TEAD4对结直肠癌细胞增殖影响及机制探讨

目的 结直肠癌国内外高发,是肿瘤死亡的主要病因之一.TEAD4是YAP/TAZ信号通路中的关键因子.本研究旨在探讨敲低TEAD4的表达后对结直肠癌细胞增殖的影响和机制.方法 通过在结直肠癌细胞系Caco2和HT-29中通过转染TEAD4siRNA和感染慢病毒,以达到瞬时或稳定敲低TEAD4的目的,利用蛋白质印迹方法检测转染效率及相关蛋白的表达.用SRB法分别检测敲低TEAD4后Caco2和HT-29细胞的存活率,以及使用EdU掺入法测定细胞DNA合成效率.结果 在肠癌细胞中使用TEAD4的siRNA,瞬时敲低TEAD4的表达48 h后,蛋白质印迹法检测结果提示,与对照组相比,Caco2(F-99.22,P＜0.001)和HT-29(F=167.3,P＜0.001)细胞中的TEAD4蛋白水平显著降低,同时观察到Caco2(F=45.78,P＜0.001)和HT-29(F=40.71,P＜0.001)细胞中p27蛋白的表达量有明显的上升,蛋白表达差异有统计学意义.SRB结果显示,使用shRNA慢病毒载体稳定敲低肠癌细胞中TEAD4的表达,与对照组细胞相比,2d沉默TEAD4基因的Caco2 (F=142.9,P＜0.001)和HT-29(F=141.0,P＜0.001)细胞的生长速度变慢;于3d后这种抑制作用更加明显,Caco2 (F=394.5,P＜0.001)和HT-29(F=305.1,P＜0.001)细胞增殖速度明显变慢.使用EdU掺入法检测敲低TEAD4后对Caco2和HT-29细胞DNA合成的影响,结果显示,Caco2和HT-29细胞,Caco2/Consi、Caco2/TEAD4si#2、Caco2/TEAD4si#3、HT-29/Consi、HT-29/ TEAD4si#2、HT-29/ TEAD4si#3的DNA合成率分别为(43.20±2.18)％、(27.19±2.34)％和(30.14±1.02)％及(28.23±3.11)％、(11.89±1.20)％和(17.91±2.23)％,干扰组Caco2/TEAD4si# 2(P=0.001)、Caco2/TEAD4si# 3(P＜0.001)、HT-29/TEAD4si# 2(P=0.001)及HT-29/TEAD4si# 3(P=0.011)细胞的DNA合成率显著低于对照组细胞,说明在Caco2和HT-29细胞中敲低TEAD4后,DNA的合成明显受到了抑制.结论 敲低TEAD4对结直肠癌细胞体外增殖和DNA的合成有抑制作用,可能部分通过上调p27的表达,TEAD4可能是结直肠癌发生、发展中潜在的临床诊断或治疗新靶点.     

宫颈癌细胞系中HPV16 E6、E7及E6/E7基因对STK31基因甲基化状态及表达的影响

背景与目的：丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶31(serine/threonine kinases 31,STK31)基因在人类多种癌症中扮演重要角色,且STK31基因的表达受其启动子及第一外显子区甲基化状态的影响;病毒感染与肿瘤组织中某些抑癌基因启动子区高甲基化有关。本研究旨在探讨宫颈癌细胞系中HPV16 E6、E7及E6/E7癌基因对STK31基因甲基化状态及表达的影响,以及不同种类甲基转移酶(DNA methyltransferases,DNMTs)基因在STK31基因甲基化中的潜在作用。方法：构建外源性HPV16 E6、E7以及E6/E7基因共表达慢病毒,分别感染人乳头瘤病毒(human papillomavirus,HPV)阴性宫颈癌细胞系HT-3及C33A,获得稳定转染的细胞系;采用亚硫酸氢盐基因组测序法(bisulfite genomic sequencing,BGS)和甲基化特异性PCR (methylation-specific PCR,MSP)检测3种HPV阳性宫颈癌细胞系HeLa、SiHa和CasKi以及HPV阴性宫颈癌细胞系HT-3和C33A转染前后STK31基因的甲基化状态;RT-PCR及蛋白［质］印迹法(Western blot)检测上述宫颈癌细胞系中STK31基因的表达以及DNMT1、DNMT2、DNMT3a、DNMT3b和DNMT3L基因在HPV16转染前后宫颈癌细胞系及HPV阳性、HPV阴性宫颈癌组织中的表达情况。结果：外源性HPV16 E6、E7以及E6/E7基因可在HPV阴性宫颈癌细胞系中稳定表达。3种HPV阳性细胞系HeLa、SiHa和CasKi中STK31基因呈低甲基化状态,STK31 mRNA及蛋白质表达阳性;2种HPV阴性细胞系HT-3、C33A中STK31基因则表现为高甲基化状态,STK31 mRNA及蛋白质表达缺失;与未感染慢病毒HT-3和C33A细胞系比较,外源性HPV16 E7以及E6/E7表达的HT-3和C33A细胞系STK31基因甲基化程度降低,其mRNA及蛋白质重新表达。DNMT1、DNMT3a和DNMT3b基因在HT-3E6/E7和C33AE6/E7细胞系中mRNA水平分别高于HT-3空载细胞系和C33A空载细胞系,差异有统计学意义(P<0.001)。DNMT1、DNMT3a和DNMT3b基因的mRNA水平在HPV16阳性宫颈癌组织中的表达高于其在HPV阴性宫颈癌组织中的表达,差异有统计学意义(t=5.997,P<0.001;t=6.743,P<0.001;t=7.926,P<0.001)。DNMT2在HT-3E6/E7和C33AE6/E7细胞系中mRNA表达水平分别低于HT-3空载细胞系和C33A空载细胞系,差异有统计学意义(t=7.451,P<0.001;t=2.451,P<0.05);DNMT2基因转录水平在HPV16阳性宫颈癌组织中低于HPV阴性宫颈癌组织(t=9.134,P<0.001)。DNMT3LmRNA表达水平在宫颈癌细胞系转染前后及HPV阴阳性宫颈癌组织中的差异无统计学意义(P>0.05)。结论：HPV感染可导致STK31基因启动子及第1外显子区甲基化状态降低,低甲基化状态促进该基因表达。STK31基因的表达受其启动子及第1外显子区甲基化状态的调控。HPV16 E7、E6/E7基因可能通过影响DNMT2的表达参与调控癌基因STK31基因启动子及第1外显子区甲基化状态。     

膀胱癌组织中DNMT蛋白表达水平与肿瘤增殖和凋亡程度的相关性

目的:探讨膀胱癌组织中DNMT蛋白表达水平与肿瘤增殖和凋亡程度的相关性。方法:收集膀胱癌组织标本80例和正常膀胱组织标本80例进行DNMT蛋白免疫组化分析。同时选择ABS-1膀胱癌细胞分为空白组、对照组、实验组。空白组加入常规培养基,对照组转染50nmol/L的空载体,实验组转染50nmol/L DNMT1 siRNA载体,然后进行肿瘤的增殖与凋亡分析。收集细胞进行DNMT蛋白表达检测。结果:DNMT1蛋白在膀胱癌组织中的阳性表达率为42.5%,在正常膀胱组织中的阳性表达率为2.5%,对比差异明显(P<0.05)。转染后DNMT1在空白组、对照组、实验组中的相对表达量分别为0.512±0.014、0.485±0.037和0.100±0.034,对比差异明显(P<0.05)。实验组增殖性明显低于空白组和对照组,而细胞凋亡率明显高于空白组和对照组,组间对比差异均有统计学意义(P<0.05)。结论:膀胱癌组织与膀胱癌细胞中存在DNMT1蛋白过表达,抑制DNMT1蛋白表达能有效抑制肿瘤细胞的增殖和促进凋亡。     

DNMT1高表达与beta-catenin蓄积及肺鳞癌、腺癌的恶性表型相关

背景与目的 DNA甲基转移酶1(DNA methyltransferase 1,DNMT1)是调控DNA甲基化的重要分子之一,DNMT1的异常表达与抑癌基因的甲基化、失活和多种肿瘤的发生发展有关.本研究旨在分析阐明DNMT1在正常肺组织和肺癌组织中表达的差异及其与肺鳞癌和腺癌临床病理因素的关系,并探讨DNMT1与β-catenin在肺癌中表达的相关性.方法采用组织芯片和免疫组化方法检测DNMT1和β-catenin在84例肺鳞癌、腺癌和相应癌旁正常肺组织中的表达情况.结果 DNMT1在84例肺癌组织中的平均阳性率为(58.04±35.07)%,显著高于癌旁正常肺组织[(6.88±10.26)%](t=12.835,P<0.001).DNMT1的高表达与肺癌组织的腺癌组织学分型(r=0.365,P=0.001)、低 分化程度(r=0.253,P=0.021)和淋巴结转移(r=0.246,P=0.024)正相关.DNMT1 与β-catenin的细胞浆表达显著正相关(r=0.571,P<0.001).结论 DNMT1的高表达是肺鳞癌和腺癌的普遍现象,DNMT1的高表达与肺癌的腺癌组织学类型和恶性表型有关;DNMT1在肺癌中可能与β-catenin协同表达.     

结肠癌T-cadherin表达水平分析与5-Aza-CdR对其表达和结肠癌细胞增殖、侵袭及凋亡的影响

背景与目的：结肠癌是临床常见恶性肿瘤,探讨抑癌蛋白T-cadherin在结肠癌中的表达情况及其与患者临床病理学特征的关系,并分析5-Aza-CdR对T-cadherin表达和结肠癌细胞增殖、侵袭及凋亡的影响。方法：收集福建医科大学附属第二医院2015—2016年40例手术切除的结肠癌组织及癌旁组织新鲜样本,并经过病理学检查验证,分别提取总RNA和总蛋白质。采用实时荧光定量聚合酶链反应（real-time fluorescence quantitative polymerase chain reaction,RTFQ-PCR）分析T-cadherin mRNA的表达,采用蛋白质印迹法（Western blot）分析T-cadherin蛋白水平,并分析T-cadherin的mRNA表达变化与患者临床病理学特征的关系。进一步以人结肠癌细胞系HT-29为研究对象,采用甲基化抑制剂5-Aza-CdR处理HT-29细胞,分别采用RTFQ-PCR和Western blot分析T-cadherin表达变化,采用细胞计数试剂盒（cell counting kit-8,CCK-8）分析细胞增殖,采用Transwell实验验证细胞侵袭能力,采用流式细胞术分析细胞凋亡。结果：T-cadherin在结肠癌组织的蛋白水平和mRNA表达均明显低于癌旁组织,其mRNA表达与淋巴结转移（F=5.316,P=0.009 3）和分化程度（F=5.807,P=0.006 4）明显相关,而与其他病理变量（包括性别、年龄、肿瘤大小和肿瘤浸润深度）无明显相关。药物5-Aza-CdR可以显著上调HT-29细胞中T-cadherin的表达水平,抑制HT-29细胞增殖、侵袭并促进细胞凋亡。结论：T-cadherin表达可能与结肠癌恶性程度密切相关,药物5-Aza-CdR处理可上调结肠癌细胞T-cadherin的表达,并抑制结肠癌细胞的增殖、迁移,促进结肠癌细胞凋亡,提示T-cadherin可能是结肠癌患者使用甲基化抑制剂5-Aza-CdR治疗的靶点。     

肝癌组织中乙型肝炎病毒感染与甲基化转移酶表达的关系

目的分析肝癌组织中乙型肝炎病毒(HBV)感染患者体内DNA甲基转移酶(DNMT)表达量,探讨肝癌组织中HBV感染与甲基化转移酶表达的关系。方法选取2013年1月间至2014年1月青岛市中心医院放疗科接受治疗的52例肝癌患者,根据肝癌组织中HBV感染情况分为HBV感染组和非HBV感染组,每组26例。采用荧光定量聚合酶链式反应(PCR)方法,检测52例患者肝癌组织内DNMT1、DNMT2、DNMT3a和DNMT3b的mRNA表达量。结果 HBV感染组DNMT1 mRNA表达为1.21±0.24,非HBV感染组为0.83±0.21,HBV感染组DNMT1 mRNA表达高于非HBV感染组,差异有统计学意义(t=6.08,P<0.05);HBV感染组DNMT2 mRNA表达为0.77±0.15,非HBV感染组为0.63±0.12,HBV感染组DNMT2mRNA表达高于非HBV感染组,差异有统计学意义(t=3.72,P<0.05);HBV感染组DNMT3a mRNA表达为1.36±0.25,非HBV感染组为0.94±0.17,HBV感染组DNMT3a mRNA表达高于非HBV感染组,差异有统计学意义(t=7.08,P<0.05);HBV感染组DNMT3b mRNA表达为0.68±0.12,0.49±0.09,HBV感染组DNMT3b mRNA表达高于非HBV感染组,差异有统计学意义(t=6.46,P<0.05)。结论肝癌组织中HBV感染促进甲基化转移酶的表达,从而促进抑癌基因甲基化。     

MTA1沉默对膀胱癌细胞株BIU-87侵袭能力影响的探讨

目的:采用RNAi沉默膀胱癌细胞株BIU-87 MTA1基因的表达,观察对膀胱癌细胞侵袭能力的影响。方法:构建针对MTA1的siRNA表达质粒,体外转染BIU-87细胞。分别采用RT-PCR和蛋白质印迹法检测各组MTA1 mRNA和蛋白表达;Milli-cell PCF侵袭小室及肿瘤细胞体外黏附试验研究转染前后膀胱癌细胞侵袭能力的变化。结果:与转染空质粒组和未转染组相比,转染siRNA载体组细胞MTA1表达在RNA及蛋白水平都显著低于对照组,前组穿透侵袭小室滤膜的数目明显少于空质粒组和未转染组(F=213.147,P=0.000),MTT法测定已黏附细胞的OD490 nm,显示前组的体外黏附能力与转染空质粒组和未转染组体外黏附能力差异有统计学意义,F=5.663,P=0.008。结论:shMTA1可抑制MTA1在膀胱癌细胞中的表达,并可抑制膀胱癌细胞侵袭转移,以MTA1为靶点的RNA干扰技术可望成为膀胱癌基因治疗的新方法。     

siRNA沉默人组织因子基因对大肠癌侵袭转移能力影响的观察

目的:应用RNA干扰(RNA interference,RNAi)的手段抑制人类结肠癌细胞内组织因子(tissue factor,TF)基因表达,从而探讨对其侵袭转移能力的影响.方法:首先构建携带有针对TF基因有效的siRNA序列的真核细胞表达质粒pSU-PER-TF,用此质粒转染人类结肠转移癌细胞系LoVo,应用RT-PCR和蛋白质印迹法从RNA及蛋白质水平检测证实细胞内源性TF基因被敲减后的表达水平变化,通过Matrigel体外侵袭实验进一步考证对细胞侵袭转移能力所造成的影响.结果:RT-PCR及蛋白质印迹法结果显示,与转染pSUPER质粒的LoVo细胞相比,转染重组干扰质粒pSUPER-TF-1的细胞其内源性TF基因的表达水平被显著敲减.Matrigel体外侵袭实验证实,转染pSUPER质粒的LoVo穿膜细胞均数为(220±7.0)个,而转染pSUPER-TF-1质粒的LoVo穿膜细胞均数为(102±4.0)个,两组差异有统计学意义,t=25.293,P=0.008.结果表明,转染pSU-PER-TF-1质粒的LoVo细胞侵袭转移能力显著下降.结论:以TF基因作为靶点应用RNA干扰技术敲减其表达可以明显降低LoVo细胞体外侵袭转移能力,为结肠癌的临床治疗提出新的思路,可以作为结肠癌治疗的一个新靶点.     

环氧合酶-2特异性siRNA真核表达质粒对HT-29细胞生长的影响

目的探讨环氧合酶-2(COX-2)特异性小干扰RNA(siRNA)真核表达质粒对人结肠癌HT-29细胞COX-2表达和生长的影响。方法设计短发夹结构的COX-2 siRNA对应模版DNA序列,构建重组质粒pshCOX-2。将重组质粒转染人结肠癌HT-29细胞,采用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)、Western印迹分别从mRNA和蛋白水平检测COX-2表达。用四氮唑盐(MTT)法和流式细胞仪观察COX-2表达被抑制后细胞的生长情况,放射免疫法(RIA)和ELISA法分别检测培养上清中PGE2和VEGF的含量变化。结果酶切及测序证实质粒pshCOX-2构建成功。转染重组质粒72h后可以显著抑制HT-29细胞COX-2 mRNA和蛋白表达(P<0.05),细胞生长受抑,凋亡细胞数显著增加(P<0.05),细胞PGE2和VEGF的产生受抑制(P<0.05)。结论成功构建的COX-2 siRNA真核表达质粒pshCOX-2通过抑制人结肠癌HT-29细胞COX-2基因表达,从而抑制细胞生长、PGE2合成和VEGF的产生。     

siRNA抑制肺腺癌细胞DNA-DPKCS表达与放射敏感性关系研究

目的 探讨稳定表达的小干扰RNA(siRNA)抑制DNA依赖蛋白激酶催化亚基(DNA-DPKCS)表达对非小细胞肺癌细胞增殖、细胞周期及放射敏感性的影响.方法 构建DNA-DPKCS-siRNA莺组质粒转染肺腺癌细胞A549.流式细胞仪检测细胞周期和凋亡,成克隆实验测定细胞存活曲线.结果 建立了与A549细胞同源的DNA-DPKCS低表达细胞系549pRNA-DNA-DPKCS、阴性对照549pRNA-C细胞、空白549pSUPER细胞.与A549细胞相比549pRNA-DNA-DPKCS细胞的DNA-DPKCS mRNA(0.110:1.000;F=80.55,P<0.01)、蛋白表达水平(0.870:2.967;F=63.96,P<0.01)以及DNA-DPKCS活性(0.004:0.266;F=51.62,P<0.01)均显著降低.549pRNA-DNA-DPKCS细胞2 Gy存活分数、平均致死剂量、亚致死性损伤剂量均较A549细胞明显降低(0.25:0.76;F=996.86,P<0.01;1.42:1.62;F=17.41,P<0.05;0.06:1.00;F=68.92,P<0.01).DNA-DPKCS表达受抑后549pRNA-DNA-DPKCS细胞较A549细胞S期和G_2期细胞比例明显减少(24.5%:35.5%;F=4.83,P<0.05和10.7%:11.0%;F=32.04,P<0.01).结论 抑制DNA-DPKCS表达可提高肺腺癌细胞A549的放射敏感性,同时调控细胞周期时相分布.     

IL-12调控胃癌细胞凋亡及免疫逃逸因子分泌机制探讨

目的探讨白细胞介素-12(IL-12)调控胃癌细胞凋亡及免疫逃逸因子分泌的途径。方法培养胃癌SGC7901细胞,随机分为空白对照组、感染阴性对照(NC)腺病毒的NC腺病毒组、感染IL-12腺病毒的IL-12腺病毒组、转染NC质粒的NC质粒组、转染STAT4质粒的STAT4质粒组、转染NC siRNA的si-NC组、转染STAT4siRNA的si-STAT4组、感染IL-12腺病毒并转染STAT4siRNA的IL-12腺病毒+si-STAT4组。MTS法检测细胞活力,流式细胞术检测细胞凋亡,蛋白质印迹法检测细胞中IL-12、STAT4蛋白表达,Elisa检测培养基中IL-12、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)和干扰素-γ(IFN-γ)的分泌量;采用方差分析进行组间的统计学处理。结果IL-12腺病毒组细胞活力(0.41±0.08)较空白对照组(0.91±0.16)及NC腺病毒(0.86±0.13)降低,差异有统计学意义,F=25.123,P<0.001;凋亡率(10.95±2.85)%较空白对照组(1.86±0.32)%及NC腺病毒(2.24±0.41)%增加,差异有统计学意义,F=47.253,P<0.001。IL-12腺病毒组p-STAT4的蛋白表达量(3.23±0.62)较空白对照组(1.00±0.18)及NC腺病毒(1.05±0.22)增加,差异有统计学意义,F=54.565,P<0.001。培养基中IFN-γ、TNF-α分泌量分别为(3.09±0.74)、(3.88±0.62)ng/mg较空白对照组的(1.37±0.24)、(0.81±0.16)ng/mg及NC腺病毒组的(1.50±0.21)、(0.88±0.14)ng/mg增加,差异有统计学意义,F值分别为61.620、39.153,均P<0.001。IL-12腺病毒+si-STAT4组的细胞活力(0.76±0.12)较IL-12腺病毒组(0.40±0.08)增加,差异有统计学意义,t=5.582,P=0.001。IL-12腺病毒+si-STAT4组的细胞凋亡率(5.71±0.93)%较IL-12腺病毒组(10.95±2.85)%降低,差异有统计学意义,t=3.908,P=0.004。IL-12腺病毒+si-STAT4组培养基中IFN-γ的分泌量(2.03±0.52)ng/mg较IL-12腺病毒组(3.88±0.62)ng/mg降低,差异有统计学意义,t=5.112,P=0001;TNF-α的分泌量(1.42±0.29)ng/mg较IL-12腺病毒组(2.39±0.51)ng/mg降低,差异有统计学意义,t=3.697,P=0.006。结论IL-12通过激活STAT4途径调控胃癌细胞凋亡及免疫逃逸因子分泌。     

miRNA-618对急性单核细胞白血病THP-1细胞增殖和凋亡调控的研究

目的探讨miRNA-618(miR-618)对急性单核细胞白血病THP-1细胞增殖和凋亡的影响。方法采用实时荧光定量聚合酶链反应(PCR)检测miR-618在THP-1细胞和健康人外周血分离的单核细胞中的相对表达量。构建过表达miR-618质粒载体,以空载体作为阴性对照,将二者分别转染THP-1细胞,设定为miR-618过表达组和阴性对照组。采用CCK-8法和流式细胞术分别检测各组THP-1细胞增殖和凋亡情况。采用TargetScan软件预测miR-618靶基因,通过荧光素酶报告基因实验对其进行验证。采用蛋白质印迹法检测miR-618过表达组或阴性对照组的THP-1细胞和健康人外周血单核细胞中预测的miR-618靶基因蛋白表达的水平。结果PCR结果显示,与健康人外周血分离的单核细胞相比,THP-1细胞中miR-618表达量低(P<0.05)。CCK-8法检测结果显示,与阴性对照组比较,miR-618过表达组THP-1细胞增殖能力降低(转染0、24、48、72 h细胞吸光度值:0.20±0.03比0.20±0.03、0.28±0.02比0.35±0.03、0.34±0.03比0.43±0.04、0.39±0.02比0.53±0.05,均P<0.05),细胞晚期凋亡率升高[(27.1±0.1)%比(14.9±0.1)%,t=2.13,P=0.03]。TargetScan软件预测miR-618靶基因为ARPP19。荧光素酶报告基因实验结果显示,转染野生型ARPP19基因质粒+miR-618基因质粒组的THP-1细胞相对荧光素酶活性均高于空白对照组和转染野生型ARPP19基因质粒+miR-618空载质粒组(0.170±0.003比0.100±0.004、0.100±0.001,均P<0.05)。蛋白质印迹法检测结果显示,miR-618过表达组THP-1细胞ARPP19蛋白表达水平低于阴性对照组,而两组健康人外周血单核细胞中ARPP19蛋白表达水平相近。结论miR-618可能通过抑制急性单核细胞白血病THP-1细胞ARPP19的表达而抑制细胞增殖、促进细胞凋亡。     

TBX15基因启动子甲基化在肝细胞癌中的表达及其功能研究

目的  探讨TBX15基因在肝细胞癌中的表达及其启动子甲基化对细胞生物学行为的影响。方法 分别采用亚硫酸氢盐测序法（bisulfite sequencing PCR,BSP）和实时荧光定量PCR（qPCR）检测3种肝癌细胞系（HepG2、MHCC97H、SNU449）中TBX15基因启动子甲基化状态和表达水平,再将空白质粒、空载质粒pc3.1和TBX15过表达质粒转染肝癌ＳＮＵ499细胞,通过CCK-8实验和流式细胞术检测各组肝癌细胞的增殖和凋亡情况。 结果 3种肝癌细胞系中,TBX15基因在肝癌 SNU449细胞中的启动子甲基化程度最高,甲基化率为89.5%,而TBX15 mRNA表达水平最低。TBX15过表达质粒组培养48 h后,肝癌SNU449细胞的增殖能力高于空载质粒组,差异有统计学意义（0.549±0.080 vs 0.457±0.506,P=0.015）;TBX15过表达质粒组肝癌SNU449细胞的总凋亡比例高于空白质粒组,差异有统计学意义［（5.12±1.42）% vs （2.16±0.41）%,P=0.014］。 结论 启动子区异常甲基化可能是肝癌细胞TBX15基因失活的主要原因,且与肝癌恶性生物学行为密切相关。TBX15可能是预测肝癌发生发展的指标。     

DNMT1 and DNMT3b silencing sensitizes human hepatoma cells to TRAIL‐mediated apoptosis via up‐regulation of TRAIL‐R2/DR5 and caspase‐8

DNA methylation plays a critical role in chromatin remodeling and gene expression. DNA methyltransferases (DNMTs) are hypothesized to mediate cellular DNA methylation status and gene expression during mammalian development and in malignant diseases. In this study, we examined the role of DNA methyltransferase 1 (DNMT1) and DNMT3b in cell proliferation and survival of hepatocellular carcinoma (HCC) cells. Gene silencing of both DNMT1 and DNMT3b by targeted siRNA knockdown reduces cell proliferation and sensitizes the cells to tumor necrosis factor‐related apoptosis‐inducing ligand (TRAIL)‐mediated cell death. The proapoptotic protein caspase‐8 demonstrated promoter hypermethylation in HCC cells and was up‐regulated by knockdown of DNMT1 and DNMT3b both at mRNA and protein levels. In addition, death receptor TRAIL‐R2/DR5 (TRAIL receptor 2/death receptor 5) did not exhibit promoter hypermethylation in HCC cells but was also up‐regulated by knockdown of DNMT1 and DNMT3b both at mRNA and protein levels. Consistent with this observation, the combined transfection of DNMT1‐siRNA plus DNMT3b‐siRNA enhanced formation of the TRAIL‐death‐inducing signaling complex formation in HCC cells. In conclusion, our data suggest that DNA methylation of specific genomic regions maintained by DNMT1 and DNMT3b plays a critical role in survival of HCC cells, and a simultaneous knockdown of both DNMT1 and DNMT3b may be a novel anticancer strategy for the treatment of HCC. (Cancer Sci 2010)     

Midkine表达水平对人乳腺癌MDA．MB一231细胞转移潜能影响研究

目的：观察中期因子（midkine,MK）基因对人乳腺癌MDA—MB-231细胞增殖、迁移、黏附和侵袭能力的影响。方法：实时荧光定量PCR和蛋白质印迹法检测人乳腺癌细胞株MCF-7、Bcap-37和MDA-MB-231中MKmRNA及蛋白表达,筛选出MK表达丰度较高的细胞株。采用脂质体2000将MKshRNA干扰质粒pSilencer-3．1-H1一MK和空载体对照质粒pSilencer-3．1-H1-NC转染到该细胞株,并设未处理对照组。实时荧光定量PCR和蛋白质印迹法检测干扰后MK基因和蛋白表达;CCK一8检测细胞增殖能力,与胞外基质蛋白作用30min后检测其黏附能力,Transwell检测细胞侵袭能力和迁移能力。结果：实时荧光定量PCR和蛋白质印迹检测结果显示,MDA—MR231细胞株适合做敲减验证。pSilencer-3．1-H1-MK干扰MDA—MB231细胞MK表达后,MK基因相对表达量为0．384-0．02,低于对照组0．76±0．04和空载体转染组0．84±0．04,F=144．85,P〈0．001;MK蛋白相对表达量为0．39±0．07,低于对照组0．95±0．04和空载体转染组0．99±0．02,F=26．49,P=0．001。CCK-8结果显示,细胞培养24、48和72h,MK基因干扰组细胞增殖能力明显低于低于对照组和空载体转染组,差异有统计学意义,P〈0．05。细胞黏附实验结果显示,与胞外基质蛋白作用30rain后,MK基因干扰组黏附细胞数为（21．87±5．17）％,低于对照组（38．74±4．98）％和空载体转染组（42．37±5．74）％,F=27．60,P〈0．001。Transwell迁移实验中,MK基因干扰组穿越Transwell小室的细胞个数为26．6±6．67,低于对照组（47．0±4．32）和空载体转染组（52．0±6．98）,F：44．98,P〈0．001。侵袭实验中,MK基因干扰组穿越Tr—answell小室的细胞个数为13．2±3．46,低于对照组（19．4±4．43）和空载体转染组（19．9±3．90）,F=8．94,P=0．001。结论：干扰MK的表达可显著抑制人乳腺癌MDA—MB-231细胞体外增殖     

过表达Numb基因对人膀胱癌5637细胞周期和增殖的影响

目的：：探讨 Numb 基因对人膀胱癌细胞周期和增殖能力的影响及相关机制。方法：选取人膀胱癌细胞5637为研究对象，采用 Numb-ORF 表达质粒转染细胞为实验组，设置阴性对照和空白对照组。采用荧光定量聚合酶链式反应和蛋白质印迹技术检测各组中 Numb 基因和细胞周期蛋白 D1（Cyclin D1）的表达；采用流式细胞技术检测各组的细胞周期；采用酶标仪检测细胞在490nm 的吸光度值，评价各组细胞的增殖活力。结果：实验组 Numb的△CT 值为1.58±0.41，阴性对照组为5.66±0.53，空白对照组为5.81±0.47，差异有统计学意义（F ＝77.39， P ＝0.00）；实验组 Cyclin D1的△CT 值为4.92±0.73，阴性对照组为2.59±0.33，空白对照组为2.45±0.26，差异有统计学意义（F ＝11.70，P ＝0.01）。实验组中 G0／G1期细胞的比例（％）为49.76±7.07，明显高于阴性对照组的36.52±3.32和空白对照组的38.21±2.06，差异有统计学意义（F ＝7.17，P ＝0.03）。增殖实验中，实验组24 h 的吸光度值为0.35±0.08，明显低于阴性对照组0.52±0.06和空白对照组0.55±0.04（F ＝9.03，P ＝0.02）。结论：Numb 基因可以提高 G0／G1期细胞比例，抑制膀胱癌细胞增殖，其机制可能是通过抑制 Cyclin D1表达实现。