT-PCR产物杂交呈阳性,与对照病毒和组织的RT-PCR产物杂交呈阴性.敏感性试验显示,探针最低能检出约3.4pg的IBV RT-PCR产物.用该方法检测了38份疑似IBV临床病料,31份阳性;而用RT-PCR法扩增IBV S2基因确诊为阳性的只有29份.对人工接种IBV H52弱毒苗鸡咽喉和肛门拭子32份进行检测,检出15份阳性.结果表明,利用DIG探针检测IBV的RT-PCR产物,特异性和敏感性强,可重复,能克服RT-PCR非特异性反应和探针Northern杂交的不稳定性.     

荧光定量RT-PCR检测鸡传染性支气管炎病毒方法的建立及应用

为了建立一种快速的新城疫病毒(NDV)病原检测方法,试验针对鸡传染性支气管炎病毒(IBV)基因序列保守区域设计1对特异性引物和1条特异性探针,通过构建重组阳性标准质粒的方法建立了检测IBV核酸的荧光定量PCR方法,优化反应体系和反应条件后进行特异性、敏感性、重复性试验。结果表明:该检测方法特异性强,与其他禽源病毒如NDV、传染性喉气管炎病毒(ILTV)、传染性法氏囊病毒(IBDV)、禽流感病毒(AIV)、马立克病毒(MDV)均不发生交叉反应;该方法可检测到3.1×101拷贝/μL的病毒核酸,比常规RT-PCR的敏感性高100倍;重复性试验的变异系数小于2%。说明研究建立的Real-time RT-PCR检测方法特异性强、灵敏度高、重复性好,可用于IBV的定量检测。     

鸡传染性支气管炎病毒的快速检测

本试验建立了一种快速检测鸡传染性支气管炎病毒的通用性PCR方法。通过对纯化后IBV核蛋白基因进行的直接PCR及套式PCR扩增表明，两次PCR产物的大小为0.7kb和0.5kb，与实际设计相符。而对照的NDV主IBDV的PCR扩增产物均为阴性。用IBV HB（华北）株感染SPF鸡后，应用我们所建立的PCR方法去检测不同时期所采集的肾脏、气管、盲肠扁桃体、肺脏和肝脏中的IBV，在SPF鸡感染IBV后的21天仍然能够检测到IBV的基因组，Southern blot杂交试验证明了我们获得的PCR产物为IBV的核蛋白基因。对30份自然感染病料的检测表明，本实验所建立的PCR方法检测阳性数为15份，阳性率为50％（15／30）；鸡胚接种检测的阳性数为17份，阳性率为56．7％（17／30）；IFA检测的阳性数11 ，阳性率为36．7％（11／30）。PVR检测法与鸡胚接种方法的阳性符合率为93．3％（14／15），统计学分析表明，P＞0．05，差异不显著，而PCR检测法与IFA的阳性符合率为60％（9／15）。结果证明本实验所建立的PCR检测方法具有敏感、特异、快速等特点，适用于不同来源及不同血清型IBV的检测。     

应用病毒计数仪定量检测鸡传染性支气管炎抗原方法的建立

鸡传染性支气管炎(Infectious bronchitis,IB)是危害养鸡业的主要疫病之一,疫苗质量的提升对于该疫病的防控有着至关重要的意义。目前国内对IB疫苗的生产质量控制主要有鸡胚半数感染量(EID_(50))和动物试验,操作复杂、耗时长、试验受干扰因素多。本研究采用病毒计数仪对IB病毒粒子进行定量检测,同时与EID_(50)检测结果进行对比,本研究方法检测时间只需10min,有耗时短、准确性较高、受干扰因素少的特点,对IB疫苗的生产质量控制提供了较好的方法。     

鸡传染性支气管炎病毒实时荧光RT-PCR检测方法的建立与初步应用

为建立一种快速准确检测鸡传染性支气管炎病毒的方法,根据鸡传染性支气管炎病毒的核衣壳蛋白基因进行引物和探针设计,建立了一种能够检测鸡传染性支气管炎病毒的实时荧光RT-PCR方法,并对该方法进行特异性和灵敏度检测,同时与国家标准检测方法进行对比。结果显示,本检测方法特异性好,不与其他相关病毒发生交叉反应,灵敏度可达到10-4 ng/μL,与国标检测方法的符合率达100%。结果表明,本研究建立的检测方法可以准确鉴定鸡传染性支气管炎病毒,具有良好的应用前景。     

RT-LAMP检测鸡传染性支气管炎病毒方法的建立及应用

以鸡传染性支气管炎病毒(Infectious Bronchitis Virus,IBV)的N基因保守区域设计4条引物,通过优化反应条件,建立了检测IBV的逆转录环介导等温扩增技术(RT-LAMP),并进行了特异性试验、敏感性试验及临床样本检测。结果显示,建立的RT-LAMP方法对IBV参考株扩增产物的电泳呈特征性梯状条带,而新城疫病毒(NDV)、禽流感病毒(AIV)、马立克病病毒(MDV)、传染性囊病病毒(IBDV)等的扩增产物电泳后均无扩增条带。该方法最低能检出0.19 pg的IBV cDNA模板,敏感性比常规RT-PCR方法高1 000倍。用该方法检测了6份临床疑似IB临床病料,检出率为100%(6/6),与常规RT-PCR的符合率为100%。60 min反应结束后,离心可以看到白色沉淀物,简单直观,适用于基层实验室快速准确诊断。     

传染性支气管炎病毒RT-PCR方法的建立

传染性支气管炎病毒 (IBV)的主要结构蛋白有 3种 ,纤突蛋白 S、膜蛋白 M和核蛋白 N。S蛋白由 S1和 S2 2部分组成 ,其中 S1蛋白的进化最为活跃 ,是 IBV具有众多血清型的基础。 S1蛋白的活泼表现源于 S1基因容易发生插入、缺失和不同毒株基因间重组。因此 ,围绕着 S1基因的研究工作就成为 IBV研究的热点 [1～ 3 ]。研究 IBV基因组结构的基本手段之一是建立有效的反转录聚合酶链反应 (RT- PCR)以扩增出所需要的基因片段 ,由于 IBV基因组结构比较特殊 (核酸片段较大 ,碱基分配不均匀 ,G C含量较低 ) ,其 RT-PCR方法的建立十分困…     

应用RT-PCR技术诊断鸡传染性支气管炎

根据已发表的IBV4／91 attenuated株S1基因序列，设计并合成了产物约600bp的IBV特异性PCR引物对。从可疑病鸡气管、肺脏或肾脏组织中提取总RNA，用AMV反转录酶反转录后，再进行PCR扩增。用琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物大小。采用NDV和IBDV病料组织作阴性对照，IBV标准株M41作阳性对照。该法检测特异性强、成本低、检出率高，可有效用于鸡传染性支气管炎的早期检测和流行病学研究。     

口蹄疫病毒RT-PCR检测和分型方法的建立及初步应用

参考GenBank中各个血清型口蹄疫病毒3D、vp1、2A基因的标准序列，设计引物P1／P2和S1／S2。建立用于检测口蹄疫病毒及其利用引物S1／S2克隆片段同源性比较而确定血清型的RT-PCR方法。通过敏感性试验检测，2对引物均可以检测到10TCID50的病毒量；特异性试验的检测，2对引物对正常细胞、牛黏膜病病毒、猪瘟病毒、水疱性口炎病毒、牛传染性鼻气管炎病毒的检测结果均为阴性。利用该方法对病牛的流涎液体、水疱液体、舌皮组织、感染犊牛心脏等组织进行检测初步结果显示：该方法可以对O型和AsiaⅠ型口蹄疫病毒进行特异性检测，能够用于口蹄疫急性及亚临床感染的诊断及流行病学调查。     

新城疫病毒荧光RT-PCR检测方法的建立及应用

经对部分发表在NCBI里的新城疫病毒序列进行比对,在其F基因上找到1段相对保守序列,根据保守序列设计1对引物和1条TaqMan探针,以新城疫Ⅰ系疫苗株(Mukteswar株)作为标准品,通过系列条件优化、特异性、灵敏性和重复性试验,建立了一种灵敏度高、特异性强和重复性好的荧光RT-PCR检测新城疫病毒的方法.该方法能检测最低初始病毒浓度为102.2 ELD50/mL,且在108.2～102.2 ELD50/mL内Ct值与病毒浓度的对数值(lgELD50/mi)呈很好的线性关系,R2达到0.997 5;该方法对禽流感、禽痘病毒和禽大肠杆菌等禽病病原核酸无交叉反应;批间和批内重复性良好;临床样品检测中荧光RT-PCR与鸡胚分毒的符合率、诊断灵敏度和诊断特异性分别为98.5％,50.0％和98.4％.因此,荧光RT-PCR检测方法的建立为新城疫病毒检测提供了一种快速有效的方法,为新城疫病毒的研究奠定了一定的基础.     

牛病毒性腹泻病毒套式RT-PCR检测方法的建立及初步应用

根据GenBank公布的牛病毒性腹泻病毒(BVDV)全基因组序列,选择保守性比较高的5'非编码区,利用Oli-go6.0软件设计了2对特异性引物,建立了检测BVDV的套式RT-PCR方法。结果表明,该方法重复性好、特异性强、敏感性高,可以准确快速检测出极低含量的BVDV,极大地提高了常规RT-PCR检测方法的特异性和敏感性。临床初步应用表明,该方法可用于动物与疫苗生物制品原辅料BVDV的快速低含量检测。