膀胱尿路上皮癌组织中CDC25B、14-3-3σ蛋白的表达变化及意义

目的观察膀胱尿路上皮癌（下称膀胱癌）组织中CDC25B、14-3-3σ蛋白的表达变化,并探讨其意义。方法采用Western blot法检测90例膀胱癌（观察组）及20例正常膀胱黏膜（对照组）中的CDC25B、14-3-3σ蛋白。结果观察组CDC25B蛋白阳性率为54.4%、14-3-3σ蛋白阳性率为72.2%,对照组分别为30.0%、100.0%,两组比较,P均〈0.05。CDC25B、14-3-3σ蛋白表达与膀胱癌临床分期、病理分级有关（P均〈0.05）,CDC25B与14-3-3σ蛋白表达呈明显负相关（rs=-0.627,P〈0.05）。结论膀胱癌组织中CDC25B蛋白高表达、14-3-3σ蛋白低表达,二者在膀胱癌的发生发展中起重要作用。     

人参皂苷Rg3对乳腺癌细胞增殖的影响及其机制探讨

目的观察人参皂苷Rg3对乳腺癌细胞MDA-MB-231增殖的影响,并探讨其机制。方法取处于对数生长期的MDA-MB-231,加入不同终浓度（50、100、200、400、600μmol/L）人参皂苷Rg3,以不加人参皂苷Rg3为对照。MTT法检测细胞生长情况;Western blot法检测细胞中细胞周期蛋白E（Cyclin E）及细胞分裂周期蛋白25A（CDC25A）表达水平。结果低浓度（≤200μmol/L）的人参皂苷Rg3可促进MDA-MB-231增殖,高浓度（≥400μmol/L）的人参皂苷Rg3则抑制其增殖。与对照细胞比较,低浓度人参皂苷Rg3处理的细胞中Cyclin E及CDC25A的表达增高,高浓度处理者Cyclin E及CDC25A的表达下降（P均〈0.01）。结论高浓度人参皂苷Rg3在体外对乳腺癌细胞的生长具有抑制作用,其机制可能与抑制细胞周期关键蛋白Cyclin E及CDC25A的表达有关。     

日本血吸虫tetraspanins胞外环2编码基因的克隆和表达

目的克隆和表达日本血吸虫（中国大陆株）tetraspanins胞外环2（EC-2）编码基因（Sj-tsp-2）。方法在日本血吸虫基因组中筛选获得与曼氏血吸虫tetraspanins基因胞外环2结构域序列同源的片段，经过一定修饰，采用全基因合成方式获得目的基因片段，构建重组质粒pET-32a-Sj-tsp-2，并转化至BL21（DE3）感受态细胞。经IPTG诱导表达，在非变性条件下亲和纯化融合蛋白。结果通过核苷酸测序证实重组表达质粒构建成功。SDS-PAGE结果表明，融合蛋白和目的肽段与预计太小基本一致。Western blotting结果说明，该融合蛋白具有良好的免疫原性。结论本实验成功表达了日本血吸虫Sj-tsp-2基因，并纯化获得其融合蛋白，为进行动物保护性实验奠定了基础。     

B、C基因型乙型肝炎病毒X蛋白在果蝇细胞中的表达与纯化

目的获得高纯度B、C基因型乙型肝炎病毒X蛋白（HBx蛋白）。方法PCR扩增获得B、C基因型乙型肝炎病毒X基因,以AgeⅠ及BglⅡ位点将其克隆入果蝇表达载体pMT/BiP/V5/HisC。重组载体与筛选质粒pCoBlast以脂质体Cellfectine共转染果蝇S2细胞,25μg/ml Blasticidin筛选多克隆抗性细胞株。扩增细胞以CuSO4诱导HBx蛋白表达,Western blot鉴定表达产物并确定最佳蛋白表达时间和诱导浓度。200 ml大规模培养细胞并诱导表达,一步法及两步法分别纯化B、C基因型HBx蛋白。结果成功构建重组表达载体pMT/BiP-HBxb（含B基因型HBx基因）和pMT/BiP-HBxc（含C基因型HBx基因）。在果蝇S2细胞中,B、C基因型HBx蛋白与6×His融合表达（分别为HBxb-His及HBxc-His）,在CuSO4诱导后72 h以及诱导浓度为500μmol/L~1 mmol/L时蛋白表达量最高。在200 ml培养液中,一步法纯化所得HBxb-His及HBxc-His蛋白总量分别为1.52和1.37 mg,纯度为85.23%和84.59%;二步法所得的HBxb-His及HBxc-His蛋白总量分别为5.38和6.42 mg,纯度分别为95.36%和94.62%。结论在果蝇表达系统中表达并获得高纯度B、C基因型乙型肝炎病毒X蛋白,为进一步探讨结构和功能的关系奠定了基础。     

藤黄微球菌复苏促进因子结构域及其突变体基因的克隆和表达及生物活性的测定

目的 克隆、表达藤黄微球菌复苏促进因子(Rpf)结构域及其突变体基因,评价其生物学活性.方法 采用PCR方法从藤黄微球菌基因组中扩增出Rpf结构域及其突变体基因E54A、E54K,用限制性内切酶消化后克隆入pMD-18T载体中,将测序正确的基因插入到pGEx-4T-1表达载体中,转化大肠杆菌DH5α,经异丙基-B-D硫代半乳糖(IPTG)诱导,十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)鉴定表达蛋白,利用Rpf结构域单克隆抗体进行Western blot分析.用GS-4B亲和层析柱纯化蛋白,将纯化的蛋白加人到休眠的耻垢分枝杆菌中测定各自的生物活性.结果 获得藤黄微球菌Rpf结构域及其E54K和E54A突变体基因,测序结果 与美国基因序列数据库GenBank公布的序列完全相同,突变位点与设定一致;表达蛋白相对分子质量与文献报道一致;Western blot结果 显示,在相对分子质量约32 000处有与Rpf结构域单克隆抗体特异性结合带.通过GS-4B系统,得到纯化的GST融合蛋白,并证实Rpf结构域蛋白对休眠的耻垢分枝杆菌有一定的复苏和促生长作用,突变体E54K对耻垢分枝杆菌的生长有抑制作用.结论 获得Rpf结构域及其2种突变体蛋白,明确其对耻垢休眠菌有复苏的作用.     

恶性疟原虫动合子表面蛋白单链抗体与按蚊Cecropin A融合基因的构建、原核表达及生物活性的初步评价

目的 构建、原核表达恶性疟原虫动合子表面蛋白单链抗体与按蚊Cecropin A融合基因并对其表达产物的生物学活性进行评价。方法 根据按蚊对编码同种氨基酸不同密码子的偏嗜性,对鼠源性恶性疟原虫动合子表面蛋白单链抗体4B7编码基因进行改造,并与按蚊抗菌肽Cecropin A基因融合;将融合基因Cep＆m4B7克隆入原核表达载体pET32a（＋）并在大肠埃希菌中进行表达;对表达产物进行SDS-PAGE和Western blot分析,体外抑菌试验鉴定表达蛋白的抑菌活性。结果 构建了融合基因Cep＆m4B7和重组表达质粒pET32a（＋）-Cep＆m4B7,融合基因在大肠埃希菌中以包涵体形式高效表达融合蛋白,Western blot显示重组蛋白能被抗6-His抗体识别;琼脂糖扩散法显示纯化后的目的蛋白无抑菌活性。结论 成功构建了融合基因Cep＆m4B7,该基因在大肠埃希菌中高效表达,表达产物纯化后无体外抑菌活性。     

弓形虫MIC 6羧基端蛋白片段的表达及其多克隆抗体的制备

目的克隆表达刚地弓形虫微线体蛋白6羧基端蛋白片段(Tg MIC6C),制备多克隆抗体。方法PCR扩增目的基因片段,克隆到pGEX-4T-1载体上,构建MIC6C/pGEX-4T-1原核表达系统;IPTG诱导表达GST-MIC6C融合蛋白,亲和层析融合蛋白;用纯化的融合蛋白混合免疫佐剂免疫新西兰大白兔,制备多克隆抗体,纯化并分析抗体的特异性。结果构建了MIC6C/pGEX-4T-1原核表达系统并获得纯化的GST-MIC6C融合蛋白;获得了抗目的蛋白的多克隆抗体,抗体能特异地识别目的蛋白,抗体效价为1∶8 000。结论在体外获得了纯化的GST-MIC6C融合蛋白及其多克隆抗体,为后续GSTpull-down筛选与MIC6相互作用的蛋白奠定了基础。     

Daxx与雄激素受体结合的功能片段筛选

目的体外筛选出能与雄激素受体具有相互作用的Daxx结构域。方法应用聚合酶链反应扩增Daxx四个不同功能结构域,分别连接到带有GST标记的原核表达质粒pGEX-6p-1中,构建Daxx四个功能结构域的原核表达载体。经测序鉴定转化E Coli.BL21DE3菌株,经氨苄青霉素筛选并扩增阳性克隆,用IPTG诱导蛋白表达后纯化蛋白,采用GST pu ll-down体外筛选出与雄激素受体具有相互作用的Daxx功能结构域。结果 Daxx不同功能结构域的四个原核表达载体pGEX-6p-1/Daxx/DM1-240、pGEX-6p-1/Daxx/DM241-501、pGEX-6p-1/Daxx/DM502-625和pGEX-6p-1/Daxx/DM626-740经琼脂糖凝胶电泳和DNA测序分析,证实插入质粒的片段大小正确,无读码框移位和突变。IPTG诱导后蛋白表达具有明显差异性,表达蛋白与预期表达蛋白质分子量大小相当。纯化蛋白进行GST pu ll-down实验结果显示Daxx与雄激素受体具有相互作用。结论 Daxx通过第626-740位氨基酸序列与雄激素受体相互结合。     

人Angiopoietin-2剪接体Ang2443的快速克隆及高效表达

目的构建Angiopoietin-2剪接体Ang2443全长及功能结构域（CC区和FL区）的原核和真核表达质粒，并在大肠杆菌内获得高产量表达。方法利用RT—PCR方法从人脐静脉内皮细胞中扩增获得Ang2443功能结构域CC区和FL区，以剪接扩增PCR克隆全长片段，亚克隆至pET-32b（-）载体，IPTG诱导获得融合蛋白表达。凝血酶酶切后经柱层析纯化获得完全蛋白。结果在所培养的人脐静脉内皮细胞中，Ang244，是唯一表达的剪接体。以此构建了pET—CC、pET—FL和pET—Ang2三个原核和真核表达载体，并在大肠杆菌内获得高产量表达。1mM IVPG诱导表达后蛋白产量60％。凝血酶酶切完全，经柱层析纯化后获得完全蛋白。结论成功克隆并表达了在所培养的人脐静脉内皮细胞中唯一表达的Angiopoietin-2剪接体Ang2443全长及功能结构域蛋白。     

胃癌组织中Cyclin E、p57与CDC25A的表达及意义

采用免疫组化SP法检测30例进展期胃癌组织、癌旁组织和10例正常胃组织中Cyclin E、p57与双重特异性磷酸酶A（CDC25A）的表达。结果在胃癌组织、癌旁组织和正常胃组织标本中p57的阳性表达率分别为40%（12/30）、73.3%（22/30）、90.0%（9/10）;Cyclin E的阳性表达率分别为70%（21/30）、36.7%（11/30）、10.0%（1/10）;CDC25A的阳性表达率分别为73.3%（22/30）、43.3%（13/30）、20.0%（2/10）。Cyclin E与CDC25A的表达呈正相关（r=0.371,P〈0.05）,p57与CDC25A的表达呈负相关（r=-0.412,P〈0.05）,p57与Cyclin E的表达呈负相关（r=-0.384,P〈0.05）。     

TAT-p38（AF）融合肽的构建及其对紫外线诱导的p38 MAPK通路激活的抑制作用

目的构建TAT蛋白转导域介导的p38（AF）MAPK蛋白转导系统,研究该蛋白转导系统对紫外线刺激引起的p38通路激活作用的影响。方法将p38无活性突变体p38（AF）亚克隆至含有TAT蛋白转导域的pET-14b-TAT质粒,原核表达、纯化His-TAT-p38（AF）融合蛋白。激酶实验检测His-TAT-p38（AF）自身磷酸化作用。将该蛋白与NHI/3T3细胞孵育,Western blot法检测该蛋白的蛋白转导功能;紫外线照射后,检测内源性p38及其底物ATF2的磷酸化水平。结果酶切、测序表明质粒构建正确;目的蛋白被正确表达;His-TAT-p38（AF）融合蛋白无自身磷酸化作用;His-TAT-p38（AF）蛋白以浓度依赖性方式高效转导入细胞;His-TAT-p38（AF）的导入抑制紫外线诱导的内源性p38及其底物ATF2的磷酸化。结论TAT蛋白转运系统能高效转导外源蛋白进入真核细胞;p38无活性突变体TAT-p38（AF）抑制紫外线诱导的p38 MAPK通路的激活。     

塞来昔布对人结肠癌细胞株HT-29MIF、PTEN和Caspase-3表达的影响

背景：塞来昔布为环氧合酶．2（COX-2）选择性抑制剂,近年研究发现其具有抗肿瘤作用。目的：观察塞来昔布对人结肠癌细胞株HT-29巨噬细胞游走抑制因子（MIF）、抑癌基因蛋白PFEN和凋亡相关蛋白Caspase-3表达的影响,探讨其防治结肠癌可能的分子机制。方法：25、50、100μmol／L塞来昔布分别作用于HT-29细胞24h后,以逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）检测HT-29细胞MIFmRNA表达,蛋白质印迹法检测MIF、PTEN、Caspase-3蛋白表达。结果：经25～100μmol/L塞来昔布处理后,HT-29细胞MIFmRNA和蛋白表达随塞来昔布浓度的增加而减低,PTEN和Caspase-3蛋白表达随塞来昔布浓度的增加而增加,与正常对照组相比差异均有统计学意义（P〈0．05）。结论：塞来昔布的抗结肠癌作用可能与下凋MIF表达和上调PTEN、Caspase-3表达有关。     

酵母双杂交筛选与CVB3 3A相互作用的人心脏蛋白

目的 以CVB3非结构蛋白3A为诱饵,从人心脏cDNA文库中筛选与其相互作用的宿主蛋白,对阳性cDNA克隆进行初步分析和鉴定。方法 构建pGBKT7-3A重组质粒, Western Blot检测3A融合蛋白的表达;利用酵母双杂交技术筛选人心脏cDNA文库,经PCR扩增cDNA插入片段和Alu I酶切等实验将阳性克隆归类,并通过测序、相似性比对分析和回返配合实验去除假阳性蛋白。结果 成功构建诱饵质粒pGBKT7-3A,Western Blot结果表明,pGBKT7-3A重组质粒在酵母菌中成功表达3A融合蛋白;经双杂交筛选和回返配合实验,获得了7个相互作用的蛋白,分别为:兰尼碱受体2(Ryanodine Receptor 2,RyR2),信号肽酶 2(Signal peptidase complex subunit 2 ,SPCS2),跨膜蛋白emp24(Transmembrane emp24 protein transport domain containing 4,TMED4),细胞色素c氧化酶亚基I(Cytochrome c oxidase subunit I ,COX1),细胞色素c氧化酶亚基III(Cytochrome c oxidase subunit III,COX3),肌球蛋白重链(Myosin heavy chain,MYH7)和琥珀酸脱氢酶亚基D(Succinate dehydrogenase complex subunit D,SDHD)。结论 应用酵母双杂交技术,以CVB3 3A为诱饵蛋白,从人心脏cDNA文库中获得7种不同的阳性基因: RyR2 、SPCS2 、TMED4、COX1、COX3、MYH7和 SDHD,在分子水平上探索3A蛋白的新功能。     

Abr and Bcr are multifunctional regulators of the Rho GTP-binding protein family.

Philadelphia chromosome-positive leukemias result from the fusion of the BCR and ABL genes, which generates a functional chimeric molecule. The Abr protein is very similar to Bcr but lacks a structural domain which may influence its biological regulatory capabilities. Both Abr and Bcr have a GTPase-activating protein (GAP) domain similar to those found in other proteins that stimulate GTP hydrolysis by members of the Rho family of GTP-binding proteins, as well as a region of homology with the guanine nucleotide dissociation-stimulating domain of the DBL oncogene product. We purified as recombinant fusion proteins the GAP- and Dbl-homology domains of both Abr and Bcr. The Dbl-homology domains of Bcr and Abr were active in stimulating GTP binding to CDC42Hs, RhoA, Rac1, and Rac2 (rank order, CDC42Hs > RhoA > Rac1 = Rac2) but were inactive toward Rap1A and Ha-Ras. Both Bcr and Abr acted as GAPs for Rac1, Rac2, and CDC42Hs but were inactive toward RhoA, Rap1A, and Ha-Ras. Each individual domain bound in a noncompetitive manner to GTP-binding protein substrates. These data suggest the multifunctional Bcr and Abr proteins might interact simultaneously and/or sequentially with members of the Rho family to regulate and coordinate cellular signaling.     

结核分枝杆菌38kD-16kD融合蛋白克隆表达及血清学诊断价值

目的构建重组结核分枝杆菌38kD-16kD融合蛋白,评价其在结核病血清学诊断方面的价值。方法通过聚合酶链反应扩增获得16kD和38kD基因片段,分别连接到表达载体pET21a中,同时将2片段两次连接到表达载体pET21a中,形成38kD-16kD(3816),16kD, 38kD重组载体;经表达、纯化和复性后,通过Western blot分析,以酶联免疫吸附试验检测184例血清抗体,肺结核患者96例、非结核肺部疾病患者50例,正常对照38例。结果成功构建重组质粒pET21a-3816,表达蛋白经SDS-PAGE后显示相对分子质量约为65kD,重组蛋白经镍柱纯化后,纯度均达90%以上;经Western blotting证实重组蛋白能与结核病患者血清反应;重组蛋白3816血清检测,其敏感性为80.2%(77/96),特异性为90.9%(80/88)。结论成功表达和纯化了3816融合蛋白,其对血清学检测证明重组融合蛋白有希望成为结核病血清学诊断的有效候选者之一。     

日本血吸虫鸡尾酒式DNA疫苗与蛋白疫苗联合应用增强免疫保护作用的研究

目的 探讨日本血吸虫鸡尾酒式DNA疫苗与蛋白疫苗联合应用以增强免疫保护作用的效果。方法分别大量制备质粒DNA：pcDNA3．1-SjC23、pcDNA3．1-SjCTPI、pcDNA3．1-（CDR3）6和重组蛋白SjC23-HD、SjCTPI、NP30。pcDNA3．1-SjC23、pcDNA3．1-SjCTPI、pcDNA3．1-（CDR3）6等量混合后即为鸡尾酒式的混合DNA疫苗，重组蛋白SjC23-HD、SjCTPI、NP30等量混合后即为鸡尾酒式的混合蛋白疫苗。70只BALB／c小鼠随机分为A、B、C、D、E5组，每组14只。A组为自然感染组；B组（空质粒对照组）每只小鼠分别在第0、3、6周经股四头肌注射100μlpcDNA3．1；C组（空质粒＋混合蛋白对照组）每只小鼠分别在第0、3、6周经股四头肌注射100μlpcDNA3．1，第9周每鼠经背部皮下多点注射100μl混合蛋白疫苗＋100μl福氏完全佐剂（FCA）；D组（混合DNA组）每只小鼠分别在第0、3、6周经股四头肌注射100μl混合DNA疫苗；E组（混合DNA＋混合蛋白组）每只小鼠分别在第0、3、6周经股四头肌注射100μl混合DNA疫苗，第9周每鼠经背部皮下多点注射100μl混合蛋白疫苗＋100μlFCA。DNA免疫组末次免疫后4周，蛋白加强组末次免疫后2周，所有小鼠同时经腹部皮肤感染（40±1）条尾蚴。攻击感染后42d剖杀小鼠，计数成虫及肝脏虫卵数。首次免疫前2d及感染前2d分别经尾静脉采血，分离血清检测IgG抗体水平、抗体亚类IgG1及IgG2a，并取小鼠脾脏制备单个脾细胞，检测细胞因子IL-2、IL-4、IFN-γ的水平。结果C、D组和E组的减虫率分别为17．70％、32．88％和45．35％，D组和E组的减虫率均显著高于C组（P均〈0．01），且E组的减虫率显著高于D组（P〈0．01）；C、D组和E组的减卵率分别为9．39％、36．20％和48．54％，D组和E组的减卵率均显著高于C组（P均〈0．01），且E组的减虫率也显著高于D组（P〈0．05）。C、D、E3组小鼠血清都检测到特异性IgG抗体，?     

SH2 and SH3 domains as targets for anti-proliferative agents.

The Src homology domains SH2 and SH3 are small modular protein motifs about 100 and 60 amino acids long, respectively. SH2 domains interact with phosphotyrosine residues, whereas SH3 domains recognize proline-rich motifs of their interacting partners. SH2 and SH3 domains are frequently found in signaling proteins such as small adaptors and in enzymes such as kinases, lipases and phosphatases, in which they differ from the catalytic motif and constitute recognition modules. SH2 and SH3 domains are also found in oncoproteins and in proteins overexpressed in deregulated signaling pathways in tumor cells. The highly folded structures of these domains have been characterized alone and complexed with the essential fragments of their targets. Therefore, based on molecular data, inhibitors of interactions with SH2 and SH3 domains are considered to be potential antitumor agents. Current results are very promising, as inhibitors with very efficient anti-proliferative activity in tumor cells have been reported. This paper describes SH2 and/or SH3 domain-containing proteins that may constitute targets for anticancer therapeutics. It also deals with the essential structural data concerning SH2 and SH3 domains, and the rational design of inhibitors. Some of the more recent pharmacological results obtained with these compounds are also discussed.