西妥昔单抗联合顺铂对荷食管鳞癌裸鼠移植瘤的抑制作用

目的 探讨西妥昔单抗联合顺铂对人食管鳞癌裸鼠移植瘤生长的抑制作用.方法 将食管鳞癌Eca-109细胞株接种于裸鼠皮下,制备裸鼠移植瘤模型.将裸鼠随机分成对照组、西妥昔单抗组、顺铂组和两药联合组.动态测量各组移植瘤体积,给药结束后取出瘤体称瘤体质量,计算抑瘤率.取血标本检测肿瘤标志CEA.采用蛋白质印迹法检测肿瘤组织中MAPK蛋白磷酸化水平.结果 对照组、西妥昔单抗组、顺铂组和联合用药组平均肿瘤体积分别为(2 056.3±787.3)、(1 642.0±850.3)、(1 540.7±427.7)和(1 299.3±583.8) mm3.析因分析显示,单药作用后肿瘤大小变化差异无统计学意义,P＞0.05,两药间无交互作用,F=0.160,P=0.691.对照组、西妥昔单抗组、顺铂组和联合用药组平均瘤质量分别为(1.84±0.75)、(1.70±0.90)、(1.27±0.51)和(0.95±0.25)g;西妥昔单抗处理后瘤体质量减轻,差异无统计学意义,F＝1.21,P=0.279;而顺铂组差异有统计学意义,F=10.382,P＝0.003;两药间无交互作用,F=0.211,P=0.649.对照组、西妥昔单抗组、顺铂组和联合用药组的抑瘤率分别为0、7.6％、31.0％和48.4％.西妥昔单抗和顺铂单药各自均能降低CEA表达水平,差异有统计学意义,P＜0.05;两药间无交互作用,F=0.601,P=0.443.药物干预后对照组、西妥昔单抗组、顺铂组和联合用药组P-MAPK蛋白表达量分别为1.530±0.77、0.791±0.08、1.705±0.12和0.901±0.85,西妥昔单抗明显下调了P-MAPK蛋白表达水平,F=669.332,P＜0.001;而顺铂上调了P-MAPK蛋白的表达,F=23.000,P＜0.001;两药联用后P-MAPK蛋白表达水平下降,两药之间无交互作用,F=1.207,P=0.279.结论 顺铂上调EGFR下游蛋白P-MAPK的活化,西妥昔单抗与顺铂联用表现为相加作用,抑制移植瘤生长作用优于单药组.     

乳腺癌多药耐药DEDD作用及机制研究

目的 死亡效应结构域DNA结合蛋白(death effector domain DNA-binging protein,DEDD)可抑制乳腺癌的生长和转移,但在乳腺癌多药耐药中的作用尚不明确.本研究将探讨DEDD在人乳腺癌多药耐药中的作用及机制.方法 通过转染DEDD-shRNA建立稳定敲低DEDD表达的MCF-7人乳腺癌细胞株,MTS实验检测多柔比星、紫杉醇对MCF-7 WT(Wild type,野生型)、MCF-7 control shRNA和MCF-7 DEDD-shRNA细胞活力的影响,Annexin-V和碘化丙啶(propidium iodide,PI)双染后流式细胞仪检测细胞凋亡.蛋白质印迹法检测乳腺癌耐药蛋白(breast cancer resistance protein,BCRP)在药物干预后的蛋白表达水平.结果 多柔比星干预后,半数抑制浓度IC50的多因素方差分析结果显示,不同处理(F=89.49,P＜0.001)、不同时间(F=50.81,P＜0.001)组间比较差异有统计学意义.多柔比星干预24或48 h后,MCF-7 DEDD-shRNA的半数抑制浓度IC50分别为(0.97±0.15)和(0.62±0.09) μmol/L,明显高于MCF-7 WT(0.46±0.05)和(0.26±0.03) μmol/L和MCF-7 control shRNA细胞(0.39±0.05)和(0.25±0.03)μmol/L,P＜0.001.紫杉醇干预后,半数抑制浓度IC50的多因素方差分析结果显示,不同处理(F=15.94,P＜0.001)、不同时间组间(F=129.70,P＜0.001)比较差异有统计学意义.紫杉醇干预24或48 h后,MCF-7 DEDD-shRNA的半数抑制浓度IC50为(16.74±2.26)和(9.88±1.47) μmol/L,明显高于MCF-7 WT(13.39±1.44)和(7.69±0.92) μmol/L(P=0.001)和MCF-7 control shRNA细胞(12.58±1.15)和(7.17±1.12) μmol/L(P＜0.001).多柔比星干预后24 h后流式细胞凋亡结果显示,不同处理(F=131.46,P＜0.001)、不同浓度组间(F=160.95,P＜0.001)比较差异有统计学意义.正常培养状态下,MCF-7 control shRNA细胞和MCF-7 DEDD-shRNA细胞的凋亡率分别为(14.32±1.47)％和(11.58±1.63)％,而给予0.5μmol/L和1 μmol/L多柔比星作用24 h后,M[CF-7DEDD-shRNA细胞的凋亡率分别为(21.62±1.97)％和(24.39±2.36)％,明显低于MCF-7 control shRNA细的(36.26±1.87)％和(38.23±1.46)％,P＜0.001.同样,紫杉醇干预后24 h,不同处理(F=124.81,P＜0.001)、不同浓度组问(F=172.56,P＜0.001)细胞凋亡率比较差异有统计学意义.给予9.37和18.74 μmol/L紫杉醇作用24 h后,MCF-7DEDD-shRNA细胞的凋亡率分别为(30.26±1.63)％和(32.18±2.16)％,明显低于MCF-7 control shRNA组的(53.84±2.17)％和(58.27±2.16)％,P＜0.001.多柔比星作用后不同时间BCRP蛋白质印迹检测统计分析结果显示,不同处理(F=14.67,P＜0.001)、不同时间(F=6.39,P=0.006)组间BCRP蛋白表达比较差异有统计学意义.给予0.5 μmol/L多柔比星作用24 h后,3组细胞的BCRP相对表达水平分别为0.87±0.04、1.06±0.02和5.25±0.18.MCF-7 DEDD-shRNA细胞组BCRP蛋白的表达水平显著高于MCF-7 WT和MCF-7 control shRNA细胞组,P＜0.001.多柔比星作用48 h后,3组细胞的BCRP相对表达水平分别为1.06±0.01、0.97±0.04和2.98±0.13.MCF-7 DEDD-shRNA细胞组BCRP蛋白的表达水平出现回落,但仍显著高于MCF-7 WT和MCF-7 control shRNA细胞组,P＜0.001.同样,紫杉醇作用后不同时间BCRP蛋白质印迹检测统计分析结果显示,不同处理(F=7.26,P=0.004)、不同时间(F=8.32,P=0.002)组间BCRP蛋白表达比较差异有统计学意义.给予9.37 μmol/L紫杉醇作用24 h后,3组细胞的BCRP相对表达水平分别为0.81±0.05、2.25±0.10和1.78±0.14.其中MCF-7 control shRNA组细胞BCRP表达水平高于MCF-7 WT (P＜0.001)和MCF-7 DEDD-shRNA (P=0.002)组.而紫杉醇作用48 h后,3组细胞的BCRP相对表达水平分别为0.73±0.04、1.73±0.05和3.12±0.12,MCF-7 DEDD-shRNA细胞组BCRP蛋白的表达水平继续增高,且显著高于MCF-7 WT和MCF-7 control shRNA细胞组,P＜0.001.结论 敲低DEDD表达可增强乳腺癌细胞的抗肿瘤药耐药性,BCRP的表达增加可能是低表达DEDD乳腺癌细胞多药耐药的机制之一.     

膀胱癌细胞Cx43对顺铂抗肿瘤作用影响研究

目的 连接蛋白43(connexin43,Cx43)在人体正常组织及肿瘤组织中广泛表达,并且参与细胞的生长控制和组织分化.本研究探讨采用RNA干扰技术沉默膀胱癌5637细胞株Cx43蛋白表达对顺铂化疗敏感性的影响.方法 体外培养膀胱癌5637细胞和正常尿路上皮SV-HUC-1细胞,采用蛋白质印迹法检测膀胱癌5637细胞系和正常尿路上皮SV-HUC-1细胞中Cx43蛋白表达,应用免疫荧光技术检测膀胱癌5637细胞系中Cx43蛋白的定位.采用RNA干扰技术沉默膀胱肿瘤5637细胞株Cx43蛋白的表达并用顺铂(3μg/mL)处理SiRNA-Cx43组(实验组)和SiRNA-Control(对照组)后,通过CCK-8检测实验组、对照组及野生型5637细胞的增殖情况;采用流式细胞术检测两组癌细胞的凋亡;采用蛋白质印迹法检测顺铂处理后野生型5637细胞后细胞中Cx43、Cleaved Caspase-3的表达及实验组和对照组中Cx43、Cleaved Caspase-3和Bcl-2的表达.结果 膀胱癌5637细胞中Cx43表达较正常尿路上皮细胞高,相对蛋白表达量分别为1.013±0.102和0.556±0.054,两细胞系比较差异有统计学意义,t=3.789,P=0.019;免疫荧光检测Cx43主要定位于细胞质中.CCK-8结果显示,膀胱癌5637细胞随着顺铂药物的浓度(0.75、1.5、3和6μg/mL)和时间(0、1、2、3 d)的增加,细胞的增殖减少,采用重复测量方差分析,各组间比较,差异有统计学意义,F=153.634,P＜0.001;实验组增殖较对照组明显减少,差异有统计学意义,F=9.949,P=0.02.流式细胞仪检测结果显示,实验组和对照组凋亡率分别为(63.00±4.58)％和(34.33±6.03)％,差异有统计学意义,t=7.457,P＜0.01.蛋白质印迹法结果显示,5637细胞随着药物(顺铂3 μg/mL)作用时间增加,Cx43蛋白表达逐渐降低,差异有统计学意义,F=178.868,P＜0.001;而CleavedCaspase-3逐渐升高,差异有统计学意义,F=21.643,P＜0.001.顺铂(3μg/mL,4h)处理实验组和对照组后,CleavedCaspase-3蛋白相对表达量分别为0.740±0.092和0.373±0.091,差异统计学意义,t=6.394,P=0.001;BclL-2蛋白相对表达量分别为0.260±0.066和0.817±0.068,差异统计学意义,t=4.814,P=0.005 结论 沉默膀胱癌5637细胞中Cx43蛋白表达能提高顺铂的敏感性,可能与反常定位于细胞质中的Cx43参与线粒体介导的凋亡途径有关.     

靶向干扰Spy1表达增强食管癌化疗敏感性的研究

[目的]探讨抑制Spy1表达后食管癌细胞对化疗药物顺铂敏感性的变化。[方法]在食管癌Eca-109细胞中转染靶向Spy1的si RNA,采用RT-PCR和Western Blot检测Spy1的表达情况;MTT法检测抑制Spy1表达后对Eca-109细胞生长和对顺铂化疗敏感性的影响;流式细胞术检测干扰Spy1对细胞周期的影响。[结果]转染Spy1 si RNA后,食管癌Eca-109细胞中Spy1的m RNA和蛋白水平明显下降;MTT结果显示顺铂对Eca-109细胞的半数抑制浓度(50%inhibiting concentration,IC50)由4.56±1.23μg/ml降至1.12±0.09μg/ml;转染Spy1 si RNA联合顺铂IC50处理使细胞存活率由(64.7±3.8)%降至(46.8±4.2)%;细胞周期更多阻滞于G0/G1期(P<0.05)。[结论]靶向干扰Spy1表达可抑制食管癌细胞的生长,增强顺铂对肿瘤细胞的杀伤作用,其机制与细胞阻滞于G0/G1期有关。     

重组人血管内皮抑素与紫杉醇联合诱导人食管癌细胞Eca-109凋亡的实验研究

目的 探讨重组人血管内皮抑素（恩度）与紫杉醇联合作用对人食管癌细胞Eca-109增殖和凋亡的影响。方法 MTT法检测恩度与紫杉醇联合用药48h后对Eca-109细胞增殖的抑制作用;倒置显微镜下观察恩度、紫杉醇单药与联合作用于人食管癌Eca-109细胞48h后细胞形态学的改变;Annexin V/PI双染流式细胞术检测恩度、紫杉醇不同用药组作用48h后的细胞凋亡率;RT-PCR法检测凋亡相关基因Bcl-2、Bax、p21、p53 mRNA的表达情况。结果恩度、紫杉醇作用于Eca-109细胞48h后的半数抑制浓度（IC₅₀）分别为276.6627μg/ml和3.8789μg/ml。恩度单药组、紫杉醇单药组、恩度+紫杉醇组、恩度→紫杉醇组、紫杉醇→恩度组作用Eca-109细胞48h后的抑制率分别为（33.62±2.30）%、（49.14±1.45）％、（56.29±0.71）％、（41.88±1.23）％和（51.48±0.98）％;与阴性对照组比较,恩度、紫杉醇各加药组对Eca-109细胞均有明显的抑制作用（P＜0.01）;恩度+紫杉醇组的抑制率高于其他各组（P＜0.05）。光镜下恩度、紫杉醇作用48h后Eca-109细胞具有典型的凋亡形态学改变,恩度单药组、紫杉醇单药组、恩度+紫杉醇组、恩度→紫杉醇组、紫杉醇→恩度组的总凋亡率分别为（8.78±0.19）％、（13.82±0.15）％、（18.88±0.29）％、（11.37±0.24）％和（14.88±0.34）％;恩度、紫杉醇各加药组的总凋亡率均高于阴性对照组（P＜0.05）;恩度+紫杉醇组的总凋亡率明显高于其他各组（P＜0.01）。与阴性对照组比较,恩度单药组、紫杉醇单药组、两药序贯组的Bcl-2 mRNA表达均明显降低;恩度与紫杉醇联合用药组的Bax mRNA表达均降低;各用药组的p21 mRNA表达均降低;恩度与紫杉醇序贯用药组的p53表达降低。结论 恩度与紫杉醇联合可协同诱导人食管癌细胞的凋亡,其作用机制可能与下调凋亡抑制基因的表达有关。     

小干扰RNA抑制bcl-xL表达对食管癌细胞化疗敏感性的影响

目的 探讨凋亡抑制分子bcl-xL表达下调对食管癌细胞化疗敏感性的影响.方法 根据人bcl-xL基因序列设计和合成3对小干扰RNA,将其转染于体外培养的人食管癌细胞株Eca-109,通过RT-PCR和Western-blotting检测bcl-xL的表达情况,筛选出对bcl-xL表达抑制作用最强的小干扰RNA,通过MTT法检测小干扰RNA转染细胞和对照细胞在不同浓度顺铂和紫杉醇作用下的细胞增殖抑制率,计算出半数抑制浓度IC50值并进行对比分析.结果 食管癌细胞转染靶向bcl-xL的3种小干扰RNA后,bcl-xL mRNA和蛋白表达均显示出不同程度下调,其中siRNA1对癌细胞bcl-xL表达的抑制作用最强.siRNA1转染食管癌细胞后可使顺铂和紫杉醇对癌细胞的IC5o值由转染前的(31.4±4.3)μmol/L和(35.3±6.1)μmol/L下降至转染后的(8.4±3.3)μmol/L和(15.1±4.7)μmol/L(P＜0.01).结论 小干扰RNA抑制bcl-xL表达可增强食管癌细胞对顺铂和紫杉醇化疗的敏感性.     

γ-synuclein在食管癌中的表达及其对食管癌Eca-109细胞侵袭力的影响

目的:研究γ-synuclein在食管癌中的表达及其对人食管癌细胞株Eca-109侵袭力的影响.方法:选取2010年1月至12月于河北医科大学第四医院食管癌患者组织标本30例,同时取10例正常食管组织作对照.采用免疫组化法观察食管癌组织中γ-synuclein的表达情况.采用脂质体法转染含γ-synuclein的重组质粒pcDNA3.0-γ-synuclein,应用RT-PCR检测转染后Eca-109细胞中γ-synuclein mRNA的表达,流式细胞术检测γ-synuclein蛋白的表达,利用Transwell实验检测转染后Eca-109细胞侵袭力的变化.结果:与正常食管组织相比,食管癌组织中γ-synuclein蛋白阳性表达率明显增强(83.3％ vs40.0％,P＜0.05),Ⅰ-Ⅱ期食管癌患者γ-synuclein表达率明显低于Ⅲ-Ⅳ期(22.2％ vs 76.2％,P＜0.05).pcDNA3.0-γ-synuclein质粒转染后,Eca-109细胞中γ-synuclein mRNA表达水平显著高于空质粒转染组和未转染组[(1.10±0.03)vs(0.42±0.03),(0.45±0.15),P＜0.01],蛋白表达水平也明显增高[(1.05 ±0.061) vs (0.80±0.45),(0.79 ±0.46);P＜0.05],穿膜细胞数明显增加[(167 ±2.51)vs(65 ±2.60),(70±2.50);P＜0.01].结论:食管癌组织高表达γ-synuclein,其表达上调能增强人食管癌Eca-109细胞的侵袭力,提示其在食管癌的转移和恶性发展中发挥重要作用.     

苯丁酸调控对顺铂抑制人肺腺癌A549/DDP耐药细胞株增殖与侵袭协同作用研究

目的肺癌已成为威胁人类生存的重要杀手,且随着环境恶化,其发病率和死亡率有逐年升高趋势。本研究分析4-苯丁酸对顺铂作用下人肺腺癌耐药细胞株A549/DDP细胞增殖和侵袭影响,为临床治疗提供参考。方法体外培养人肺腺癌耐药细胞株A549/DDP至生长状态良好,分析顺铂及4-苯丁酸联合顺铂对A549/DDP细胞株增殖作用,酶联免疫吸附测定法分析细胞凋亡相关蛋白表达变化,Transwell实验分析细胞侵袭力变化,蛋白质印迹法和免疫细胞化学分析细胞中JAK/STAT信号通路蛋白表达变化。结果随着时间延长,各组对A549/DDP细胞株增殖抑制率呈上升趋势,且高剂量4-苯丁酸联合顺铂组对A549/DDP细胞株增殖抑制率较高,差异有统计学意义,F药物=110.342,P<0.001;F时间=34.527,P<0.001;F药物×时间=58.321,P<0.001。与对照组相比,低剂量4-苯丁酸联合顺铂组和高剂量4-苯丁酸联合顺铂组细胞凋亡蛋白Bcl-2水平降低,Bax、Caspase-3和Caspase-6水平升高,均P<0.001。对照组、顺铂组、低剂量4-苯丁酸联合顺铂组和高剂量4-苯丁酸联合顺铂组细胞侵袭力分别为423.3±35.6、389.3±24.7、375.6±35.2和285.6±23.9,F=44.458,P<0.001;蛋白质印迹法检测发现对照组、顺铂组、低剂量4-苯丁酸联合顺铂组和高剂量4-苯丁酸联合顺铂组JAK2水平分别为1.32±0.26、1.01±0.24、0.90±0.12和0.74±0.13,F=18.633,P<0.001;STAT2水平分别为0.78±0.13、0.70±0.15、0.62±0.09和0.54±0.09,F=18.996,P<0.001;STAT3水平分别为1.01±0.23、0.89±0.14、0.74±0.10和0.40±0.10,F=19.687,P<0.001。免疫细胞化学法检测发现对照组、顺铂组、低剂量4-苯丁酸联合顺铂组和高剂量4-苯丁酸联合顺铂组JAK2水平分别为0.85±0.14、0.78±0.11、0.62±0.17和0.52±0.09,F=21.854,P<0.001;STAT2水平分别为0.85±0.20、0.77±0.14、0.69±0.08和0.52±0.13,F=17.852,P<0.001;STAT3水平分别为0.63±0.14、0.57±0.11、0.50±0.09和0.42±0.08,F=29.754,P<0.001。结论4-苯丁酸调控对顺铂作用下人肺腺癌耐药细胞株A549/DDP细胞增殖、侵袭有明显抑制作用,且其作用可能与影响JAK/STAT信号通路蛋白表达有关。     

地塞米松对姑息性手术术后小鼠残存Lewis肺癌细胞复发的抑制作用

目的 研究地塞米松对姑息性手术术后小鼠残存Lewis肺癌细胞复发的抑制作用.方法 构建C57 BL小鼠Lewis肺癌姑息性手术切除术后模型,并采用随机数字表法将18只小鼠分为生理盐水组、地塞米松组、顺铂组,每组6只,术后第4～10天用游标卡尺(0.1 mm)测量每组小鼠皮下肿瘤结节.用石蜡免疫组织化学法检测3组小鼠术后残存Lewis肺癌细胞复发肿瘤组织中缺氧诱导因子-1α(HIF-1α)、平均微血管密度(MVD)染色情况.用实时荧光定量PCR和Western blotting检测3组小鼠术后复发肿瘤细胞中HIF-1α、血管内皮生长因子(VEGF)、增殖细胞核抗原(PCNA)基因和蛋白的表达.结果 肿瘤生长曲线显示,接受顺铂和地塞米松治疗的小鼠肿瘤体积分别为(200.34±20.94) mm3和(436.58±37.94) mm3,比生理盐水组(1 398.81±192.85) mm3明显减小,差异均有统计学意义(t=-1201.75,P＜0.001;t=-921.52,P＜0.001).石蜡免疫组织化学结果显示,地塞米松组和顺铂组HIF-1α表达(2.67 ±0.43,1.67 ±0.43)和MVD计数(17.01 ±3.24,9.89 ±2.25)都明显低于生理盐水组(4.21 ±0.35,29.75 ±5.64),差异均有统计学意义(t=-1.55,P＜0.001;t=-1.83,P＜0.001;t=-12.68,P＜0.001;t=-18.35,P＜0.001).实时定量PCR检测显示,HIF-1α(0.56±0.11)、VEGF(0.61±0.18)和PCNA(0.38±0.07) mRNA表达在地塞米松组较生理盐水组(1.21±0.13,1.13 ±0.26,1.06±0.08)明显减少,差异具有统计学意义(t=-0.55,P＜0.001;t=-0.62,P＜0.001;t=-0.69,P＜0.001);HIF-1α(0.31 ±0.12)、VEGF(0.30 ±0.13)和PCNA(0.18±0.06) mRNA表达在顺铂组较生理盐水组也明显减少,差异具有统计学意义(t=-0.73,P＜0.001;t=-0.76,P＜0.001;t=-0.81,P＜0.001).Western blotting结果显示,地塞米松组HIF-1α(85.98±20.86)、VEGF(173.28 ± 30.98)和PCNA蛋白(228.96±22.97)的表达较生理盐水组(198.98±29.89,378.98±28.98,357.98±35.98)明显减少,差异具有统计学意义(t=98.78,P＜0.001;t=85.68,P＜0.001;t=120.86,P＜0.001);顺铂组HIF-1α(65.78±18.62)、VEGF(109.43士19.86)和PCNA蛋白(176.86 ±22.76)的表达较生理盐水组明显减少,差异具有统计学意义(t=132.86,P＜0.001;t=108.68,P＜0.001;t=154.74,P＜0.001).结论 地塞米松对姑息性手术切除术后残存的Lewis肺癌细胞复发有明显抑制作用,有望为姑息性手术切除患者术后治疗提供一种新的辅助治疗方法.     

UBE2D3基因过表达对食管癌细胞迁移增殖及顺铂敏感性的影响

目的 构建过表达人泛素交联酶UBE2D3基因的稳定转染食管癌EC109细胞株,并观察过表达后迁移增殖能力及对顺铂化疗敏感性的改变.方法 食管癌EC109细胞株分别转染pEGFP-C1和pEGFP-UBE2D3质粒后,分为阴性对照组(NC组)和过表达组(OE组),并用G418进行筛选构建稳定转染细胞株.通过实时定量PCR(RT-PCR)法及Western blotting验证过表达效率,用划痕试验检测迁移能力,并用CCK-8法检测细胞增殖,半抑制浓度(IC50)法评价对顺铂的敏感性.结果 相对于亲本细胞,NC组UBE2D3 mRNA表达量为1.010±0.590,OE组为2.026±0.898;NC组UBE2D3蛋白表达量为0.923 ±0.237,OE组为1.520±0.487;NC组UBE2D3 mRNA及蛋白表达水平与空白对照组亲本细胞EC109相近(t=1.005,P＞0.05;t=1.492,P＞0.05),OE组较亲本细胞组表达高(t=6.682,P＜0.05;t=9.150,P＜0.05).在12 h NC组的迁移距离为(0.161±0.062) mm,OE组为(0.052±0.007) mm(=4.370,P＜0.05);在24 h NC组的迁移距离为(0.309 ±0.071) mm,OE组为(0.074 ±0.012) mm(=3.644,P＜0.05);在12 h和24 h时OE组相对于NC组的迁移率分别为0.236±0.051和0.241±0.037,OE组迁移能力明显较NC组降低;在第1天时OE组相对于NC组的增殖率为0.713±0.220(t=13.466,P＜0.05),第2天为0.848±0.241(t =27.241,P＜0.05),第3天为0.742 ±0.233(t=15.107,P＜0.05).使用顺铂处理后,在第1天时OE组的IC50值相对于NC组为0.356±0.154(t =4.326,P＜0.05),第2天为0.445±0.098(t =5.870,P＜0.05),第3天为0.481±0.096(=5.009,P＜0.05),OE组IC50值明显低于NC组;给予5μg/ml顺铂处理后,在第1、2、3天时OE和NC组相对于未使用顺铂处理时的增殖效率均减慢,其中OE组相对于NC组的增殖率分别为0.606±0.283(t=8.872,P＜0.05)、0.759±0.089(t=16.771,P＜0.05)和0.569±0.574(t =7.885,P＜0.05),然而在第1、2、3天时OE组的存活率相对于NC组分别为0.831 ±0.323(t=24.226,P＜0.05)、0.875±0.102(t=33.541,P＜0.05)和0.853±0.359(t=28.187,P＜0.05),顺铂对OE组抑制效率较NC组增加.结论 食管癌细胞EC109中过表达UBE2D3基因,能够抑制其迁移、增殖,增强其对顺铂的敏感性.     

沉默PGAM1基因对食管癌细胞生物学功能的影响

目的   探讨沉默磷酸甘油酸变位酶1（PGAM1）基因对食管癌细胞生物学功能的影响及可能机制。方法   收集2016年7月至2017年6月间在我院行手术切除的67例食管癌及对应癌旁正常组织,采用免疫组化SP法检测PGAM1表达并分析其表达与临床病理特征的关系。PGAM1 shRNA（shPGAM1组）或shRNA-NC（NC组）转染至食管癌Eca-109细胞,分析PGAM1基因沉默对Eca-109细胞凋亡和增殖的影响。采用实时荧光定量PCR（QPCR）和Western blotting法检测PGAM1对Akt／mTOR信号通路关键分子的影响。结果   食管癌组织中PGAM1高表达率为58.2％（39／67）,高于癌旁组织的31.3％（21／67）,差异有统计学意义（P＜0.05）。PGAM1表达与临床分期、分化程度、浸润深度有关（P＜0.05）,而与年龄、性别、淋巴结转移等无关（P＞0.05）。shPGAM1组和NC组中PGAM1 mRNA表达量分别为0.48±0.10和1.01±0.14,差异有统计学意义（P＜0.05）。MTT法检测结果 显示,培养24、48、72、96 h后,shPGAM1组Eca-109细胞增殖率分别为（87.65±7.42）％、（79.34±9.11）％、（70.17±6.84）％、（60.36±7.95）％,明显低于NC组,差异有统计学意义（P＜0.05）。48 h后shPGAM1组和NC组的Eca-109细胞凋亡率分别为（45.36±5.38）％和（24.81±4.67）％,差异有统计学意义（P＜0.05）;shPGAM1组和NC组Eca-109细胞培养上清的葡萄糖消耗量分别为（56.84±11.35）％和（99.87±10.48）％,shPGAM1组和NC组Eca-109细胞培养上清的乳酸含量分别为（48.02±10.18）％和（99.00±12.35）％,差异均有统计学意义（P＜0.05）。shPGAM1组细胞的PTEN表达量高于NC组（P＜0.05）,而p-Akt、p-mTOR表达量均低于NC组（P＜0.05）。结论   PGAM1高表达与食管癌的发生、发展有关,通过激活Akt／mTOR信号通路诱导的Warburg效应,促使肿瘤细胞增殖,抑制其凋亡。     

RNA干扰缺氧诱导因子1α对食管鳞癌和胃腺癌细胞生物学行为的影响

目的 探讨缺氧诱导因子1α(HIF-1α)对人食管痛及胃癌细胞体外增殖、迁移及血管生成拟态的影响.方法 将HIF-1α shRNA重组质粒pGCsi-shHIF-1 α稳定转染人食管鳞癌细胞Eca-109和胃腺癌细胞SGC-7901,采用Western blot方法检测常氧及缺氧情况下各组转染细胞HIF-1α的抑制效果,采用平板克隆形成实验和四甲基偶氮唑蓝(MTT)法检测转染细胞的增殖活性,采用Transwell小室检测转染细胞的迁移能力,采用三维培养方法观察Eca-109和SGC-7901细胞能否形成血管网状结构及转染细胞株的管腔形成能力.结果 常氧及缺氧情况下,各转染组细胞HIF-1α蛋白表达量均为0,与未转染组(Eca-109组分别为0.74±0.05和1.11±0.06,SGC-7901组分别为0.60±0.05和0.96±0.07)比较,表达均被显著抑制(均P＜0.01).与空载体组和未转染组相比,转染组细胞的增殖活性显著降低(均P＜0.05),体外迁移能力显著降低(均P＜0.01).Eca-109细胞株各组中,常氧情况下,Eca-109组和Eca-109/shRNA组形成管状结构数目分别为(30.8±3.9)个和(3.7±2.8)个,差异有统计学意义(P＜0.01);缺氧情况下,分别为(34.3±3.4)个和(3.9±2.7)个,差异有统计学意义(P＜0.01).缺氧情况下,Eca-109组形成管状结构数日较常氧时明显增加(P＜0.05).SGC-7901细胞株各组中,常氧情况下,SGC-7901组和SGC-7901/shRNA组形成管状结构数目分别为(26.2±3.4)个和(4.9±3.5)个,差异有统计学意义(P＜0.01);缺氧情况下,分别为(30.1±4.1)个和(5.3±3.6)个,差异有统计学意义(P＜0.01).缺氧情况下,SGC-7901组形成管状结构数日较常氧时明显增加(P＜0.05).结论 Eca-109细胞和SGC-7901细胞均能形成血管生成拟态管状结构.RNA于扰沉默HIF-1α能有效抑制Eca-109细胞和SGC-7901细胞增殖、迁移及体外血管生成拟态管状结构形成.

Abstract：

Objective To investigate the effect of hypoxia inducible factor-1α (HIF-1α) on the proliferation, migration and vasculogenic mimicry(VM ) in human esophageal squamous cell carcinoma cell line Eca-109 and gastric adenocarcinoma cell line SGC-7901 in vitro.Methods The recombinant plasmid pGCsi-shHIF-1α was transfected into Eca-109 and SGC-7901 cells by LipofectamineTM 2000.The inhibitory effect of HIF-1α was measured at protein level by Western blot under normoxia and hypoxia.The cell proliferation was detected by colony formation and MTT assays.The migration of transfected cells was assayed using Transwell chambers.Whether Eca-109 and SGC-7901 cells could form the capillary tube-like structures (TLSs) was observed by 3-dimensional culture, and the tube formation of transfected cells was detected by tube-like structure formation assay.Results The expression of HIF-1α protein in each group of transfected cells was significantly suppressed under normoxia and hypoxia ( Eca-109: 0.00, 0.74 ± 0.05;0.00, 1.11±0.06; SGC-7901: 0.00, 0.60 ±0.05; 0.00, 0.96 ±0.07, P＜0.01).Colony formation and MTT assays showed that the cell proliferation of the pGCsi-shHIF-1α transfected cells was slower than that of the control groups (104.7±9.6, 151.7±4.5; 88.3±5.1, 128.3±6.7, P＜0.05).The migration of the recombinant plasmid-transfected cells was significantly suppressed compared with that of cells transfected with empty vector (55.5 ± 11.2, 121.9 ± 17.3; 64.7 ± 10.8, 132.3 ± 16.0, P ＜ 0.01 ).Both the Eca-109 and SGC-7901 cells could form TLSs when cultured on matrigel, and the number of tubules was significantly increased under hypoxia (30.8 ± 3.9, 34.3 ± 3.4;26.2±3.4,30.1±4.1,P＜0.05),the tubule-forming ability of transfected groups was significantly inhibited under normoxia and hypoxia ( Eca109: 3.7±2.8, 30.8±3.9; 3.9 ±2.7, 34.3 ±3.4; SGC-7901: 4.9 ±3.5, 26.2 ±3.4; 5.3 ±3.6,30.1 ±4.1, P＜0.01 ).Conclusions Both the esophageal squamous cell carcinoma cell line Eca-109 and gastric adenocarcinoma cell line SGC-7901 are capable of forming vasculogenic mimicry structures in vitro.The recombinant plasmid pGCsi-shHIF-1α can efficiently suppress their proliferation, migration and vasculogenic mimicry formation.     

食管鳞癌细胞外泌体中miR-130a对血管新生的作用及其机制

目的 探讨食管鳞癌细胞外泌体中的miR-130a对血管新生的作用及其机制.方法 提取食管上皮细胞HEEC、食管鳞癌细胞TE-13和Eca-109所分泌的外泌体及转染miR-130a mimic、miR-130a inhibitor及其阴性对照(NC)后的Eca-109细胞外泌体,并与人脐静脉血管内皮细胞HUVEC共孵育...     

siRNA干扰EGFR表达对食管鳞癌和腺癌细胞放射敏感性影响

目的 探讨siRNA干扰EGFR表达对食管鳞癌和腺癌放射敏感性的影响。方法 以食管鳞癌、腺癌细胞系ECa-109、OE-19作为研究对象。脂质体转染化学合成的不同EGFR-siRNA和阴性-siRNA,通过RT-PCR及蛋白印迹法检测转染前后EGFR表达情况,CCK8法分析转染对细胞增殖活性影响。设ECa-109、OE-19细胞空白对照组(O1、O2组)、单纯照射组(R1、R2组)及EGFR-siRNA照射组(E-R1、E-R2组),单次照射0、2、4、6、8 Gy。克隆形成实验计算细胞存活分数及放射增敏比(SER_D0值比),流式细胞仪检测EGFR-siRNA联合放射对细胞周期分布和细胞凋亡率影响,单次照射6 Gy。结果 EGFR-siRNA可明显下调两种细胞EGFR表达,且转染对细胞增殖抑制率<5%(4.9%、4.5%)。克隆形成实验结果显示E-R1、E-R2组细胞SF值低于O1、O2组,SER_D0值比分别为1.40、1.01。流式细胞术结果显示E-R1组比E-R2组照后G₂+M期比例增加、S期比例下降(P=0.016、0.028),细胞凋亡率也增高(P=0.007)。结论 与食管腺癌细胞相比,干扰EGFR表达显著提高了食管鳞癌细胞的放射敏感性。     

吉非替尼联合紫杉醇对食管癌细胞体内外生长抑制实验研究

目的：探讨吉非替尼联合紫杉醇对人食管癌细胞株Eta-109在体内外生长的影响及其可能机制。方法：按两因素析因设计试验,并应用MTT法观察单用吉非替尼、紫杉醇及联合应用对Eca-109细胞增殖的抑制作用,流式细胞术检测细胞周期和凋亡。按单因素影响设计,建立裸鼠人食管癌皮下移植瘤模型,并分为4组各10只,分别为对照组、紫杉醇组、吉非替尼组及吉非替尼＋紫杉醇联合组。经过不同处理4周后,切除瘤灶,称瘤质量,计算抑瘤率。结果：MTT法结果显示,药物干预72h后,各用药组与对照组比较,吸光度A值均减小,吉非替尼作用72h的半数抑制浓度为（1．72±0．27）μmol／L,紫杉醇的半数抑制浓度为（5．27±0．88）μmol／L。流式细胞术检测结果显示,4组G0／G1、S和G2／M期细胞比较差异均有统计学意义,P〈0．05;对照组Eca-109细胞的凋亡率为（9．69±1．42）％,紫杉醇组为（12．41±2．75）％,吉非替尼组为（22．0±4．26）％,吉非替尼＋紫杉醇联合组为（33．1±3．78）％,差异有统计学意义,P〈0．001。对照组肿瘤体积为（1．56±0．16）cm3,紫杉醇组为（0．81±0．15）cm3,吉非替尼组为（1．35±0．08）cm3,紫杉醇＋吉非替尼联合组为（O．54±0．11）cm3,差异有统计学意义,P＜0．05。结论：吉非替尼与紫杉醇合用对体内外食管癌Eta-109细胞具有显著的抑制作用,且强于药物单一作用。     

食管癌细胞株高侵袭力亚系的建立及其生物学特性研究

目的:建立具有不同转移潜能的高侵袭能力食管癌细胞株亚系并研究其生物特性.方法:利用Transwell侵袭小室从人食管鳞癌Eca-109细胞株筛选高侵袭能力食管癌亚系,HE染色比较细胞形态;四甲基偶氯唑蓝(MTT)法检测细胞增殖能力的变化;流式细胞术( FCM)检测细胞周期;蛋白质印迹法检测与侵袭能力相关基质金属蛋白酶-2(MMP-2)和金属蛋白醇组织抑制因子-2(TIMP-2)蛋白表达.结果:利用Transwell侵袭小室从食管癌Eca-109细胞株中筛选出高侵袭能力食管癌细胞株亚系,命名为Eca-109 T4.2个细胞系细胞形态没有明显差异.MTT法检测显示,亚系Eca-109 T4增殖能力强.细胞周期显示,增殖指数(PI)高,PI=41.0％,且MMP-2蛋白表达相比增高,P=0.023;TIMP-2蛋白表达相比增高,但差异无统计学意义,P=0.392.结论:建立了不同转移潜能的高侵袭能力食管癌细胞株亚系,将可以用于探讨食管癌转移机制的研究.